1、生物檢測技術(shù)第第十十章章 生物檢測技術(shù)生物檢測技術(shù) 采用生物體對被檢測物質(zhì)的特有反應(yīng)而鑒采用生物體對被檢測物質(zhì)的特有反應(yīng)而鑒定被檢測物質(zhì)的質(zhì)量和功效的方法。定被檢測物質(zhì)的質(zhì)量和功效的方法。 生物體主要是各種微生物和某些動物。生物體主要是各種微生物和某些動物。 檢測范圍：生物效價和安全性實驗檢測范圍：生物效價和安全性實驗生物檢測技術(shù)一一 、生物檢測的主要內(nèi)容生物檢測的主要內(nèi)容 生物檢測常用生物檢測常用標(biāo)準(zhǔn)樣品標(biāo)準(zhǔn)樣品對照法對照法 國際標(biāo)準(zhǔn)樣品國際標(biāo)準(zhǔn)樣品聯(lián)合國世界衛(wèi)生組織生物檢定委員會，聯(lián)合國世界衛(wèi)生組織生物檢定委員會，丹麥哥本哈根血清所，倫敦國家醫(yī)研所丹麥哥本哈根血清所，倫敦國家醫(yī)研所 國家標(biāo)

2、準(zhǔn)（參考標(biāo)準(zhǔn)）國家標(biāo)準(zhǔn)（參考標(biāo)準(zhǔn)）本國制備，用國際標(biāo)樣校合，本國制備，用國際標(biāo)樣校合，北京藥品與生物制品研究所北京藥品與生物制品研究所 實驗室對照樣品實驗室對照樣品本室制備，要與國家標(biāo)樣、國際標(biāo)樣本室制備，要與國家標(biāo)樣、國際標(biāo)樣校合校合生物檢測技術(shù)（一）、（一）、生物效價測定生物效價測定 生物生物效價：效價：指某一物質(zhì)引起生物反應(yīng)的功效單位，可用指某一物質(zhì)引起生物反應(yīng)的功效單位，可用理化方法檢測，也可用生物檢測方法測定。理化方法檢測，也可用生物檢測方法測定。利用利用生物生物檢測檢測法法檢測生物效價的物質(zhì)主要有檢測生物效價的物質(zhì)主要有：各類抗生素，維生素及氨：各類抗生素，維生素及氨基酸等基酸等生

3、物生物生長生長促進(jìn)物質(zhì)促進(jìn)物質(zhì)。 一個青霉素效價單位：一個青霉素效價單位：能在能在50mL肉湯培養(yǎng)基中完全肉湯培養(yǎng)基中完全抑制金色葡萄球菌發(fā)育的最小青霉素劑量。抑制金色葡萄球菌發(fā)育的最小青霉素劑量。 一個鏈霉素效價單位：一個鏈霉素效價單位：能在能在1mL肉湯培養(yǎng)基中完全抑肉湯培養(yǎng)基中完全抑制大腸桿菌發(fā)育的最小鏈霉素劑量。制大腸桿菌發(fā)育的最小鏈霉素劑量。 國際標(biāo)準(zhǔn)單位國際標(biāo)準(zhǔn)單位IU，對純的化學(xué)物質(zhì)，可用重量來表示，對純的化學(xué)物質(zhì)，可用重量來表示，如如1mg鏈霉素能抑制鏈霉素能抑制1000mL培養(yǎng)基中大腸桿菌的繁殖，則培養(yǎng)基中大腸桿菌的繁殖，則含有含有1000IU，1IU=1g生物檢測技術(shù)（二）

4、、（二）、 安全性試驗安全性試驗 當(dāng)外源物質(zhì)進(jìn)入體內(nèi)時，可能會產(chǎn)生某些不當(dāng)外源物質(zhì)進(jìn)入體內(nèi)時，可能會產(chǎn)生某些不良反應(yīng)，危害機體的健康和安全。因此需要進(jìn)行良反應(yīng)，危害機體的健康和安全。因此需要進(jìn)行一系列安全性試驗。主要內(nèi)容包括毒性實驗、刺一系列安全性試驗。主要內(nèi)容包括毒性實驗、刺激性試驗、溶血試驗、熱原性實驗、過敏性實驗。激性試驗、溶血試驗、熱原性實驗、過敏性實驗。 1、毒性試驗毒性試驗 是檢測樣品毒性大小的一種生物檢測方法。是檢測樣品毒性大小的一種生物檢測方法。常用動物進(jìn)行實驗常用動物進(jìn)行實驗生物檢測技術(shù)毒性試驗分類毒性試驗分類毒性試驗毒性試驗一般毒性試驗一般毒性試驗特殊毒性試驗特殊毒性試驗急

5、性毒性試驗急性毒性試驗長期毒性試驗長期毒性試驗致突變試驗致突變試驗致癌試驗致癌試驗致畸試驗致畸試驗生物檢測技術(shù)（1 1）、急性毒性試驗）、急性毒性試驗 是指藥物一次劑量給藥，或一次劑量在是指藥物一次劑量給藥，或一次劑量在24小小時內(nèi)分兩次給藥，然后觀察受試動物在時內(nèi)分兩次給藥，然后觀察受試動物在210天內(nèi)天內(nèi)產(chǎn)生的毒性反應(yīng)和死亡情況。產(chǎn)生的毒性反應(yīng)和死亡情況。 半致死劑量（半致死劑量（LD50）：）：是指被試驗動物中，死亡是指被試驗動物中，死亡率為率為50%時的藥物劑量。時的藥物劑量。LD50越大，表明藥物的越大，表明藥物的毒性越小。反之，毒性越小。反之，LD50越小，藥物毒性越大。越小，藥物

6、毒性越大。生物檢測技術(shù)（2）、長期毒性試驗、長期毒性試驗 是指采用不同劑量的藥物定時給藥，然后觀察受試是指采用不同劑量的藥物定時給藥，然后觀察受試動物由于藥物的蓄積作用而產(chǎn)生的毒性反應(yīng)及其嚴(yán)重程度，動物由于藥物的蓄積作用而產(chǎn)生的毒性反應(yīng)及其嚴(yán)重程度，可能的受損害器官及其停藥后恢復(fù)的情況等。為臨床提供可能的受損害器官及其停藥后恢復(fù)的情況等。為臨床提供確切的無毒性反應(yīng)劑量，以確定安全用藥劑量。確切的無毒性反應(yīng)劑量，以確定安全用藥劑量。 （3）、特殊毒性試驗、特殊毒性試驗 是是評價藥物是否有致突變性、生殖毒性和潛在致癌性評價藥物是否有致突變性、生殖毒性和潛在致癌性等特殊毒性的試驗。包括致突變試驗、致

7、癌試驗和致畸試等特殊毒性的試驗。包括致突變試驗、致癌試驗和致畸試驗。驗。生物檢測技術(shù) 2、局部刺激性試驗局部刺激性試驗 將被檢藥物注射進(jìn)動物體內(nèi)，觀察在注射部將被檢藥物注射進(jìn)動物體內(nèi)，觀察在注射部位是否出現(xiàn)炎癥或產(chǎn)生過敏反應(yīng)等局部刺激現(xiàn)象。位是否出現(xiàn)炎癥或產(chǎn)生過敏反應(yīng)等局部刺激現(xiàn)象。 陽性陽性不能臨床使用不能臨床使用 陰性陰性可供臨床使可供臨床使用用 3、溶血溶血試試驗驗 檢測藥物是否引起紅血球膜破裂而釋放出血檢測藥物是否引起紅血球膜破裂而釋放出血紅蛋白紅蛋白。 4、熱原試驗、熱原試驗 是檢測藥物中是否人有使動物體溫升高的致是檢測藥物中是否人有使動物體溫升高的致熱性物質(zhì)存在的試驗。這種致使動物

8、體溫升高的熱性物質(zhì)存在的試驗。這種致使動物體溫升高的致熱性物質(zhì)稱為熱原。致熱性物質(zhì)稱為熱原。一般用家兔試驗一般用家兔試驗。生物檢測技術(shù) 5、過敏試驗過敏試驗 檢測藥物中有無引起過敏反應(yīng)的物質(zhì)存在的檢測藥物中有無引起過敏反應(yīng)的物質(zhì)存在的一種方法。一種方法。 過敏反應(yīng)過敏反應(yīng)： 致敏原致敏原：引起過敏反應(yīng)的物質(zhì)：引起過敏反應(yīng)的物質(zhì) 一般豚鼠或雄性小白鼠試驗一般豚鼠或雄性小白鼠試驗 6、變異原試驗變異原試驗 檢測藥物或食物中有沒有引起生物產(chǎn)生變檢測藥物或食物中有沒有引起生物產(chǎn)生變異的物質(zhì)（變異原）存在。可用動物和微生物檢異的物質(zhì)（變異原）存在。可用動物和微生物檢測。測。生物檢測技術(shù)二二 抗生素的生物

9、檢測抗生素的生物檢測（生長抑制劑生物效價檢測）（生長抑制劑生物效價檢測） 有些可以用化學(xué)檢測或光學(xué)檢測法進(jìn)行檢測，有些可以用化學(xué)檢測或光學(xué)檢測法進(jìn)行檢測，廣泛采用生物檢測法。廣泛采用生物檢測法。 利用抗生素對特定微生物的生長起抑制作用利用抗生素對特定微生物的生長起抑制作用而進(jìn)行檢測的技術(shù)。而進(jìn)行檢測的技術(shù)。 可用于已知抗生素的效價測定，也可用于檢可用于已知抗生素的效價測定，也可用于檢出未知的抗生素。出未知的抗生素。 方法：稀釋法，擴散法方法：稀釋法，擴散法生物檢測技術(shù)1 稀釋法稀釋法 將樣品和標(biāo)準(zhǔn)抗生素分別進(jìn)行不同稀釋度的稀釋，加將樣品和標(biāo)準(zhǔn)抗生素分別進(jìn)行不同稀釋度的稀釋，加入培養(yǎng)基中，用指定

10、的適當(dāng)?shù)木杲臃N，培養(yǎng)后比較微生入培養(yǎng)基中，用指定的適當(dāng)?shù)木杲臃N，培養(yǎng)后比較微生物的生長情況，從而測定樣品的效價。物的生長情況，從而測定樣品的效價。 固體平板，接入相同量指示菌，比較生長菌落數(shù)；固體平板，接入相同量指示菌，比較生長菌落數(shù)； 液體培養(yǎng)基，接入相同量指示菌，比較液體培養(yǎng)基，接入相同量指示菌，比較OD值。值。 還可測抗生素的最低抑菌濃度和半致死劑量還可測抗生素的最低抑菌濃度和半致死劑量LD50生物檢測技術(shù)2 擴散法擴散法 利用擴散作用形成連續(xù)的濃度梯度，試驗菌利用擴散作用形成連續(xù)的濃度梯度，試驗菌在最低抑菌濃度范圍內(nèi)生長受阻，形成抑菌圈，在最低抑菌濃度范圍內(nèi)生長受阻，形成抑菌圈，從

11、抑菌圈直徑測定抗生素效價。從抑菌圈直徑測定抗生素效價。 用標(biāo)準(zhǔn)品作對照，選擇在試驗菌最適生長條件下用標(biāo)準(zhǔn)品作對照，選擇在試驗菌最適生長條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)。 （1）紙片平板法紙片平板法（紙碟法）（紙碟法） （2）圓筒平板法圓筒平板法（管碟法、杯碟法）（管碟法、杯碟法） 應(yīng)用最廣泛的生物檢測法應(yīng)用最廣泛的生物檢測法 雙層平板雙層平板 標(biāo)準(zhǔn)曲線或計算得到樣品效價標(biāo)準(zhǔn)曲線或計算得到樣品效價生物檢測技術(shù) （3 3）雙層試管法）雙層試管法 試管含試驗菌及指示劑美藍(lán)（最終濃度試管含試驗菌及指示劑美藍(lán)（最終濃度1ppm）瓊脂培）瓊脂培養(yǎng)基，垂直放置，加入標(biāo)準(zhǔn)液和樣品液，培養(yǎng)后測定藍(lán)色養(yǎng)基，垂直放置，加入標(biāo)準(zhǔn)液和

12、樣品液，培養(yǎng)后測定藍(lán)色抑菌帶高度，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線可得樣品效價。抑菌帶高度，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線可得樣品效價。 （4 4）生物生長圖譜法）生物生長圖譜法 樣品液進(jìn)行紙層析，層析后風(fēng)干平鋪在含試驗菌平板樣品液進(jìn)行紙層析，層析后風(fēng)干平鋪在含試驗菌平板上，上，4 幾小時，取去濾紙，幾小時，取去濾紙，37 1618h，得到生長圖譜，得到生長圖譜，可檢測樣品中的抗生素或抑菌物質(zhì)種類，并可得可檢測樣品中的抗生素或抑菌物質(zhì)種類，并可得Rf 也可用薄層層析分離后測定也可用薄層層析分離后測定生物檢測技術(shù)三三、生長促進(jìn)物質(zhì)的生物檢測生長促進(jìn)物質(zhì)的生物檢測 生長促進(jìn)物質(zhì)：對生物生長繁殖有促進(jìn)作用或不可欠缺生長促進(jìn)物質(zhì)：對生物生

13、長繁殖有促進(jìn)作用或不可欠缺的物質(zhì)，如維生素、氨基酸、激素等。的物質(zhì)，如維生素、氨基酸、激素等。 一般以微生物為試驗材料一般以微生物為試驗材料 方法：方法： 1 生長抑制物質(zhì)生物檢測方法均可用于生長促進(jìn)物質(zhì)的生長抑制物質(zhì)生物檢測方法均可用于生長促進(jìn)物質(zhì)的檢測檢測 全合成培養(yǎng)基（不含待測物全合成培養(yǎng)基（不含待測物 ） 結(jié)果通過長菌直徑或長菌高度而測定結(jié)果通過長菌直徑或長菌高度而測定生物檢測技術(shù) 2 2 比濁法比濁法 采用適宜菌株和限量全合成液體培養(yǎng)基加不同濃度待測采用適宜菌株和限量全合成液體培養(yǎng)基加不同濃度待測樣品，樣品，37 ，1824h，測定，測定OD，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對照，查濃度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對照，查濃度 3 3 滴定法滴定法 在以乳酸菌為試驗菌的場合，隨著菌生長而生成乳酸，一在以乳酸菌為試驗菌的場合，隨著菌生長而生成乳酸，一定范圍內(nèi)生成乳酸的量與添加的生長促進(jìn)物質(zhì)的量成正比。定范圍內(nèi)生成乳酸的量與添加的生長促進(jìn)物質(zhì)的量成正比。 培養(yǎng)結(jié)束后，用培養(yǎng)結(jié)束后，用0.05 mol/L或或0.1 mol/L NaOH滴定，與標(biāo)準(zhǔn)曲滴定，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對照線對照生物檢測技術(shù)思考題