1、編號內蒙古大學生命科學學院生物系基因工程實驗室本科基因工程實驗論文開題報告論文題目:堿性磷酸酶基因表達載體的構建及在大腸桿菌中的表達學生姓名：年 級：專 業：指導教師：年月日學生姓名民族族性別出生年月論文題目堿性磷酸酶基因表達載體的構建及在大腸桿F菌中的表達開題時間年 月曰結題時間年 月曰項目來源本科生基因工程大實驗課、立論依據項目的研究意義，國內外研究現狀及發展趨勢分析，主要參考文獻及出處：堿性磷酸酶kaline phosphatase AP）是一種非特異性磷酸單酯酶，能催化磷酸單酯的 水解反應，產生無機磷酸和相應的醇、酚或糖，也能催化磷酸基團的轉移反應。AP廣泛存在于微生物和動物體內，在磷

2、生物地球化學循環過程中有重要作用，并廣泛應用于診斷 學、生物化學及分子生物學等領域。1大腸桿菌堿性磷酸酶20世紀80年代相繼完成了大腸桿菌 AP、人胎盤型AP、人肝/骨/腎型AP、人小腸型 AP和釀酒酵母AP氨基酸序列的測定，通過序列比較發現相似性為25%30%,活性部位高度保守，都保留了 Ser102殘基、Arg166及金屬離子配體，這些保守的與催化活性相關 的基團暗示了不同來源的AP具有相似的作用機制。另外，功能相似的磷酸二酯酶，如蠟 狀芽抱桿菌中的磷脂酶C、桔青霉中核酸酶P1,它們的活性部位和金屬離子結合位點與大 腸桿菌AP相似。所以，大腸桿菌 AP還可作為其它磷酸酯酶和以金屬離子作輔助

3、因子的 磷酸酯酶的研究模型。AP確切的生理功能還不十分清楚，但認為它對有機體內磷代謝的調節有重要作用。 大腸桿菌AP的結構基因是phoA，它是pho調節子的一部分，pho調節子主要調節磷的轉 運和代謝。Phobox是pho調節子所有基因啟動子區域的共有序列，受PhoB蛋白的調控。phoB基因產物直接激活pho調節子的轉錄，而PhoB蛋白又被PhoR蛋白磷酸化激活。細 胞外磷的水平是調控PhoR的信號，信號傳遞通過大腸桿菌 Pst系統實現。當接收到環境 信號后，PhoR再去調節PhoB，而PhoB就是大腸桿菌AP結構基因phoA的直接轉錄調節 者。當處于低磷狀態時，PhoR使PhoB磷酸化，激活

4、大腸桿菌AP結構基因phoA的轉錄； 當處于高磷狀態時，PhoR會使PhoB去磷酸化以阻止phoA大腸桿菌AP結構基因的轉錄。2哺乳動物堿性磷酸酶此外，哺乳動物堿性磷酸酶哺乳類 AP和大腸桿菌AP基本三維結構框架非常相似， 與催化活性相關的部位高度保守，2001年獲得PLAP的X-射線晶體結構也證實了這一點 ，所以哺乳類AP與大腸桿菌AP應具有相似的催化機制。但哺乳類AP也有其特點，如 哺乳類AP主要為膜結合蛋白，它們通過磷脂酰肌醇葡聚糖錨定在細胞膜外側；另外，細 菌AP是由單基因編碼，而哺乳類AP則是多基因編碼的，細菌的AP分子兩個亞基完全相 同，而哺乳類AP分子兩個亞基可能不同。哺乳類AP

5、確切的生物學功能和作用機制還不十分清楚。目前認為骨骼的礦化依賴于 正常的AP的活動，對此觀點最直接的證據可能是低磷酸酯酶癥。低磷酸酯酶癥是一種先 天性代謝紊亂的骨疾病，為TNAP編碼的結構基因發生突變，使血液中 AP活力低于正常 水平，表現為骨化及骨發育不全，至今已有 200多種TNAP突變基因型被報道，雖然還無 法治愈，但最近間葉干細胞移植的成功為該病的治療提供了新的途徑O 2。另外，在運輸營 養物質的組織中如小腸上皮刷狀緣表面、胎盤合胞體滋養層表面、膽小管表面細胞膜上 AP的含量很高，提示AP與磷酸的轉移和代謝有關。總之，不同組織和器官的AP有不同的生理功能，但有一些仍然是未知的。3堿性磷

6、酸酶的應用AP在醫學和分子生物學等領域有廣泛的用途。在臨床醫學上，測定血清中AP的活力 已成為診斷和監測多種疾病重要手段。 AP主要用于阻塞性黃疸、原發性肝癌、繼發性肝 癌、膽汁淤積性肝炎等的檢查，患這些疾病時，肝細胞過度制造AP，經淋巴道和肝竇進入血液，同時由于肝內膽道膽汁排泄障礙，反流入血而引起血清AP明顯升高G。而血中腸型AP明顯升高可見于各種腸道疾病，也有文獻報道某些消化系統疾病、自身免疫性疾 病及惡性腫瘤患者血中還可以出現免疫球蛋白復合物型AP,此種AP同工酶出現的機理尚未清楚。AP同工酶作為腫瘤組織的一個標志也逐漸為人們所認識，如肺臟、睪丸、卵巢、 胰腺、結腸和淋巴組織等惡性腫瘤病

7、人血清中含有PLAP。骨型AP作為骨代謝異常的標志物越來越受到臨床重視；血清骨型 AP活力的定量測定可作為監測骨形成變化的有效參 數，在其他的骨代謝異常疾病（如骨軟化癥、佝僂病等）及早期甲狀腺機能亢進的病人、慢 性腎衰病人、接受腎臟移植的病人血清中的骨型 AP活性均有不同程度的改變，對骨型AP 活性的檢測及動態觀察將為疾病的早期診斷、治療效果的監測、病情預后等提供有效的依 據。在動物飼養和疾病診斷方面，AP是反映成骨細胞活性、骨生成狀況和鈣、磷代謝的 重要生化指標。鈣、磷供應不足對動物的影響主要表現為骨結構異常、軟骨病、食欲降低、 生長遲緩、生產性能下降等。年幼動物血液 AP主要來自骨骼，隨著

8、動物長大成熟和骨骼 成年化，來自骨骼的AP逐漸減少。在動物營養研究中，血清 AP活性常作為重要的生化檢測指標協助評定日糧鈣、磷水平的適宜程度。在動物疾病診斷上，依據骨質疏松等骨骼 疾病發生時AP活性的變化規律，可應用血清 AP活性來診斷因鈣、磷及 VD失調所引起 的骨質疾病。臨床骨型AP的檢測比血鈣測定體內鈣營養水平更具敏感性，因此，國內外 研究一致認為骨型AP是反映骨改變全過程最正確的指標，其特異性、靈敏度及準確性優 于其它物質的檢測O5。另外，在動物患肝疾患、胃腸疾患、腎臟疾病和缺鋅時，血清AP均會有改變，如果繼續對臟器特異性、AP變化機制、AP在不同動物體內生理功能深入研 究，會使AP在

9、獸醫臨床上意義更大。在免疫學研究方面，已廣泛應用AP標記抗體進行酶聯免疫熒光反應(ELISA)和Western印跡分析，即將AP與顯色劑或去磷酸化后能發光的底物相互作用來揭示靶與檢測 酶復合物的存在，與辣根過氧化物酶相比，AP用作標記酶的優點是穩定性高、靈敏度高，缺點是成本高、標記困難。在生物化學和分子生物學方面，用 AP催化除去DNA分子的5c末端磷酸基團以防止 載體自連是基因克隆中的常規手段之一。用AP脫去5c末端磷酸基團，再用(C-32P)ATP標記5c末端，可用于化學測序，RNA測序和特異性DNA或RNA片段的圖譜構建。應用 AP代替同位素標記核苷酸探針用于分子雜交。研究中最常用的AP

10、有：(1)細菌堿性磷酸 酶(BAP) ; (2) SAP(來源于一種北極蝦);(3)小牛腸堿性磷酸酶(CIAP); (4)胎盤堿性磷 酸酶(PLAP)和分泌性堿性磷酸酶(SEAP)，后者是前者的C末端短缺版，與PLAP相比， SEAP沒有PLAP的C末端最后24個氨基酸(這24個氨基酸構成了與糖基化磷脂酰肌醇靶 向錨定的區域)。另外，將phoA基因與其它基因融合表達雜合蛋白可用于基因表達的研究。 目前工業上一個普遍的應用是基于巴氏殺菌可破壞AP，因此將AP作為檢驗牛奶的巴氏滅菌的標志。4展望AP的研究已經有近百年的歷史，對于 AP的結構、功能、性質、作用機理、活性調控 等方面的研究均已取得了不

11、小的成就。近年來，科研工作者將研究目光聚焦在AP的生理功能及應用上，取得了許多新成果，如 Lall?s研究結果認為，腸型AP在保持腸道平衡中 發揮重要作用，膳食可以影響它的活性，腸型 AP具有參與調節碳酸氫鹽分泌和十二指腸 pH、通過脫磷酸作用控制細菌內毒素誘發的腸道炎癥等功能O 6。但對該酶在生物體內確切 的生物學功能、工作機理，以及哺乳類 AP的晶體結構分析等方面還有待進一步研究，相 信隨著科學的發展、科研手段的進步、對AP認識的不斷深入，將使 AP在科研和臨床診斷中發揮更大的作用參考文獻： Le Du M H, Stigbra nd T, Taussig M J, et al. Crys

12、tal structure of alkali ne phosphatas from human placenta at 1.8 A resolution implication for a substrate specificityJ. J Biol Chem, 2001,276(12):91589165. Orimo H. The mechanism of mineralization and the role of alka-line phosphatase in health and disease J.J Nippon Med Sch,2010,77(1):412. Fernande

13、z N J, Kidney B A. Alkaline phosphatase:beyond the liverJ. Vet Clin Pathol, 2007, 34(9):6870. 周新滁植光.臨床生物化學和生物化學檢驗M.第3版.北京:人民衛生出版社， 2006. 王石瑩，閆素梅1堿性磷酸酶在動物骨骼代謝中的研究進展J.飼料博覽，2009:1417. Lall?s J P. In test inal alkali ne phosphatase: multiple biological roles in maintenance of in testi nal homeostasis an

14、d modulation by diet J. Nutr Rev, 2010, 68(6) :323332.8二、實驗方案1 實驗內容和實驗目標，擬解決的關鍵問題：實驗內容及目標：1）質粒DNA的小量制備：提取表達載體pET-His2）質粒DNA電泳鑒定3）質粒DNA的酶切4）PCR擴增制備目的基因5）目的基因片段與載體連接6）從瓊脂糖凝膠中回收DNA片斷7）感受態菌的制備8）細菌轉化9）轉化克隆的篩選和鑒定10）外源基因的誘導表達11）SDS-PAGE檢測表達蛋白關鍵問題：a. IPTG誘導量及誘導時間的優化；b. 超聲破碎的方案優化。2 實驗思路、方法、技術路線、實驗方案及可行性分析: 實

15、驗思路：按照技術路線完成試驗。實驗方法：電泳PCR擴增 原核誘導表達等。技術路線:pET-HispET-44a*BAPPCR 擴ItBAP連接pCDNAZ.l轉化pCDNA-BAP制備DHK、 BL21 (DE3) 感受態細胞提質粒*篩逸鑒建回收pET-Hh大片段回收BAP小片段連接pET-His-BAF轉優BL21 (DE3) 羸受態細胞提質粒篩選蛭定IPTG誘導表達SDS-PAGE可行性分析：實驗室相關技術成熟，實驗人員熟悉相關的實驗內容以及方法，實驗的可行性很高。3. 實驗進度(10天之內):準備：發放實驗器材，搖 pET-His, pMD-18T-NK。第一天：提質粒并PCR擴增NK，

16、然后與pMD19-T連接過夜。第二天：作感受態DH5aEcoRI和BamHI雙酶切pET-His。pMD19-T-NK連接液轉化 DH5a 涂板。回收pET-His。第三天：挑p-T-NK平板克隆，搖菌。提質粒 pMD19-T-NK。第四天：EcoRI和BamHI雙酶切驗證。回收 NK。NK與pET-His連接過夜。第五天：pET-His-NK連接液轉化DH5a，涂板。挑pET-His-NK克隆，搖菌。搖BL21(DE3)。 第六天：作感受態 BL21(DE3)。提質粒pET-His-NK 0 HindHI酶切驗證。轉化BL21(DE3)， 涂板過夜。第七天：搖菌包括空BL21(DE3)。練習組裝SDS電泳模具。OD600=0.5時誘導表達3h， 離心集菌。第八天：灌膠加樣電泳(2-3h )，染色45min，脫色。觀察脫色膠，轉入清水，照相。4. 預期實驗成果：1獲得目的產物BAP ;2成功構建BAP表達載體;3撰寫實驗報告。5. 曾參與與本實驗有關的學習和研究工作積累以及已取得的工作成績：（學過基因工