1、發酵產品實例-抗生素生產工藝 抗生素是青霉素、鏈霉素、紅霉素等一類化學物質的總稱 是生物在生產活動過程中產生的，在低微濃度下有選擇性地抑制或殺滅其他種生物機能的有機物質，具有抗菌、抗腫瘤、殺蟲除草、抑制生物體中某些酶類的作用，有些還具有某些藥理活性，如強力霉素鎮咳；新霉素降膽固醇 抗生素的生產方法 生產主要采用微生物發酵法，屬于次級代謝產物，少數如氯霉素、磷霉素亦可用化學合成法生產 半合成抗生素 將生物合成法制得的抗生素用化學或生化方法引入特定的功能基團進行分子結構改造而制成各種衍生物 增強抗菌力 擴大抗菌譜 對耐藥菌有效 便于口服 減低毒副作用 改善藥理性質、提高生物有效性抗生素的生物來源

2、放線菌：鏈霉菌、諾卡氏菌屬、小單孢菌屬 真菌：青霉菌屬、頭孢菌屬、擔子菌 細菌：多粘桿菌、枯草桿菌、芽孢桿菌 植物或動物：蒜蒜素；動物臟器魚素抗生素化學結構的分類 -內酰胺類：青霉素類、頭孢菌素類，包含一個四元內酰胺環 氨基糖苷類：鏈霉素、慶大霉素，既含有氨基糖苷，也含有氨基環醇 大環內酯類：紅霉素、麥迪加霉素，含有一個大環內酯作配糖體，以苷鍵和1-3個分子的糖相連 四環類：四環素、土霉素，以四并苯為母核 多肽類：多粘菌素、桿菌肽，含有多種氨基酸，經肽鍵縮合成線狀、環狀或帶側鏈的環狀多肽抗生素的作用 廣譜抗生素：氨芐青霉素 抗革蘭氏陽性菌抗生素：青霉素 抗革蘭氏陰性菌抗生素：鏈霉素 抗真菌抗生

3、素：制霉菌素 抗病毒抗生素：四環類抗生素 抗癌抗生素：阿霉素抗生素的作用機制 抑制細胞壁合成：青霉素、頭孢菌素 影響細胞膜功能：多烯類抗生素 抑制病原菌蛋白質合成：四環素 抑制核酸合成：絲裂霉素C 抑制生物能作用：抗霉素我國抗生素工業的發展 我國1953年設計制造了4個5噸發酵罐，建立上海第三制藥廠，開始生產青霉素 1957年建立華北制藥廠 經40多年來發展，國外有的基本抗生素品種我國都有生產，并已研制出國外沒有的抗生素創新霉素等 截止1996年上半年，總計127個品種生產，總產量近幾年3萬噸，約占世界抗生素產量的1/4。 農用抗生素研究生產也獲得了可喜的成績，滅瘟素、春日霉素和有效霉素等。抗

4、生素的應用 醫用抗生素，青霉素鉀、鈉等可控制金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌等引起的嚴重感染（敗血癥、肺炎、腦膜炎等），半合成青霉素和頭孢菌素用于對付耐藥性金黃色葡萄球菌，鏈霉素抗G-和結核桿菌 農用抗生素，作用強、劑量小，且不易引起環境污染抗生素劑量表示法 使用劑量不足，達不到抑菌能力，使用劑量過高，會產生毒副作用，且引起病原菌的耐藥性。 故常用效價單位作為衡量抗生素的一尺度。 一個青霉素效價單位在50ml肉湯培養基中完全抑制金黃色葡萄球菌標準菌株發育的最小青霉素劑量 一個鏈霉素效價單位1ml肉湯培養基中完全抑制E.Coli標準菌株發育的最小鏈霉素劑量 一個制霉霉素效價單位1ml肉湯培養基中完全抑

5、制某種酵母標準菌株發育的最小制霉霉素劑量抗生素-次級代謝產物 抗生素是最典型、最著名的次級代謝產物 次級代謝產物又叫做分化代謝物，是在分批培養的分化期（生產期）形成的，只在產生菌的比生長速率降低時才合成抗生素的生物合成 將養分吸收到細胞內，并把它轉化為主干代謝途徑的中間體 經過初級代謝途徑的幾步以后歧向專門抗生素合成的途徑與抗生素合成有關的初級代謝 脂肪酸代謝 氨基酸代謝 糖代謝 嘌呤和嘧啶代謝 芳香族化合物的生物合成 從C1庫來的甲基抗生素的組成 許多抗生素利用氨基酸作為建材 有些抗生素純粹以氨基酸為組份 一些抗生素既有氨基酸，又與其他代謝物（糖、脂肪酸）結合與青霉素合成相關的氨基酸 賴氨酸

6、 半胱氨酸 纈氨酸抗生素生產的工藝過程菌種 孢子制備 種子制備 發酵 發酵液預處理 提取及精制 成品包裝菌 種 來源于自然界，獲得能產生抗生素的微生物，經分離、選育和純化后即稱為菌種 菌種的保藏：冷凍干燥、超低溫冷凍、砂土管、液體石蠟、斜面低溫保藏孢子制備 將保藏的處于休眠狀態的孢子，接種至固體斜面培養基，在一定溫度下培養5-7或7日以上 進一步用扁瓶在固體培養基上擴大培養種子制備 目的使孢子發芽、繁殖以獲得足夠數量的菌絲，并接種到發酵罐中 搖瓶或直接將孢子接入種子罐逐級放大培養 種子培養定時取樣作無菌試驗，觀察菌絲形態，測定種子液中發酵單位和進行生化分析 種子級數培養基的配制 碳源 氮源 無

7、機鹽類 前體碳 源 供給菌種生命活動所需能量，構成菌體細胞及代謝產物 參與抗生素的生物合成 常用碳源：淀粉、葡萄糖及油脂氮 源 構成菌體細胞物質和含氮代謝物 參與含氮抗生素合成 有機氮源 無機氮源無機鹽和微量元素 同其他微生物前 體 菌體利用其構成抗生素分子中的一部分而其本身沒有顯著改變的物質 一定條件下控制菌體合成抗生素的方向并增加抗生素的產量發 酵 目的是使微生物大量分泌抗生素 接種10% 通氣 攪拌 控制罐溫 消泡 控制pH 定時采樣進行生化分析、鏡檢，測定菌體濃度、殘糖量、抗生素含量等發酵液的過濾和預處理 分離菌絲、去除雜質 預處理：去除高價無機離子和蛋白質 過濾：去除固形物及菌體發酵

8、液的預處理 草酸及磷酸去除高價離子鈣、鎂，還能促使蛋白質凝固 黃血鹽有利于去除鐵離子 硫酸鋅有利于凝固蛋白質 等電點法、加熱法、絮凝法去除蛋白發酵液的過濾 板框過濾機 鼓式真空過濾機 自動出渣離心機 傾析器抗生素的提取 溶媒萃取法 離子交換法 直接沉淀法抗生素的精制 藥品生產符合GMP規定 脫色及去除熱原質 結晶和重結晶脫 色 色素是發酵過程中產生的代謝產物，與菌種及發酵條件有關 活性炭脫色熱原質 在生產過程中由于被污染后由雜菌所產生的一種內毒素，G-產生的熱原反應高于G+，是多糖磷類脂質和蛋白質的結合體，引起惡寒高熱，甚至休克 活性炭吸附 超濾去除進一步精制 結晶與重結晶 共沸蒸餾法 柱層析

9、法 中間鹽轉移法 分子篩青霉素的生產工藝 菌種：產黃青霉素（Pen chrysogenum） 生產能力達到30000-60000/mLSNORCONHCH3CH3COOHCCH3_COOHNH2CCH3_CH_ONH_ _CH-工藝流程冷凍管 斜面母瓶 大米孢子 一級種子罐 二級種子罐 發酵罐 放罐 提煉孢子培養25C,6-7d孢子培養25C,6-7d發 酵25C,40-45d 1:2VVM25C,40-45d 1:1.5VVM種子培養種子培養 22-26C,6-7d 1:1-0.8VVM冷至15 C培養基 碳源：利用多種碳源和乳糖、蔗糖、葡萄糖等。普遍采用淀粉經酶水解的葡萄糖糖化液進行流加

10、氮源：可選用玉米漿、花生餅粉、精制棉籽餅粉或麩質粉，并補加無機氮源 前體：為生物合成含有芐基基團的青霉素G，在發酵中加入前體如苯乙酸或苯乙酰胺，加入量不能大于0.1%，采用多次加入方式 無機鹽：硫、磷、鈣、鎂、鉀等鹽類青霉素生產菌生長發育階段 I期 分生孢子發芽 II期 菌絲繁殖 III期 形成脂肪粒，積累貯藏物 IV期 脂肪粒減少，形成中、小空泡 V期 形成大空泡，脂肪粒消失 VI期 細胞內看不到顆粒，個別細胞出現自溶青霉素生產菌生長發育階段 I-IV期為菌絲生長期，產青霉素較少，菌絲濃度增加很多 III期適于作種子 IV-V期青霉素分泌期，菌絲生長趨勢減弱，大量產生青霉素 VI期菌絲自溶期

11、發酵工藝控制 溫度控制：前期25-26C，后期23 C pH控制：一般為6.4-6.6，加酸加堿及加葡萄糖控制 通氣：一般為1：0.8VVM 攪拌：要求發酵液中溶解氧量不低于30%。 泡沫與消沫：少量多次加入消沫劑，在發酵前期不宜多用發酵工藝控制 加糖控制：根據殘糖量與發酵過程中的pH來控制，也可根據排氣中CO2與O2量來控制 補氮：發酵液氨氮控制在0.01-0.05% 加前體：殘余苯乙酰胺濃度控制在0.05-0.08%過 濾 鼓式真空過濾器提 煉 溶媒萃取法：將發酵濾液酸化至pH2，后加相當于發酵濾液體積1/3的醋酸丁酯，混合后以碟片式離心機分離；然后以1.3-1.9%NaHCO3在pH6.

12、8-7.1條件下將青霉素提取到緩沖液中，再調pH2，將青霉素從緩沖液轉入到醋酸丁酯溶液中脫 色 在提取液中加活性炭150-300g/10億單位，進行脫 色、過濾共沸蒸餾 將萃取液以0.5mol/LNaOH液萃取，調pH至6.4-6.8，加3-4倍體積丁醇，在16-26C，5mmHgG下真空蒸餾，將水與丁醇共沸物蒸出，并隨時補加丁醇。當濃縮到原來水濃縮液體積、蒸出餾分中含水達2-4%時，停止蒸餾，青霉素鈉鹽結晶析出，過濾，洗滌，干燥得成品。土霉素生產 菌種: 龜裂鏈霉菌 （Streptomyces Rimosus） 菌落灰白色，后期生皺褶，呈龜裂狀。菌絲呈樹枝狀分枝，白色，孢子灰白色、柱形 生產

13、工藝流程砂土管孢子 斜面孢子 一級種子 二級種子發酵 提取37C4-5天320.5C310.5C30-32h24-26h32C-310.5C- 32C160h砂土管 黃沙：土 = 1：1（沙和土都經處理，水洗至中性，烘干，研細，過篩） 每管裝一定量的砂土，塞好棉塞包好，121高壓蒸汽滅菌后再用160 干熱滅菌2h 每支砂土管加0.3mL孢子懸浮液，包好，放入裝有干燥劑的真空干燥劑內抽干6-12 h，輕輕敲打使其均勻。完后，放入裝有干燥劑的密閉瓶內，0-4貯藏斜面斜面 250 ml茄子瓶 麩皮4%，麥粉2%，瓊脂2% 一級種子一級種子 400-500L夾套二級種子二級種子 4m3（攪拌） 發發

14、酵酵15%接種量培養基： 碳源：淀粉 經-淀粉酶液化 氮源：黃豆餅粉，硫銨 無機鹽：KH2PO4，NaCl ，CaCO3，CoCl2 生長因子：酵母粉，玉米漿 采用中間補料，延長抗生素分泌期，是提高抗生素產量的重要方法。土毒素生產過程采用補糖與補氨，以保證其在分泌期有足夠多而不過多的養料。 總糖 前期 0-80 h 6.5-8% 中期 80-120 h 5-6.5 % 后期120-140 h 4-5 % 末期 140 h后 4% 放罐殘糖3%以下，放罐前24 h不補料 補氨同時為調pH，pH=6.0-6.3，放罐前8 h停止通氨，整個過程通氨水總量350-400升預處理預處理 土霉素能和發酵液中鈣鹽、鎂鹽 ，某些有機胺、蛋白質形成不溶性化合物，積聚在體內。 預處理目的為： 1）使部分土霉素溶