1、菌種管理制度1、目的 建立菌種保存、傳代、使用、銷毀標準操作規程，規范微生物學檢定用菌種的管 理，最大限度降低變異率，確保菌種的溯源性與穩定性，從而確保微生物學檢驗結果的準 確可靠。2、適用范圍 本規程適用于檢定用菌種的管理，包括菌種的購買、保存、傳代、使用及銷 毀等。3、定義? 標準菌株是指由中國藥品生物制品檢定所醫學微生物菌種保藏管理中心提供的冷凍干 燥菌。? 傳代用菌種是指用標準菌株制備的采用特定保存方法長期固定保存的菌種， 用于傳代及 制備工作用菌種。? 工作用菌種是指用標準菌株或傳代用菌種接種至普通瓊脂斜面培養后， 作為日常工作使 用的菌種。? 菌種的代是指將其接種至一新鮮培養基上或

2、培養基內， 每萌發一次即稱為一代， 從菌種 保藏中心獲得的冷凍干燥菌種為第 0 代。4、職責4.1 部門主管負責菌種的申購、接收、保存分發。4.2 微生物檢驗員負責菌種的確認、傳代、使用及銷毀。5、規程5.1 菌種的申購 部門主管根據菌種的使用情況，提出年度購買計劃（包括臨時檢驗需要） ，填寫申購流 程，經審批后，向中檢所菌種保藏中心或省（市）藥檢所購買凍干菌種（標準菌株）或傳 代用菌種，購買時，需確定菌種的代數，以便控制傳代代數。5.2 菌種的接收 菌種到達實驗室后， 由部門主管接收菌種， 檢查其名稱和數量， 以及每一支的完整性， 同時將菌種的所有信息，填寫在標準菌株庫存記錄上，內容包括：名

3、稱、數量、編號 （無編號者按檢定菌種的編號原則編號） 、代數、來源、接收日期、接收人等，并將其暫貯 存于48 C冰箱中，在一周內必須完成轉種。5.3 菌種的保存5.3.1 工作用菌種的保存 工作用菌種采用斜面低溫保存法。 將菌種接種在適宜的瓊脂斜面培養基上， 待菌生長充分以后，轉移至48C冰箱中保存。此法僅用于工作用菌種的短期保存，并應隨時檢查其 污染雜菌和變異等情況，發現異常情況，經應滅活處理后銷毀。保存時間根據菌種種類而 不同，細菌：每個月轉種一次；酵母菌及芽胞： 36 個月轉種一次；絲狀真菌每年轉種一 次。532傳代用菌種的保存采用甘油冷凍管保藏法或液體石蠟保存法。甘油冷凍管保存法用無菌

4、接種環輕輕刮取經冷凍復溶增菌后并接種至平板或瓊脂斜面的菌苔，并通過接種環與試管壁之間的輕輕摩擦而使細菌充分擴散到預先裝入試管中的無菌純化水中，調整菌 液濃度，使其等同于10號比濁管，向已制備好的菌懸液中加入等體積的無菌甘油(濃度 20%),即為10%甘油菌懸液，輕輕振搖，使內容物充分混合，分裝于無菌小試管，在-30C冷凍條件下保存。此甘油冷凍管為第 2代(G2)。可以每隔2年轉種一代。使用時，取出一 支放至室溫，轉種增菌培養或接種至瓊脂斜面復蘇，挑取純菌落傳代或工作用。此種方法 主要適用于需氧細菌和酵母菌的保藏(如大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門 菌)。5.322液體石蠟保存法無菌液

5、體石蠟的制備：選用優質化學純液體石蠟，將液體石蠟分裝加塞，用牛 皮紙包好，在121C滅菌30分鐘，置40C恒溫箱中蒸發水分，經無菌檢查后備用。液體石蠟管的制備：將菌種穿刺接種于半固體高層培養基中，在適宜條件下培養結束后，在層流臺下用無菌吸管吸取上述無菌液體石蠟至培養好的菌種管內，并使石蠟 高出菌種表面約1cm使菌體與空氣隔絕，并將試管直立，置于-20C冷凍或28C冰箱中 保存。此法主要適用于霉菌、厭氧菌、放線菌、芽抱桿菌的保存(如枯草芽抱桿菌、白色 念珠菌、黑曲霉菌等)。各菌種的保存方法、條件及期限，見下表1表1傳代用菌種保存方法、保存溫度、保存期限菌種名稱保存方法保存溫度保存期限大腸埃希菌C

6、MCC(B)44102甘油冷凍管-30C2年金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003銅綠假單胞菌(CMCC B) 10104)枯草芽抱桿菌CMCC(B)63501乙型副傷寒沙門菌CMCC(B)50094白色念珠菌CMCC(F)98001液體石蠟管2-8C1年黑曲霉菌CMCC(F)980035.4菌種的處理和保藏標準菌株的復蘇、確認、傳代標準菌株的復蘇物品及試劑：接種針、酒精燈、移液管、75%酒精及75%酒精棉球。培養基?改良馬丁瓊脂培養基：用于黑曲霉復蘇、復壯；? 液體硫乙醇酸鹽培養基：用于生孢梭菌復蘇、復壯；? 營養肉湯培養基：用于金黃色葡萄球菌、 枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門 菌

7、、短小芽孢桿菌、銅綠假單胞菌復蘇、復壯；? 改良馬丁培養基：用于白色念珠菌復蘇、復壯標準菌株的復蘇操作步驟： 以下操作均在生物安全柜內進行。a）在安瓿的外表面用 75%的酒精擦拭并讓其自然風干。b）用一小砂輪在安瓿的上部劃一條線， 用手輕輕將安瓿掰開 （開啟安瓿時必須小心， 因為 安瓿遇熱時可能會破裂） 。c）以無菌方法用一無菌吸管從已準備好的上述液體培養基中移取0.50.8 ml到安瓿中。d）輕輕地旋轉安瓿以使凍干菌種和液體培養基充分混合并完全溶解。e）用無菌吸管將安瓿內菌液全部轉接到相應的液體培養基。f）根據安瓿上所標明的不同菌種類型而將其培養于相應的溫度（細菌培養溫度3035C,培養18

8、24小時；真菌培養溫度2328C,培養35天。觀察是否渾濁，渾濁說明 菌種復蘇生長； 若不渾濁, 細菌應延長培養時間至 7 天,真菌應延長培養時間至 14 天, 若仍未渾濁,滅菌處理。g）若黑曲霉為菌懸液,則先放置室溫待菌懸液融化后用無菌吸管吸取管內液體 12滴滴 在改良馬丁瓊脂斜面上，用吸管涂布均勻，置 2328C培養57天，斜面正面為黑褐 色厚絨狀,色澤均一,不應有雜色,斜面側面無色,接近菌層培養基略帶黃色。確認后 用含有0.05% （ ml/ml）的吐溫-80的0.9%無菌氯化鈉溶液洗脫到無菌試管中。h）取經復蘇后的上述細菌菌液8-10ml至液體培養基中按f）項操作對菌種進行復壯。以無

9、菌技術向復壯后的菌種中加入100ml20%的無菌甘油混勻，12ml/管，分裝于凍存管。 每個菌種制備 10支，按順序進行編號，最后一支做為質控管進行質量控制，即進行相應的確認，其余作為儲備管在-30C冷凍條件下保存。黑曲霉按g）項下方法進行復壯， 制成復壯后的抱子懸液20ml。以無菌技術向復壯后的菌種菌懸液中 12ml/管加石蠟高 出菌種表面約1cm使菌體與空氣隔絕，并將試管直立，封存于凍存管，置于-20 C冷凍或28C冰箱中保存。制備10支，按順序進行編號，最后一支做為質控管進行質量控 制，即進行相應的確認。其余作為儲備管。 將上述制備好的凍存管逐支粘貼標簽。 內容 包括：菌種名稱、菌種代號

10、、編號、代次、 制備日期、制備人、貯存條件、有效期至等。i）儲備菌種管制備成功，儲存于30C，有效期為兩年。標準菌株的確認a）用無菌接種環取上述培養物接種到胰酪大豆胨瓊脂（TSA）培養基（細菌）或沙氏葡萄 糖瓊脂培養基（真菌和酵母菌）平板上，或相應的宜于該菌生長的鑒別培養基平板上。b）然后在3035C下培養3天（細菌）;2025C下培養5天（真菌和酵母菌）。c）培養后， 首先觀察其是否具有典型的菌落形態， 然后挑取生長旺盛的單一的純菌落， 劃 線于平皿培養基， 每種菌劃 4 個平皿， 以便收集較多的生長旺盛的典型單菌落， 進行保存和鑒定。d）鑒定時作革蘭氏染色、鏡檢，觀察其染色特性及形態特征。

11、必要時再做生化實驗以進一 步鑒定該菌種。e）若在該平板上發現有其它菌落生長，則說明操作有污染或菌種不純，應將此被污染了 的培養物滅活處理，并尋找原因。應根據其原因采取措施重新分離挑選純菌落。f）菌種的確認結果，記錄在菌種鑒定記錄上。g）各菌種的復活、劃線用培養基、培養條件，見菌種復活、劃線用培養基、培養條件（附件2）。541.3菌種的傳代54131標準菌株的傳代a）按菌種說明書要求復溶菌粉，轉種于適宜的增菌培養基內，稱第1代（G1）,復壯后轉接至平板上，并在適當溫度下培養適當時間，分離單個純種菌落，此為第2代（G2）。b）菌種確認后，挑取平板上純菌落制成濃菌懸液用于制備甘油冷凍管或液體石蠟管，

12、作為保存菌種（G2），也稱傳代用菌種，同時挑取純菌落轉接斜面菌種數支，作為工作用菌 種，此為第3代（W3）。c）將第2代（G2）菌種管冷凍保存，將工作用菌（W3）于適當溫度下培養適當時間后用 于日常檢驗。d）取一支冷凍保存的第2代（G2）菌種轉種于平板和斜面培養基上。平板上的菌種制成 冷凍保存管第3代（G3）；斜面培養基的菌種經適當溫度下培養適當時間后用作工作用 菌種，此仍為第3代（W3）。e）將第3代菌種（G3）冷凍或低溫保存，將生長、轉種后的第 2代（G2）菌種經高溫滅 活處理后丟棄。f）按上述規程操作，直至G4轉為W5為止，需重新開啟冷凍干燥菌種，重復上述規程操 作，保存和使用菌種。g）

13、當工作用菌種代數小于5時，在規定保存期限內，可直接用上一代工作用菌種轉接下一 代工作用菌種。傳代用菌的傳代將購回無異常的傳代用菌種（一般為第 3代），根據日常檢驗工作的需要量，挑取純 菌落轉接斜面菌種數支，作為工作用菌種（為第4代），同時，結合菌種的代數和最長保存期 限，挑取純菌落制成濃菌懸液按“”的方法制備甘油冷凍管或液體石蠟管數支，作為傳代用菌種（仍為第3代）。傳代用菌的傳代操作步驟?從冰箱冷藏室（28C）中取出菌種斜面后，應溫室放置約 30min。?將裝有新鮮配制的培養基和傳代菌種一并移入生物安全柜內，打開紫外燈照射1小時。?關閉紫外燈。酒精燈，左手握住菌種斜面，將管口靠近火焰上方，右手

14、拿接種環，將接種環燒紅約 30s，工作用菌種的傳代當工作用菌種代數小于 5 時，可直接用上一代工作用菌種轉接下一代工作用菌種。 取在冰箱48C保存的工作用菌種用普通瓊脂斜面傳代，并將新傳代的培養物替代原有的 菌種，作為工作用菌種。也可取用 “甘油冷凍管保藏法或液體石蠟覆蓋保藏法 ”保存的菌種， 進行復蘇，直接作為工作用菌種。細菌每 1 個月傳代一次；酵母菌每 2 個月傳代一次；霉 菌及芽胞每 3個月傳代一次。當超過 5 代，須用傳代用菌種傳代。5.4.4 注意事項： 傳代時注意無菌操作，使菌株不死亡，不污染、不丟失。同時實驗人員也要采取有效的預防措施進行自我保護，如工作時必須穿工作服，佩帶無菌

15、手套，實驗完成以后消毒實 驗進行的區域、實驗儀器和器具。如發生意外，如菌種泄漏或人員受傷，微生物學檢驗人 員應立即向部門主管報告以便及時進行處理。5.4.5 傳代后， 按檢定菌種的編號原則編號， 并在每一支菌種管上貼上標簽， 標簽內容包括： 名稱、編號、代數、傳代日期、操作人、有效期。交部門主管統一保管。同時及時填寫菌 種傳代記錄（附表 2）。5.5 檢定菌種的編號采用字母加數字表示：英文縮寫字母 代次 傳代日期 順序號菌種的英文縮寫字母：大腸埃希菌（E.c）、金黃色葡萄球菌（S.a）、枯草芽抱桿菌（B.s）、 白色念珠菌（C.a）、黑曲霉菌（A.n）、乙型副傷寒沙門菌（S.p）代數用一位帶有

16、下標數字 的字母表示： 傳代用菌種用 G 表示；工作用菌種用 W 表示；如 G3 表示傳代用菌種第 3 代； W3 表示工作用菌種第 3 代。傳代日期用 6位數字表示：年份取最后兩位數，月、日分別用兩位數。如：2015年 1月 12日傳代的第一支大腸埃希菌作為傳代用菌種的編號為 E.c-G3-120112-01。5.6 檢定菌種的保管5.6.1 檢定菌種設專人加雙鎖保管， 并對所保存的菌種建立 檢定菌種保存、 領用登記臺賬 （附表 3）。5.6.2 檢定菌種的定期檢查與鑒定 在菌種的保存期間，工作日應每天檢查保存菌種冰箱的溫度、必要時檢查菌種管的塞子是否松動，是否染雜菌等，并及時填寫檢定菌種觀

17、察記錄 （附表 4），如有異常應及時處理。菌種在保存期內均應根據菌種的特性（工作用菌種每轉種兩代一次、傳代用菌種每三個月一次）檢查其菌落性狀、革蘭染色、顯微鏡下菌體形態，必要時檢查生化特性等項 目，若發現與原菌種變異較大，應重新分離、純化、鑒定、再加以保存，并做好檢定菌 種鑒定記錄（附表 5）。5.6.3 所保管的菌種，不能隨意轉讓其他單位和個人，需要時應有單位證明和批準手續方可 供應。5.7 檢定菌種的使用0affray x mf/mi址明，說明購買菌種的名稱、菌種代數、1 S菌種和人員最好使用生物安全柜0 可根據預實驗，確定制備方法。ft取3-g個菌落，直接用肉湯或鹽制成懸液丿10號對應濃

18、度，然后稀釋。為接種，一般將濁度調整至麥氏比濁標準管6E7.Uq.048MBaCL2（1.17%W/VBaCL2 洛存O）、0.36NH2SO*1%V/V） 將二液混合，置螺口試管中，放室溫暗處保存1仆上麥氏比濁管配制方法:目測或使用比濁儀即可。1.04 （I用前混勻。有效期為6個月。應用時,微生物學檢驗人員根據檢驗需要，需到部門主管領取工作用菌種或傳代用菌種，同時 填寫檢定菌種保存、領用登記臺賬。微生物學檢驗人員從部門主管領取工作用菌種或傳代用菌種，用于日常檢驗或驗證試 驗，使用后及時填寫檢定菌種使用登記臺賬（附表6），以便追蹤菌種使用歷史。菌液的制備：將新鮮的斜面菌種培養物用 0.9%無菌

19、氯化鈉溶液制成每1ml含菌數為 10-100cfu/ml的菌懸液，置于04C冰箱冷藏，用于陽性對照實驗，使用期 24h，濃菌液放 冰箱可保存一周。5.8 .檢定菌種（廢棄）的銷毀下列情況的菌種或培養物或被污染的器具等，必須采用121C、45分鐘濕熱滅活處理:a新一代菌種制備成功后的上一代菌種；b、使用完后的菌種和帶有標準菌株的器具和培養物；c、超過有效期的菌種；d、凡被污染、變異、可疑等異常情況菌種；e、其他應廢棄的菌種。廢棄菌種的銷毀由微生物檢驗員提出申請，交部門主管批準后，進行滅活處理，并有 其他人在場監督，并填寫廢棄菌種（物品）銷毀處理記錄 （附表7）0&相關文件：初始污染菌檢查標準操作

20、規程、純化水檢測標準操作規程、中國藥典標準操作規程7、注意事項：- . . . . .牛1、微生物檢驗人員最好生物相關專業，要經過培訓，取證上崗8.2、 購買菌種要保留相關證明，最好讓藥檢所開個 數量等，把這個證明附在菌種接受記錄后8.3、菌種的傳代、使用在陽性操作間，為保護8.4、菌種常用的是10-100cfu/m|的菌懸液， 如果是細菌:可參照麥氏標準管進行估算從孵育8-24小時 的非選擇性培養基.號管對應的菌濃度為30X108cfu/ml，稀釋一般用無菌生理鹽水（0.9%氯化鈉溶液）8、附表附表1檢定菌接收記錄附表2:檢定菌種傳代記錄附表3:檢定菌種保存、領用登記臺賬附表4:檢定菌種觀察記錄附表5:檢定菌種鑒定記錄附表6:檢定菌種使用登記臺賬附表7:廢棄菌種（物品）銷毀處理記錄附表1:檢定菌接收記錄：鑒疋