1、青海民族大學 畢 業 論 文（ 設 計 ） 論文題目：手掌參內生真菌代謝產物抗菌活性的研究 學生姓名： 學號： 指導教師： 職稱： 院 系： 化學與生命科學學院 專業班級： 二一二年四月廿五日青海民族大學2012屆畢業論文（設計）評審表作者姓名民族漢系別化生院專業08藥劑入學時間2008.09畢業時間2012.07學習年限四年論文類型實驗題目手掌參內生真菌代謝產物抗菌活性的研究評語該論文立題新穎，觀點明確，中心突出，具有較高的學術研究參考價值和較大的實踐指導意義。試驗方法正確，試驗數據詳實，表格清晰，結論正確，在吸收學術界研究成果的基礎上，提出自己的看法，言之成理。論述觀點正確，材料比較充實，

2、敘述層次分明，有較強的邏輯性。論文格式正確，書寫規范，條理清晰，表達流暢。 指導教師（簽名）：成績系領導小組審查意見系主任（簽名）2012年 5 月 9 日 獨創性聲明本人聲明所呈交的畢業論文是本人在導師指導下進行的理論學習、實習實踐以及研究所取得的成果，除了文中特別加以標注和致謝之處外，論文中不包含其他人已經發表或撰寫過的研究成果，也不包含獲得 青海民族大學 或其他教育機構的學位或證書而使用過的材料。與我一起探討、工作的同學對本論文所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。畢業論文作者簽名： 簽字日期：2012年5月12日畢業論文版權使用授權書本畢業論文作者完全了解 青海民族大學

3、 有關保留、使用畢業論文的規定。特授權青海民族大學可以將畢業論文的全部或部分內容編入有關數據庫進行檢索，并采用影印、縮印或掃描等復制手段保存、匯編以供查閱和借閱。同意學校向國家有關部門或機構送交論文的復印件和磁盤。論文作者簽名： 簽字日期：2012年 5月12日 指導教師簽名： 簽字日期：2012年5月12日摘 要本論文應用瓊脂擴散法對手掌參內生真菌702的代謝產物（水相、酯相）進行抗菌活性研究。結果發現乙酸乙酯相代謝產物對供試菌大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌有抗菌活性，對其他供試菌有無抗菌活性還有待進一步研究。關鍵字：手掌參；內生真菌；代謝產物；抗菌活性asbtractin this paper

4、 application of agar diffusion method on the gymnadenia conopsea endophytic fungus 702 metabolites (aqueous phase, the ester phase) are antibacterial activity research. the results found that ethyl acetate by metabolites on strains of escherichia coli, staphylococcus aureus has antimicrobial activit

5、y, to other strains showed no antibacterial activity.key words: gymnadenia conopsea; endophytic fungi; metabolites; antibacterial activity1 引言手掌參（gymnadenia conopsea）含有多糖、苷類、菲醌類和芪類等多種活性成分，具有抗脂質過氧化、抗炎、抗過敏和免疫調節等多種藥理作用。塊根中含黏液液質、淀粉、蛋白質、糖分、草酸鈣及無機鹽。塊根入藥，具有補腎益精、滋補強壯、生津止渴、消瘀止血、理氣止痛、解毒之功能，具有極佳的補氣效果。主治病后體弱、虛勞

6、消瘦、神經衰弱、肺咳嗽、益腎補腦、糖尿病、肺病、中毒、陽痿、失血、久瀉、白帶、跌打損傷、瘀血腫痛、乳少、慢性肝炎等癥狀。因此手掌參具有極高的藥用療效和保健作用。以進一步提高手掌參的臨床應用價值，拓展應用范圍，有效而充分地利用藥材資源，保護生態環境，減少資源的浪費，本文著力于研究手掌參內生真菌代謝產物是否有抗菌活性，為開發新的保健食品與藥品做好前期的準備。2 材料與方法2.1 材料2.1.1 菌種2.1.1.1手掌參內生真菌：702，從手掌參塊莖中分離純化得到。2.1.1.2供試菌：從中檢所購買的標準菌株。a) 大腸埃希菌（escherichia coli）cmcc（b）44102b) 金黃色葡

7、萄球菌（staphylococcus aureus）cmcc（b）26003c) 銅綠假單胞菌（pseudomonas aeruginosa）cmcc（b）10104d) 乙型溶血性鏈球菌（streptococcus hemdytis-）cmcc（b）32210e) 藤黃微球菌（micrococcus luteus）cmcc（b）28001f) 乙型副傷寒沙門菌（salmonella paratyphy b）cmcc（b）50094g) 枯草芽孢桿菌（bacillus subtilis）cmcc（b）63501h) 白色念珠菌（candida albicans）cmcc（f）98001i) 黑

8、曲霉（aspergillus niger）cmcc（f）980032.1.2試劑hcl(1mol/l)、naoh (1mol/l)、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、蒸餾水等。2.1.3儀器設備zhjh-1112c超凈工作臺、bcd-176xz haier冰箱、ghp-9050隔水式恒溫培養箱、hzq-x100a恒溫振蕩培養箱、th-1060高溫高壓滅菌鍋、tgl-16c高速離心機（臺式）、sb-5200d超聲波清洗機、gzx-9076mbe數顯鼓風干燥箱等。2.1.4培養基2.1.4.1營養瓊脂培養基（g/l）：用于抗菌活性測試（細菌）。牛肉膏 3.0g，蛋白胨 10.0g，氯化鈉 5.0g，瓊脂 18

9、.0g，蒸餾水 1000 ml，ph 7.27.4，121c滅菌30min。2.1.4.2改良馬丁氏培養基（g/l）：用于抗菌活性測試（真菌）。蛋白胨 5.0g，磷酸氫二鉀 1.0g，酵母浸出粉 2.0g，硫酸鎂 0.5g，葡萄糖 20.0g，瓊脂 18.0g，蒸餾水 1000 ml，ph 6.8，121c滅菌30min。2.1.4.3斜面培養基（g/l）：改良pda培養基，用于內生真菌產孢。馬鈴薯 200.0g，葡萄糖 20.0g，蛋白胨 2.0g，瓊脂粉 20.0g，水 1000ml，ph自然，121c滅菌30min。2.1.4.4種子培養基（g/l）：用于內生真菌種子擴增。葡萄糖 10.

10、0g，玉米粉 10.0g，去脂黃豆粉 20.0g， kh2po4 1.0g， ph自然，121c滅菌30min。2.1.4.5發酵培養基（g/l）：用于內生真菌產生代謝產物。蔗糖 10.0g，黃豆粉 10.0g，玉米粉 10.0g，金屬離子（乙酸鎘，乙酸鎳，檸檬酸鐵）各0.1g，鹽（kh2po4，mgso4，nacl） 各1.0g， 蒸餾水 1000ml，ph中性，121c滅菌30min。2.2 方法2.2.1 菌種復壯采用平板劃線法，將原始菌種接種于pda平板上，在28下培養5天，挑選出與菌株表觀特征描述相符的單菌落，接種至pda斜面待用。2.2.2 種子培養配制種子培養基，搖瓶裝量為30m

11、l/250ml，121高壓滅菌30min。在無菌條件下，取上述菌株斜面，用無菌接種鏟鏟取一小塊（約0.5cm2）菌株培養物，接入種子培養基中，28，220rpm旋轉搖床上振蕩培養2天。2.2.3 發酵培養配制發酵培養基，搖瓶裝量為25ml/250ml，121高壓滅菌30min。在無菌條件下，將培養好的種子轉入發酵搖瓶中，接種量為10%，28，220rpm旋轉搖床上振蕩培養5天。2.2.4 發酵液處理搖瓶發酵結束后，12000rpm離心10min，取上清水相，備用。菌絲體沉淀加入一倍體積的丙酮溶劑，振蕩攪勻，超聲提取30min后，10000rpm離心5min，旋轉蒸發濃縮至微干，再用乙酸乙酯（5

12、ml）萃取一次，取乙酸乙酯相、丙酮相，備用。2.2.5 抗菌活性篩選2.2.5.1供試菌種活化（1）接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌等細菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基中或營養瓊脂培養基上，3035培養1824h。（2）接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基中或改良馬丁瓊脂培養基上，2025培養2448h。（3）接種黑曲霉的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂培養基上，2328培養35d。2.2.5.2菌懸液或孢子懸液的制備（1）將上述細菌培養物用 0.9%無菌氯化鈉溶液制成濃度為108cfu（菌落形成單位）/ml的菌懸液。（2）將上述白色念珠菌培養物用 0.9%氯化鈉溶液制成

13、濃度為108 cfu/ml的菌懸液。（3）將上述黑曲霉培養物加入 0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，制成濃度為108 cfu/ml的孢子懸液。2.2.5.3混菌平板的制備（雙層平板）取直徑90mm的無菌培養皿，注入加熱融化的培養基20ml，使在皿底內均勻攤布，放置水平臺面上使凝固，作為底層。另取培養基適量加熱融化后，放冷至4850（芽孢可至60），加入規定的試驗菌懸液適量（1ml/100ml培養基，能得清晰的抑菌圈為度，標準品溶液的抑菌圈直徑在1822mm為宜），搖勻，在每個培養皿中分別加入10ml，使在底層上均勻攤布，作為菌層，放置在水平臺上冷卻，備用。2.2.5.4粗提物抗菌活性篩選（瓊

14、脂擴散法紙片法）將直徑為6mm的圓形濾紙片浸入到不同濃度的粗提物溶液中，取出，晾干以揮去溶劑，貼于混菌平板上；同時，溶劑（丙酮、乙酸乙酯）做試劑空白對照。細菌3537培養1824h，白色念珠菌2025培養2448h，黑曲霉2328培養35d。3 實驗流程3.1 發酵流程種子培養（28，220rpm旋轉搖床上振蕩培養2天）發酵培養（接種量為10%，28，220rpm旋轉搖床上振蕩培養5天）發酵液處理（離心、萃取）代謝產物的收集。3.2 抗菌活性篩選流程供試菌種活化（接種在斜面培養基上在一定條件下培養）菌懸液或孢子懸液的制備（0.9%氯化鈉溶液制成濃度為108 cfu/ml的菌懸液）混菌平板的制備

15、（雙層平板）粗提物抗菌活性篩選（瓊脂擴散法紙片法）。4 結果與討論4.1 結果將手掌參內生真菌代謝產物水相、酯相（丙酮相、乙酸乙酯相）對七種供試細菌、兩種供試真菌進行抗菌活性測試，結果表明乙酸乙酯相對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌有較低的抗菌活性，其它均無活性，見表1、圖1、圖2。表1 代謝產物對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的抑菌作用供試菌抑菌圈直徑/mm水相丙酮相乙酸乙酯相大腸埃希菌6.006.006.20金黃色葡萄球菌6.006.006.20圖1 手掌參內生真菌代謝產物對大腸埃希菌的抑菌作用圖2 手掌參內生真菌代謝產物對金黃色葡萄球菌的抑菌作用4.2 討論 1本實驗應用瓊脂擴散法即將含有定量抗菌

16、藥物的紙片貼在已接種測試菌的瓊脂平板上。紙片中所含的藥物吸取瓊脂中的水分溶解后不斷地向紙片周圍區域擴散形成遞減的梯度濃度。在紙片周圍抑菌濃度范圍內測試菌的生長被抑制，從而形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映測試菌對測定藥物的敏感程度，并與該藥對測試菌的最低抑菌濃度(mic)呈負相關關系，即抑菌圈愈大，mic愈小。2應用瓊脂擴散法對手掌參內生真菌702進行發酵實驗，收集代謝產物（包括水相、酯相），做抑菌活性測試。起初看不到透明的抑菌圈，分析可能造成的原因：培養基的質量，如ph、深度、硬度和表面濕度等；藥敏紙片的質量、含藥量和保存方式；接種菌量正確與否；試驗操作質量；孵育條件，如溫度和時間等；抑菌圈

17、測量工具的精度；質控標準菌株本身的藥敏特性是否合格，有無變異。通過以上各因素的綜合考慮進一步改進實驗即增大濾紙片侵入粗提物的次數，增大了上樣量，對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌進行了抑菌活性的測定，發現手掌參內生真菌代謝產物對以上兩菌有抗菌活性，但透明的抑菌圈不是很大，預計再增大上樣量可能抑菌效果會更佳。至于最低抑菌濃度的測定，由于收集的手掌參內生真菌代謝產物的過少，所以沒有繼續。3至于手掌參內生真菌代謝產物是否對其余供試菌有沒有抗菌活性由于時間的原因沒有做實驗，還有待更進一步的研究。4可見手掌參是極為珍貴蘭科植物，又具有較高藥用價值，成為醫藥保健等行業的重點開發藥材，但由于蘭科植物獨特的種子結構

18、，使得野生蘭花不易成活，所以無論是對蘭科植物手掌參的人工擴繁上還是對野生藥用手掌參的保護上還是對手掌參的藥用價值的研究上都應該做好前期的準備工作，這樣不僅可以起到保護環境和野生藥用植物永續利用的目的，還可以增加林區藥材后備資源的貯量，有利于發展林業生態優先，同時在醫藥行業發揮手掌參的重要價值。參考文獻1 中國科學院西北高原生物研究所.藏藥志m.青海:人民出版社,1991.248.2 青海省藥品檢驗所.青海省藏藥研究所.中國藏藥m.上海:科學技術出版社,1996.343.3 江蘇新醫學院.中藥大辭典(上冊)m.上海:科學技術出版社,1986.436.4 孫明學.大興安嶺森林植物m.哈爾濱:東北林業大學出版社,2006:3.5 中國醫學科學院藥物研究所.中藥志m.北京:人民衛生版社,1982: 276.6 郎楷永,陳心啟,羅毅波,等.中國植物志(第17卷)m.北京:科學出版社,