1、類型：正常細胞培養腫瘤細胞培養第1頁/共69頁第一節 正常細胞培養 正常細胞，在體外培養時都不易生長，建立細胞系更難。 正常細胞難培養的原因是它們是分化的細胞，對體外生存條件要求嚴格. 但只要一切條件適當仍有培養成功可能。第2頁/共69頁一、上皮細胞類培養 上皮細胞可來源于外、內、中三個胚層； 培養中只有源于外和內胚層的細胞能反映出上皮細胞的特征，細胞呈膜狀生長的特點。第3頁/共69頁 上皮細胞培養有三個難點：需求特殊底物，如在底物上涂有膠原底層則利于細胞生長；需求特殊培養基；與上皮細胞相鄰的成纖維細胞常與上皮細胞同時混雜生長，并常壓過上皮細胞。 純化和延長上皮細胞生存期是上皮細胞培養的關鍵之

2、一。第4頁/共69頁(一)表皮細胞培養1特點： 在有膠原的底物上易生長； 把人或小鼠表皮細胞培養在以3T3 細胞為飼養層(用射線照射后)上時，細胞易生長并可發生一定程度的分化現象。 降低pH、Ca2+的含量和溫度等，均利于表皮細胞生長。 向培養基中加氫化可的松(10 g/m1)、10-6M的異丙基腎上腺素(Isoproterenol) 和10 ng/m1 促表皮生長因子(EGF) 能促表皮細胞生長。第5頁/共69頁【飼細胞】飼細胞(Feeder Cells)也稱滋養細胞，是一層經過射線照射或絲裂霉素傷害處理的、用作克隆細胞附著底物的細胞層。飼細胞作用： 有同化營養液的能力。 飼細胞能促克隆細胞

3、的生長，利于克隆的形成。克隆形成后飼細胞漸死亡，換液時清除。第6頁/共69頁飼細胞的制備：(1)取原代培養的人或動物胚胎成纖維細胞，90% 匯合時制成細胞懸液，再按103 細胞/毫升重新接種培養；(2)在細胞半匯合時，準備的絲裂霉素，按2ug/105 細胞的量加入到培養瓶中過夜；或用射線單次照射，劑量3050 戈瑞(Gy)；(3)細胞經上述處理后，Hanks 液漂洗兩次、更換培養液、再培養24 小時，胰蛋白酶消化細胞制成懸液，按5104/ml接種入新培養基中；(4)48 小時后，即可用于細胞克隆之用。第7頁/共69頁2表皮細胞培養程序：(1) 取材：取外科植皮或手術殘余皮膚小塊，以角化層薄者為

4、佳，早產流產兒皮膚更好，切成0.5 1cm2小塊；(2) EDTA 處理：先置入 EDTA 中室溫置5 分鐘。(3) 冷消化：換入0.25% 胰蛋白酶中，置4過夜；(4) 分離：取出皮塊，用血管鉗或鑷子把表皮與真皮層分開；第8頁/共69頁(5) 溫消化：取出表皮單獨處理；用剪刀剪成更小的塊后，置入新的胰蛋白酶中，37再消化30 60 分鐘；(6)制細胞懸液：用吸管輕輕反復吹打，使成細胞懸液；(7) 加培養液：通過80 目不銹鋼紗網濾過后，低速離心，吸上清，直接加入Eagle 液和20小牛血清.(8)培養：接種入碟皿中，CO2 溫箱培養。第9頁/共69頁 注意事項：冷消化目的在于使表皮和真皮結合

5、松散；如冷消化后分離下來的表皮膜自身也已松散，此時亦可直接置入PBS 中用吸管吹打制備細胞懸液；不再經過第二次消化。第10頁/共69頁(二) 胃上皮細胞培養 適于胃上皮細胞生長的條件是：膠原酶和透明質酸酶消化法并用消化細胞；應用膠原底物培養；制備含有特定成分的培養基；第11頁/共69頁 培養程序：(1) 取材：取胃潰瘍或胃癌手術切除胃標本遠端非病變區粘膜少許；(2) 清洗：用含慶大霉素(400g/m1)和兩性霉素(2g/m1 的Hanks)液漂洗后，用鈍器剝離下粘膜，剪成1mm大小；(3) 消化：在I 型膠原酶和透明質酸酶中，于37中消化80 分鐘；(4) 離心：收集細胞懸液，800 轉/分離

6、心后，Hanks 液漂洗兩次；第12頁/共69頁(5) 接種：末次離心后加入含有1 2胎牛血清的完全培養基，接種入不同孔數的培養板中；接種量依不同實驗目的而定。 細胞接種后一般在16 小時內貼壁，細胞呈多角形，成島狀或片狀生長，以后逐漸聯接成片。初代培養可維持2 3 周，第一周末達高峰，最后逐漸衰退剝落。第13頁/共69頁(三) 肝細胞培養 肝臟具有取材方便和易于生長的優點，能獲得典型上皮細胞培養。1初代組織塊培養： 肝組織做組織塊培養效果很好。取新鮮肝臟，先剝除被膜和血管等纖維成分，用刀或剪刀把肝剪成1mm3 左右的小塊，采用貼壁培養法。肝組織易于貼壁，生長力好，一般次日即可出現生長暈。第1

7、4頁/共69頁2初代消化法培養：(1) 把肝組織切成2 4 立方毫米的小塊，用不合鈣鎂的BSS 液洗兩次；(2) 移入1:1 的胰蛋白酶和膠原酶(都用無鈣鎂BSS 配制) 中，4冷消化10 12 小時后，通過250 微米和64 微米尼龍網或不銹鋼紗網濾過(用紗布濾過亦可)；(3) 收集細胞、BSS 液洗1 2 次、計數、接種培養；第15頁/共69頁3肝臟灌流法： 需用全肝，以較小動物如小鼠和大鼠為好。(1) 無菌解剖動物，取出肝臟，先用BSS 洗除血污；(2) 取5ml 注射器一支，吸取消化液后，把注射器頭輕輕插入肝管中，用線繩結扎牢固，以防消化液漏出，輕輕把消化液注入膽管系統，并不時輕柔壓肝

8、臟，以便消化液進入肝小葉中； 消化液在肝內停留20 30 分后，在吸出消化液的同時并輕柔壓肝臟，以使肝細胞脫落和消化液吸出；第16頁/共69頁(3) 待吸凈消化液后，注入離心管中，低速離心分離，用RPMI 1640 培養基培養(較其它培養基為好)，能獲得較純的肝上皮細胞和獲較好的效果。第17頁/共69頁(四) 內皮細胞培養 應用材料：人臍帶臍靜脈、動物大動脈等，用灌流消化法獲取細胞最為簡便。第18頁/共69頁v(1)取產后的新鮮臍帶；如不立即培養可保存于4中，但不宜超過12 小時；無菌剪取長10 15 厘米一段。v 其它如胚胎和幼體動物的大血管，亦可用于培養；(2) 先用三通注射器吸溫PBS

9、液注入臍帶的臍靜脈中，洗除殘血；注入口處宜用線繩結扎，以防液體返流；第19頁/共69頁(3) 用血管鉗夾緊臍帶一端，從另端向臍靜脈中徐徐注入最終濃度為的膠原酶，待末端出現液體后結扎之，令充滿血管，注入口亦應結扎，以防液體返流，消化3 10 分鐘；(4) 吸出含有內皮細胞的消化液，注入離心管中；為獲取更多細胞，可再注入溫PBS 沖洗2 3 次徹底清除干凈殘余細胞，一并注入離心管中離心；(5) 吸除上清，加1640 培養液，制成細胞懸液，接種入瓶皿中培養，順利時2 3 天內細胞即可長成單層。第20頁/共69頁第21頁/共69頁 人臍帶易于獲得，培養效果好；細胞生長后，一般傳6 7 代后即衰退，難以

10、長期維持。用兔血管內皮細胞培養較好，可傳10 30 代； 不同部位血管內皮細胞生物學性狀不同，對各種作用因素反應亦有很大差別。第22頁/共69頁(五) 毛細血管內皮細胞培養 毛細血管細小，結構簡單，內皮細胞外有較多的結締組織，進行分離培養有很大困難。 近年毛細血管培養已獲成功； 利用人的小兒包皮、人脾臟、牛腎上腺、癌組織(如卵巢癌) 等均可；第23頁/共69頁1材料： 腫瘤條件培養基制備(1) 取C3H 小鼠的S-180 實體肉瘤組織；(2) 胰蛋白酶消化，Dulbecco 改良Eagle 氏培養液15m1 (含10小牛血清) 種到培養瓶中培養；第24頁/共69頁(3) 在細胞生長接近完全匯合

11、時，收集培養液制成條件培養基；再用含10小牛血清的新培養液后，也每隔兩天收集一次，可獲多量條件培養基；(4) 4000 轉分離心后，再通過0.22m 微孔濾膜濾過，-20凍存備用(臨用前融解)。 凝膠底層制備(1) 取60 mm Falcon 產培養皿，加1% Difco 產明膠(用不合鈣和鎂的Hanks 液配制)，鋪蓋瓶底，形成薄層；(2) 置4過夜；用前再用少許培養液沖洗一次。第25頁/共69頁2初代培養(1) 取材：取新鮮牛腎上腺數個，先用Hanks 液洗除血污；(2) 消化：剝除被膜，分離出皮質，切成l mm3 小塊，加膠原酶室溫中消化1 小時；每隔10 分鐘用吸管吹打懸液令消化充分；

12、(3)過濾：通過不銹鋼紗網濾過，網眼要求只允許能通過小于110 微米長的毛細血管小段；(4)離心：650 rpm，4，離心7 分鐘后，棄掉上清膠原酶；第26頁/共69頁(5)再離心：沉淀物用培養液重懸并離心，再重懸，再離心，共兩次；(6) 制細胞懸液：末次沉淀物仍用含10小牛血清的Dulbecco 改良Eag1e 氏培養液重懸后，稍吹打；(7)接種：接種入鋪有明膠底層的培養皿中，37培養；在培養頭1 3 小時中，毛細血管小段和內皮細胞最先貼附于底物上，而腎上腺細胞和成纖維細胞卻仍在培養液中漂浮；(8)換液：吸除培養液，再加入腫瘤條件培養液；每兩天換液一次。毛細血管小段一般成自1 4 個內皮細胞

13、， 以后每個小段在底物上慢慢展成特殊形態的細胞島，能持續2 5 天。第27頁/共69頁3毛細血管內皮細胞分離培養：(1) 初代培養2 3 天后，鏡下確認幾個毛細血管內皮細胞島，在培養皿背面，用不脫色筆劃圈圈起；(2) 鏡下檢查，如圈內殘有非內皮細胞時，可用顯微細針在倒置顯微鏡下挑除；用細胞解剖器也可，宜在凈化臺無菌氣流中、打開培養皿蓋進行，但時間不宜過長(15 20 分鐘)；圈外非內皮細胞可用無菌膠刮刮除；第28頁/共69頁(3) 用培養液漂洗兩次，以去除漂浮細胞；(4) 剩余內皮細胞島如小(5 20 個細胞) 而少時，生長增殖常變得緩慢或完全不生長，此時需加入3T3等飼細胞；飼細胞接種量為4

14、000 細胞cm2；(5) 當內皮細胞充滿所有飼細胞空間后，用胰蛋白酶消化、離心、加入腫瘤條件培養基；(6) 接種入明膠底物皿中繼續培養(飼細胞死亡被淘汰)，細胞增殖生長匯合后，按1:5 傳代。第29頁/共69頁第30頁/共69頁二、結締組織類細胞培養(一) 成纖維細胞培養 包括人在內的各種成纖維細胞都很容易培養，也是其它組織培養時的副產物，極易獲得。 用人或動物胚體為好；動物可用小鼠或雞胚，去頭和內臟，剪成小碎塊后，用胰蛋白酶消化法培養；如為人胚，可取皮膚培養。幼兒包皮是培養成纖維細胞的很好對象。第31頁/共69頁小鼠成纖維細胞培養條件 胎齡的小鼠胎兒分離效果最好； 最佳培養基為DMEM添加

15、15%小牛血清； 第3代細胞增殖最旺盛； 室溫條件下，0.125%胰蛋白酶消化時間以810min為宜。 在培養ES細胞時，應選擇第35代的小鼠成纖維細胞作為飼養層細胞。第32頁/共69頁小鼠成纖維細胞；細胞來源：swiss小鼠胚胎 第33頁/共69頁第34頁/共69頁(二) 巨噬細胞培養 巨噬細胞屬免疫細胞，有多種功能，是研究細胞吞噬、細胞免疫和分子免疫學的重要對象。 巨噬細胞容易獲得，便于培養，并可進行純化。但屬不繁殖型細胞群，難以長期生存，好的條件下僅能生活2 3周，因之多用作初代培養。 巨噬細胞也能建成無限細胞系；大多來自小鼠，如P388D-1、J774A1、RAW309、Cr. 1 等

16、。第35頁/共69頁1培養技術要點： 來源和取材 巨噬細胞可來源于人胸水、腹水、血和透析液等材料。 實驗多從動物血液、肺、脾和胸腹腔獲取，其中以從動物腹腔取材最常用。用40g 的PHA 注入腹腔中，能產生6 8106 個細胞，而且無刺激性，效果較好。第36頁/共69頁2培養方法： 培養巨噬細胞可用各種方法和各種來源獲取細胞，其中以小鼠腹腔取材法最為實用。人的材料除來源不同外，培養方法大同小異。 程序(1) 實驗前三天，向每只小鼠腹腔內注入無菌硫基乙酸肉湯1ml (勿注入腸內)；(2) 引頸殺死動物；手提鼠尾將全鼠浸入70酒精中3 5 秒；(3) 置動物于解剖臺上，用針頭固定四肢，雙手持鑷撕開皮

17、膚拉向兩側，暴露出腹膜，但勿傷及腹膜壁；(4) 再用70酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸10ml Eag1e 液注入腹腔中，同時從兩側用手指揉壓腹膜壁，令液體在腹腔內充分流動；第37頁/共69頁(5) 用針頭輕輕挑起腹壁，使動物體微傾向一側，使腹腔中液體集于針頭下吸取入針管內；(6) 小心拔出針頭，把液體注入離心管中， (4)離心10 分鐘后，去上清，加10 ml Eagle 培養基；(7) 計數細胞，每只小鼠可產生20 30106 細胞，其中90為巨噬細胞；(8) 為獲取3105 個貼附細胞平方厘米，需接種2.5106m1；(9) 為純化培養細胞，去除其它白細胞，接種數小時后，去除培養液，用Ea

18、gle 液沖洗1 2 次后，再加新Eagle 培養液置37 CO2 溫箱中培養。第38頁/共69頁第39頁/共69頁三、肌組織細胞培養 以心肌和骨骼肌培養較為實用。(一) 骨骼肌細胞培養 動物胚或幼體的大腿肌組織為最好的培養材料。取材常用生后1 2 天的乳鼠(Wistar 大鼠更好)。(1) 取材：殺死動物，無菌取大腿肌組織，切成0.3 0.5 厘米小塊；(2)消化：用不含鈣鎂離子的Hanks 液配的胰蛋白酶消化，無菌紗網或紗布濾過，合成培養基加10小牛(或馬)血清培養，為促進分化可加1 的胎汁；第40頁/共69頁(3)接種：細胞接種量為2106/皿；接種在膠原或明膠的底物上能促進細胞分化。

19、明膠制備比較簡單，常用Hanks 液配的明膠。 生長特點：細胞生長開始呈紡錘形，培養50 52 小時后將出現融合形成肌細胞狀多核纖維。數日后融合停止，此時能觀察到橫紋。一般在融合后二三天內能見到收縮現象；因收縮運動有時可導致細胞從底物脫離。第41頁/共69頁(二) 心肌細胞培養 最常用材料： 雞胚心肌、小鼠、大鼠以及人胎兒心肌等都可應用。 心肌是比較容易培養和生長的組織，可應用多種方法進行培養，如懸滴培養、組織塊培養和消化培養法等，主要取心室肌培養，均能獲得良好的生長效果。第42頁/共69頁 程序(1) 選新鮮受精雞卵，置溫箱中孵育(溫箱中放有水槽，以維持箱內濕度)；每日翻動一次(180 度)

20、，孵育9 12 天；(2) 取雞胎；(3) 用眼科剪剪開胸腔，剝出心臟，置入皿中用Hanks 液漂洗1 2 次；(4) 小心剪除大的動靜脈，保留心室肌；用組織塊或消化培養法均可。初代培養的雞胚心肌呈紡錘形， 純化及生長特點：常雜有成纖維細胞和內皮細胞；心肌細胞亦較其它成分貼壁慢，可反復貼壁法排除其它細胞成分。在培養成功時，相差顯微鏡下可觀察到橫紋；一周后便可出現節律性收縮現象。第43頁/共69頁乳鼠心肌細胞原代培養第44頁/共69頁第45頁/共69頁四、神經組織細胞培養 神經組織主要由兩種神經細胞(神經元和神經膠質細胞）組成。 神經元為高度分化的細胞，在組織發生晚期已失掉增殖能力，對生存條件要

21、求高，只有在適宜情況下，如接種在膠原底層上，或在加入神經生長因子(NGF) 和膠質細胞因子時，才能生存，并可能出現一定程度的分化現象，如長出突起等，但卻難使之增殖；即使培養胚胎組織情況也是如此。第46頁/共69頁 神經膠質細胞為較易培養成分，它分少突、星形和小膠質三種。神經膠質細胞與神經元有共存關系。第47頁/共69頁人腦膠質瘤細胞第48頁/共69頁大鼠c6膠質細胞第49頁/共69頁第50頁/共69頁 (一) 初代培養 神經元能發生一定分化現象，如生長突起，但因無增殖能力，最后衰退死亡；但神經膠質尤以星形細胞能繼續生存和分裂增殖。 (二) 傳代培養 神經膠質細胞是神經組織中比較容易培養的成分。

22、不僅能獲得生長的膠質細胞并可形成能傳代的二倍體細胞系。第51頁/共69頁(三) 培養方法 人腦組織可用于神經膠質細胞培養，培養組織來自手術室無菌取腦髓灰質或白質均可用于培養，1程序：(1) 細胞懸液制備：獲取腦組織后，先仔細剝除腦膜和血管等纖維成分，置入Hanks 液中漂洗1 2 次后，置于30 50倍的Hanks 液中；腦組織比較柔軟，反復吹打即可制備成細胞懸液；(2) 排除脂肪成分和其它碎塊：把懸液注入離心管中，在室溫直立5 10 分鐘后，細胞或細胞團塊自然下沉，脂肪等雜物易漂浮于懸液表層，吸除上清，如此反復二三次可獲較多的細胞成分；第52頁/共69頁(3)濾過、計數、接種：向末次沉降物中

23、加入適量營養液，通過紗網或紗布濾過，計數細胞并調整好細胞密度，接種入培養瓶或皿中，置5C02 溫箱中培養；(4)傳代：細胞生長匯合后，可用胰蛋白酶消化法做傳代處理。第53頁/共69頁2生長特點： 接種后初期，細胞可能出現飄浮不貼壁現象，貼壁后在短期內也可能不見細胞分裂現象；細胞適應環境過程較長，然而一旦生長后，即能進入較旺盛的增殖狀態。 生長開始常雜有巨噬細胞、成纖維細胞和上皮細胞等，傳二、三代后，這些成分即消失，逐漸形成均一的星形膠質細胞，一般形成連接不甚緊密的單層細胞第54頁/共69頁第二節 腫瘤細胞培養 腫瘤細胞在組織培養中占有核心的位置，首先癌細胞是比較容易培養的細胞，當前建立的細胞系

24、中癌細胞系是最多的。 腫瘤細胞培養是研究癌變機理、抗癌藥檢測、癌分子生物學極其重要的手段。第55頁/共69頁培養方法 腫瘤細胞培養成功關鍵在于：取材、成纖維細胞的排除、選用適宜的培養液和培養底物等幾個方面。 初代培養應用組織塊和消化培養法均可。一、要點1取材： 人腫瘤細胞來自外科手術或活檢瘤組織。取材時盡量避免用退變組織，要挑選活力較好的部位。癌性轉移淋巴結或胸腹水是好的培養材料。第56頁/共69頁2培養基： 腫瘤細胞對培養基的要求不如正常細胞嚴格，一般常用的RPMI l640、DMEM、Mc-Coy5A 等培養基等皆可用于腫瘤細胞培養。腫瘤細胞對血清的需求比正常細胞低，正常細胞培養不加血清不

25、能生長，腫瘤細胞在低血清培養基中也能生長。腫瘤細胞對培養環境適應性較大。 培養腫瘤細胞仍需加血清和相關生長因子培養更易成功。第57頁/共69頁3成纖維細胞的排除： 成纖維細胞常與腫瘤細胞同時混雜生長，致難以純化腫瘤細胞。而且成纖維細胞常比腫瘤細胞生長得快，最終能壓制腫瘤細胞的生長。因此排除成纖維細胞成為腫瘤細胞培養中的關鍵。第58頁/共69頁成纖維細胞排除法1機械刮除法： 是用不銹鋼絲末端插有橡膠刮頭(用膠塞剪成三角形插以不銹鋼絲)，或裹少許脫脂棉制成，裝入試管中高壓滅菌后備用(也可用特制電熱燒灼器刮除)。刮除程序為：(1) 標記：鏡下觀察，用不脫色筆在培養瓶皿的背面圈下生長腫瘤細胞的部位；(

26、2) 刮除：棄掉培養液，把無菌膠刮伸入瓶皿中，肉眼或顯微鏡窺視下，刮除無標記空間；(3) 用Hanks 液沖洗一兩次，洗除被刮掉的細胞；(5) 注入培養液繼續培養，如發現仍有成纖維細胞殘留，可重復刮除至完全除掉為止。第59頁/共69頁2反復貼壁法： 根據腫瘤細胞比成纖維細胞貼壁速度慢的特點，并結合使用不加血清的營養液， (1) 細胞生長達一定數量后，倒出舊培養液，用胰酶消化后，Hanks 沖洗2 次，加入不含血清的培養液，吹打制成細胞懸液；(2) 編號為A、B、C 三個培養瓶；首先把懸液接種入A 培養瓶中，置溫箱中靜止培養520 分鐘后，輕輕傾斜培養瓶，讓液體集中瓶角后慢慢吸出全部培養液，再接種入B 培養瓶中后；向A 瓶中補充少許完全培養液置溫箱中繼續培養；(3) B瓶中細胞520 分鐘后，按處理A 的方法，把培養液注入C 培養瓶中；再向B 瓶中補加完全培養基。第60頁/共69頁 當三個瓶內都含有培養液后，均在溫箱中繼續培養。如操作成功，次日觀察可見A 瓶主要為成纖維細胞，B 瓶兩類細胞相雜，C 瓶可能主要為癌細胞。必要時可反復處理多次，直至癌細胞純化為止。第61頁/共69頁3消化排除法：(1