1、-作者xxxx-日期xxxx影響PCR的因素【精品文檔】 影響PCR反應的條件(1) 引物： 引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR 產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。設計引物應遵循以下原則：引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右。引物擴增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。引物堿基：G+C 含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C 過多易出現非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5 個以上的嘌呤或嘧啶 核苷酸的成串排列。避免引物內部出現二級結構，避免兩條引物間互補，特別是3端的互補，否則會形成引物二聚體，產生非特異的擴增條帶。

2、引物3端的堿基，特別是最末及倒數第二個堿基，應嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。引物中有或能加上合適的酶切位點， 被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點， 這對酶切分析或分子克隆很有好處。引物的特異性：引物應與核酸序列數據庫的其它序列無明顯同源性。引物量： 每條引物的濃度0.11umol或10100pmol，以最低引物 量產生所需要的結果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。(2)酶及其濃度 目前有兩種Taq DNA聚合酶供應， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應約(指總反應體積為1

3、00ul時)，濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產物量減少。(3)dNTP的質量與濃度 dNTP的質量與濃度和PCR擴增效率有密切關系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當易變性失去生物學活性。dNTP溶液呈酸性，使用時應配成高濃度后，以1M NaOH或1M Tris.HCL的緩沖液將其 PH調節到7.07.5，小量分裝， -20冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。在PCR反應中，dNTP應為50200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低)，就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產物的產量。dNTP能與Mg2+結合，使

4、游離的Mg2+濃度降低。(4)模板(靶基因)核酸 模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關鍵環節之一，傳統的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K 來消化處理標本。SDS的主要功能是： 溶解細胞膜上的脂類與蛋白質，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜，并解離細胞中的核蛋白，SDS還能與蛋白質結合而沉淀； 蛋白酶K 能水解消化蛋白質，特別是與DNA結合的組蛋白，再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質和其它細胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應。一般臨床檢測標本，可采用快速簡便的方法溶解細胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質使靶基因游離，直接用于PCR擴增。RNA模板提取一般

5、采用異硫氰酸胍或蛋白酶K 法，要防止RNase降解RNA。(5)Mg2+濃度 Mg2+對PCR擴增的特異性和產量有顯著的影響，在一般的PCR反應中，為宜。Mg2+濃度過高，反應特異性降低，出現非特異擴增，濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應產物減少。(6)溫度與時間的設置： 基于PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三個溫度點。在標準反應中采用三溫度點法，雙鏈DNA在9095變性，再迅速冷卻至40 60，引物退火并結合到靶序列上，然后快速升溫至7075，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因(長度為100300bp時)可采用二溫度點法， 除變性溫度外、

6、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94變性，65左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性)。變性溫度與時間：變性溫度低，解鏈不完全是導致PCR失敗的最主要原因。一般情況下，9394lmin足以使模板DNA變性，若低于93則需延長時間，但溫度不能過高，因為高溫環境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產物完全變性，就會導致PCR失敗。退火(復性)溫度與時間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至4060，可使引物和模板發生結合。由于模板DNA 比引物復雜得多，引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間，取決于引物的長度

7、、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對于20 個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55為選擇最適退火溫度的起點較為理想。引物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)2(A+T)復性溫度=Tm值-(510)在Tm值允許范圍內， 選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合，提高PCR反應的特異性。復性時間一般為3060sec，足以使引物與模板之間完全結合。延伸溫度與時間：Taq DNA聚合酶的生物學活性：7080 150 核苷酸/S/酶分子70 60 核苷酸/S/酶分子55 24 核苷酸/S/酶分子高于90時， DNA 合成幾乎不能進行。PCR反

8、應的延伸溫度一般選擇在7075之間，常用溫度為72，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結合。PCR延伸反應的時間，可根據待擴增片段的長度而定，一般1Kb以內的DNA片段，延伸時間1min是足夠 的。34kb的靶序列需34min；擴增10Kb 需延伸至15min。延伸進間過長會導致非特異性擴增帶的出現。對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些。(7)循環次數 循環次數決定PCR擴增程度。PCR循環次數主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環次數選在3040次之間，循環次數越多，非特異性產物的量亦隨之增多。 影響pcr特異性的因素通過上述內容,可以看出有許多因素可以影響pcr的特異性，在此我們作一歸納，供

9、大家參考：退火步驟的嚴格性：提高退火溫度可以減少不匹配的雜交，從而提高特異性。減短退火時間及延伸時間可以減少錯誤引發及錯誤延伸。引物二聚體是最常見的副產品，降低引物及酶的濃度也可以減少錯誤引發，尤其是引物的二聚化。改變mgcl2(有時kcl)濃度可以改進特異性，這可能是提高反應嚴格性或者對taq酶的直接作用。一般認為PCR產物應在48h以內完成電泳檢測，有些最好于當日電泳檢測，大于48h后帶型就會出現不規則，甚至消失。 Trouble shooting guide1假陰性，不出現擴增條帶PCR反應的關鍵環節有模板核酸的制備，引物的質量與特異性，酶的質量， PCR循環條件。尋找原因亦應針對上述環

10、節進行分析研究。模板：模板中含有雜蛋白質，模板中含有Taq酶抑制劑，模板中蛋白質沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。模板核酸變性不徹底。在酶和引物質量好時，不出現擴增帶，極有可能是標本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩定的消化處理液，其程序亦應固定不宜隨意更改。酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因為酶的活性喪失或不夠而導致假陰性。需注意的是有時PCR時忘了加Taq酶或電泳時忘了加溴化乙錠。引物：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題

11、，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：選定一個好的引物合成單位。引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。引物使用過程中應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質降解失效。引物設計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特異性，濃度過低則影響PCR

12、擴增產量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。反應體積的改變：通常進行PCR擴增采用的體積為20l、30l、50l或100l，應用多大體積進行PCR擴增，是根據科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20l后，再做大體積時，一定要重新摸索條件，否則容易失敗。物理原因：溫度對PCR擴增來說相當重要。如果變性溫度低，變性時間短，極有可能出現假陰性；退火溫度過低，可導致非特異性擴增而降低特異性擴增效率；退火溫度過高，影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下PCR儀或水浴鍋內的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。靶序列變異：如靶序列發生突變或缺失，影

13、響引物與模板特異性結合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。 2假陽性引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現假陽性。需重新設計引物。靶序列或擴增產物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣器內或濺出離心管外。除了酶及其他不耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及進樣槍頭均應一次性使用。必要時，在加標本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補后，可擴增出PCR產物，而導致假陽性的產生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。3出現非特異性擴增帶PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現特異性擴增帶 與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環次數過多有關。其次，是酶的質和量，往往一些來源的酶易出現非特異條帶而另一來源的酶則不出現，酶的量過多有時也會出現非特異性擴增。其對策有：必要時，重新設計引物。減低