1、生物發光的原理及應用生物發光的原理及應用 生物發光，即用生物發光，即用熒光素酶基因熒光素酶基因標記細胞或標記細胞或DNADNA，直直 接接監控監控活體活體生物體內的細胞活動和基因行為生物體內的細胞活動和基因行為 。觀測活。觀測活體動物體內腫瘤的體動物體內腫瘤的生長及轉移生長及轉移、感染性疾病發展過程、感染性疾病發展過程、特定基因的表達特定基因的表達等生物學過程。等生物學過程。 相比于傳統（通過不同時間點宰殺實驗動物而獲相比于傳統（通過不同時間點宰殺實驗動物而獲得數據）的方法，對得數據）的方法，對一組實驗對象一組實驗對象在不同時間點進行在不同時間點進行記錄，跟蹤記錄，跟蹤同一同一觀察目標（標記細

2、胞及基因）的觀察目標（標記細胞及基因）的移動移動及變化及變化，更可靠。，更可靠。 一，技術原理一，技術原理 二，技術應用二，技術應用 三，技術優勢三，技術優勢 一、技術原理一、技術原理 （1 1）標記原理）標記原理 （2 2）光學原理）光學原理 （3 3）實驗過程）實驗過程 哺乳動物生物發光，是將哺乳動物生物發光，是將FlucFluc基因基因整合到整合到細胞染色體細胞染色體DNADNA上以上以表達熒光素酶表達熒光素酶，當外源，當外源（腹腔或靜脈注射）給予其（腹腔或靜脈注射）給予其底物熒光素底物熒光素（luciferinluciferin），即可在幾分鐘內生發光現象。），即可在幾分鐘內生發光現象

3、。 這種酶在這種酶在ATPATP及氧氣及氧氣的存在條件下，催化的存在條件下，催化熒光素的氧化反應才可以發光，因此只有在熒光素的氧化反應才可以發光，因此只有在活活細胞內細胞內才會產生發光現象，并且才會產生發光現象，并且光的強度光的強度與與標標記細胞的數目記細胞的數目線性相關。線性相關。（1 1）標記原理）標記原理 通過分子生物學克隆技術，將熒光素酶的基通過分子生物學克隆技術，將熒光素酶的基因插到因插到預期觀察的細胞預期觀察的細胞的染色體內，通過單克隆的染色體內，通過單克隆細胞技術的篩選，培養出能細胞技術的篩選，培養出能穩定表達穩定表達熒光素酶的熒光素酶的細胞株，將標記好的細胞注入小鼠體內。觀測前

4、細胞株，將標記好的細胞注入小鼠體內。觀測前需要需要注射熒光素酶的底物注射熒光素酶的底物熒光素。熒光素脂溶熒光素。熒光素脂溶性非常好，很容易透過血腦屏障。性非常好，很容易透過血腦屏障。約一分鐘后表達熒光素酶的細胞開始發光；十分鐘后強度達到最高；在最高點持續約2030分鐘后開始衰落，約三小時后發光全部消失。最好的檢測時間是在注射后15到25分鐘之間。 每次熒光素酶催化反應只產生每次熒光素酶催化反應只產生一個一個光子光子：IVISIVIS （infrared videodata infrared videodata imaging system imaging system 紅外視頻數據成像系紅外視

5、頻數據成像系統成像系統）統成像系統） 一個高度靈敏的制冷一個高度靈敏的制冷CCDCCD相機相機 將光學信號轉化為數字信號； 特別設計的成像暗箱和成像軟件特別設計的成像暗箱和成像軟件可可屏蔽宇宙射線在內的所有射線 觀測、記錄并分析這些信號 光在哺乳動物組織內傳播時光在哺乳動物組織內傳播時會被會被散射和吸收散射和吸收，在偏紅光區域，在偏紅光區域，大量的光可以穿過組織和皮膚而大量的光可以穿過組織和皮膚而被檢測到（被檢測到（衍射衍射）。在）。在相同的深相同的深度度情況下，檢測到的發情況下，檢測到的發光強光強度和度和細胞的數細胞的數量具有非常好的量具有非常好的線性關線性關系系。軟件為每一次使用提供一張。

6、軟件為每一次使用提供一張圖片作為數據結果，記錄了發射圖片作為數據結果，記錄了發射出的光子數據。出的光子數據。顏色顏色體現了單位體現了單位面積中發射面積中發射光子的數量光子的數量，信號強，信號強度高的為紅色，低的為紫色。度高的為紅色，低的為紫色。（2 2）光學原理）光學原理 麻醉系統麻醉系統麻醉麻醉小鼠后放入成像暗小鼠后放入成像暗箱平臺箱平臺 軟件控制平臺的升降到一個合適軟件控制平臺的升降到一個合適的視野，自動開啟照明燈拍攝第一次的視野，自動開啟照明燈拍攝第一次背景圖背景圖。 自動關閉照明燈，在沒有外界光自動關閉照明燈，在沒有外界光源的條件下拍攝由小鼠體內發出的光，源的條件下拍攝由小鼠體內發出的

7、光，即為即為生物發光成像生物發光成像。 與第一次的背景圖與第一次的背景圖疊加疊加后可以清后可以清楚的楚的顯示顯示動物體內光源的動物體內光源的位置位置，完成，完成成像操作。成像操作。 （3 3）實驗步驟）實驗步驟 軟件完成圖像分析過程：軟件完成圖像分析過程：使用者可以使用者可以方便的方便的選取選取感興趣的區域進行感興趣的區域進行測量測量和數據和數據處理處理及及保存保存工作。當選定需要測量的區域工作。當選定需要測量的區域后，軟件可以計算出此區域發出的后，軟件可以計算出此區域發出的光子數光子數，獲得實驗數據。獲得實驗數據。 二、技術應用二、技術應用 （1 1）標記細胞）標記細胞 （2 2）標記病毒）

8、標記病毒（3 3）標記細菌）標記細菌（4 4）基因表達和蛋白質的相互作用）基因表達和蛋白質的相互作用 （5 5）轉基因動物模型）轉基因動物模型 （1 1）標記細胞）標記細胞 癌癥與抗癌藥物研究癌癥與抗癌藥物研究 直接快速地測量各種癌癥模型中腫瘤的直接快速地測量各種癌癥模型中腫瘤的生生長和轉移長和轉移，并可對癌癥治療中癌細胞的變化進，并可對癌癥治療中癌細胞的變化進行行實時觀測和評估實時觀測和評估。活體生物發光成像能夠無。活體生物發光成像能夠無創傷地定量檢測小鼠整體的原位瘤、轉移瘤及創傷地定量檢測小鼠整體的原位瘤、轉移瘤及自發瘤自發瘤。 通過給予腫瘤接種的小鼠不同的通過給予腫瘤接種的小鼠不同的劑量

9、劑量，并，并不同的不同的給藥時間給藥時間、不同的、不同的給藥途徑給藥途徑，觀察抗腫，觀察抗腫瘤藥物的最佳給藥途徑、給藥劑量并給藥時間，瘤藥物的最佳給藥途徑、給藥劑量并給藥時間，從而制定合適的劑型與服藥時間。從而制定合適的劑型與服藥時間。（1 1）標記細胞）標記細胞 癌癥與抗癌藥物研究癌癥與抗癌藥物研究 U251-HRE細胞：其中的熒光素酶基因表達受可誘導啟動子的操控，低氧狀態為其誘導條件。當腫瘤發展到300500mg時，局部組織低氧（微環境），表達；組織切片也可以觀察到生物發光，熒光素酶的體外活性保持時間比較短，約幾十分鐘；已商品化的腫瘤細胞株包括：前列腺癌，乳腺癌，子宮頸癌和結腸癌等細胞系模

10、型。 （1 1）標記細胞）標記細胞 免疫學與干細胞研究免疫學與干細胞研究 將熒光素酶將熒光素酶標記標記的造血干細胞移植入脾及的造血干細胞移植入脾及骨髓，可用于實時觀測活體動物體內骨髓，可用于實時觀測活體動物體內干細胞造干細胞造血過程血過程的早期事件及動力學變化。有研究表明，的早期事件及動力學變化。有研究表明，應用帶有生物發光標記基因的應用帶有生物發光標記基因的小鼠淋巴細胞小鼠淋巴細胞，檢測放療及化療效果。檢測放療及化療效果。 可觀察流體細胞在體內的動向和變化；能更快捷地得到免疫系統中病原的轉移途徑。（1 1）標記細胞）標記細胞 細胞凋亡細胞凋亡 當熒光素酶與抑制多肽以當熒光素酶與抑制多肽以融合

11、蛋白融合蛋白形式在形式在哺乳動物細胞中表達，產生的融合蛋白無熒光哺乳動物細胞中表達，產生的融合蛋白無熒光素酶活性，細胞不能發光；而當細胞發生凋亡素酶活性，細胞不能發光；而當細胞發生凋亡時，活化的時，活化的caspase-3caspase-3（細胞（細胞凋亡蛋白酶凋亡蛋白酶）在特）在特異識別位點異識別位點切切割割去去掉掉抑制蛋白抑制蛋白，恢復熒光素酶，恢復熒光素酶活性，產生發光現象。活性，產生發光現象。檢測正在凋亡的細胞狀況。 （2 2）標記病毒）標記病毒 病毒侵襲病毒侵襲 以熒光素酶基因標記的以熒光素酶基因標記的HSV-1HSV-1（1-1-型單純型單純皰疹病毒皰疹病毒 herpes simp

12、lex virus 1herpes simplex virus 1）病毒為例，）病毒為例，可觀察到可觀察到HSV-1HSV-1病毒病毒對肝臟、肺、脾及淋巴結的對肝臟、肺、脾及淋巴結的侵襲侵襲和病毒和病毒從血液系統進入神經系統的過程從血液系統進入神經系統的過程。多種病毒，腺病毒，腺相關病毒，乙肝病毒等，已被熒光素酶標記，用于觀察病毒對機體的侵染過程。（3 3）標記細菌）標記細菌 細菌侵染研究細菌侵染研究 可以用標記好的革蘭氏陽性和陰性細菌侵可以用標記好的革蘭氏陽性和陰性細菌侵染活體動物，觀測其在動物體內的染活體動物，觀測其在動物體內的繁殖部位繁殖部位、數量變化數量變化及及對外界因素的反應對外界因

13、素的反應。（3 3）標記細菌）標記細菌 抗生素藥物研究抗生素藥物研究 利用標記好的細菌在動物體內對藥物的反利用標記好的細菌在動物體內對藥物的反應，醫藥公司和研究機構可用這種成像技術進應，醫藥公司和研究機構可用這種成像技術進行行藥物篩選藥物篩選和和臨床前動物實驗臨床前動物實驗研究。研究。近年來，國際上大型制藥公司紛紛將精諾真技術在動物體內的實驗結果作為FDA（美國食品和藥品檢驗局）藥物申報材料中非常重要的臨床前動物實驗部分。（4 4）基因表達和蛋白質相互作用）基因表達和蛋白質相互作用 組織特異性基因表達組織特異性基因表達 一種細胞可被兩種熒光素酶標記：一種細胞可被兩種熒光素酶標記：renilla

14、renilla熒熒光素酶基因由一組成性光素酶基因由一組成性穩定表達穩定表達的啟動子驅動，的啟動子驅動，作為作為內參內參，反應細胞數量的變化；，反應細胞數量的變化；fireflyfirefly熒光熒光素酶基因由要研究的組織素酶基因由要研究的組織特異性啟動子驅動。特異性啟動子驅動。這樣firefly熒光素酶發光信號的變化，在消除細胞數量變化的影響后就可反應特定的啟動子在動物體內的表達活性。（4 4）基因表達和蛋白質相互作用）基因表達和蛋白質相互作用 基因治療基因治療 基因治療包括在體內將一個或多個感興趣基因治療包括在體內將一個或多個感興趣的基因及其產物安全而有效地傳遞到靶細胞。的基因及其產物安全而

15、有效地傳遞到靶細胞。應用熒光素酶基因作為報告基因用于載體的構建，觀察目的基因是否能夠在試驗動物體內持續高效和組織特異性表達；插入脂質體包裹的DNA分子中，用來觀察脂質體為載體的DNA運輸和基因治療情況:容易準備、低毒性及輕微免疫反應。（4 4）基因表達和蛋白質相互作用）基因表達和蛋白質相互作用 蛋白質相互作用蛋白質相互作用 將熒光素酶將熒光素酶基因分成兩段基因分成兩段，分別連接所研，分別連接所研究的兩種蛋白之一的編碼究的兩種蛋白之一的編碼DNADNA，然后導入細胞或，然后導入細胞或動物體內表達為動物體內表達為融合蛋白融合蛋白。當兩種蛋白有。當兩種蛋白有強相強相互作用互作用時，表達的熒光素酶兩部

16、分相互時，表達的熒光素酶兩部分相互靠近靠近形形成成有活性有活性的熒光素酶，在有底物存在時出現生的熒光素酶，在有底物存在時出現生物發光，反映出所研究的兩種蛋白存在相互作物發光，反映出所研究的兩種蛋白存在相互作用。用。 此原理亦可用于研究細胞信號傳導途徑。（5 5）轉基因動物模型）轉基因動物模型 基因表達基因表達 將熒光素酶基因將熒光素酶基因插入目的基因啟動子的下插入目的基因啟動子的下游游，并穩定整合于實驗動物染色體中，形成轉，并穩定整合于實驗動物染色體中，形成轉基因動物模型。利用其表達產生的熒光素酶與基因動物模型。利用其表達產生的熒光素酶與底物作用產生生物發光，底物作用產生生物發光，反應目的基因

17、的表達反應目的基因的表達情況情況（何時、何種刺激下表達），從而實現對（何時、何種刺激下表達），從而實現對目的基因的研究。目的基因的研究。動物發育過程中特定基因的時空表達情況；觀察藥物誘導特定基因表達；其它生物學事件引起的相應基因表達或關閉。 （5 5）轉基因動物模型）轉基因動物模型 各種疾病模型各種疾病模型 研究者根據研究目的，將研究者根據研究目的，將靶基因、靶細胞、靶基因、靶細胞、病毒及細菌病毒及細菌進行熒光素酶標記，同時轉入動物進行熒光素酶標記，同時轉入動物體內形成體內形成所需的疾病模型所需的疾病模型，包括腫瘤、免疫系，包括腫瘤、免疫系統疾病、感染疾病等等。統疾病、感染疾病等等。提供靶基因

18、在體內的實時表達和對候選藥物的準確反應；評估候選藥物和其它化合物的毒性；為藥物在疾病中的作用機制及效用提供研究方法。三、技術優勢三、技術優勢 腫瘤轉移研究腫瘤轉移研究，基因治療基因治療，流行病學的發病學研究，流行病學的發病學研究，干細胞示蹤，白血病的相關研究干細胞示蹤，白血病的相關研究等是該技術非常有優勢等是該技術非常有優勢的領域。在藥物開發方面，用該技術進行的領域。在藥物開發方面，用該技術進行腫瘤的藥效腫瘤的藥效研研究，比傳統方法更靈敏，還可以通過一系列轉基因疾病究，比傳統方法更靈敏，還可以通過一系列轉基因疾病動物模型，來快速直觀的進行相關疾病的動物模型，來快速直觀的進行相關疾病的發病機理和

19、藥發病機理和藥物篩選物篩選研究。研究。三、技術優勢三、技術優勢 （1 1）無創傷性，可快速掃描，一天可檢測幾百只；）無創傷性，可快速掃描，一天可檢測幾百只；（2 2）有更高的靈敏度，可以在感染早期就進行活體觀察；）有更高的靈敏度，可以在感染早期就進行活體觀察；（3 3）可以有結構信息，在活體動物整體上觀察感染途徑；）可以有結構信息，在活體動物整體上觀察感染途徑；（4 4）對同一批老鼠自身對照，有效持續觀察，減少實驗）對同一批老鼠自身對照，有效持續觀察，減少實驗 時間和經費，避免個體間差異時間和經費，避免個體間差異 ；（5 5）定量結果：實驗結果以靶細胞單位時間內發射光子數）定量結果：實驗結果以靶細胞單位時間內發射光子數 的絕對量表示，它與標記的靶細胞數量或基因表達情的絕對量表示，它與標記的靶細胞數量或基因表達情 況直接線性相關。況直接線性相關。 熒光素酶的穩定性熒光素酶的穩定性 熒光素酶基因是插到細胞熒光素酶基因是插到細胞染色體染色體內的，當細胞內的，當細胞分裂、轉移、分化時，熒光酶也會得到持續穩定分裂、轉移、分化時