1、結(jié)核藥敏試驗(yàn)價(jià)值武漢市醫(yī)療救治中心吳文娟武漢市醫(yī)療救治中心吳文娟結(jié)核藥敏試驗(yàn)價(jià)值醫(yī)生期望的藥敏試驗(yàn) 敏感=治療有效結(jié)核藥敏試驗(yàn)價(jià)值結(jié)核藥敏試驗(yàn)價(jià)值結(jié)核藥敏試驗(yàn)價(jià)值內(nèi)容 3結(jié)核藥敏試驗(yàn)價(jià)值藥物敏感性測(cè)定的重要意義 臨床治療的重要參考 流行病學(xué)的重要指標(biāo) 結(jié)核藥敏試驗(yàn)價(jià)值 藥物敏感性檢測(cè)方法 手工方法-（ 需要幾周） 自動(dòng)化方法 -Agar Proportion BACTEC 460 TB -L-J Proportion BACTEC MGIT-L-J Resistance Ratio BACT ALERT-Absolute Resistance BACTEC 960 MGIT - E- test

2、 TREK 結(jié)核藥敏試驗(yàn)價(jià)值藥物敏感性試驗(yàn)常用標(biāo)準(zhǔn)方法 絕對(duì)濃度法是由G. Meissner (德國(guó)) 于1964年首先提出的,是我國(guó)30 多年來(lái)一直沿用的藥敏試驗(yàn)方法。 比例法是由法國(guó)的G. Canetti 和J.Grossete于1963年首先提出,是WHO 全球耐藥監(jiān)測(cè)項(xiàng)目中推薦的標(biāo)準(zhǔn)藥敏試驗(yàn)方法。二者在臨界藥物濃度接種菌量、結(jié)果判讀方法等方面都有一定差別. 抗性比濁法是英國(guó)科學(xué)家D.A.Mitchison首先提出,由于方法比較煩瑣,現(xiàn)已不多用結(jié)核藥敏試驗(yàn)價(jià)值比例法和絕對(duì)濃度法的一致性 比例法和絕對(duì)濃度法是測(cè)定分支桿菌藥物敏感性的二種常規(guī)方法,前者是世界衛(wèi)生組織(WHO) 在“全球結(jié)核病

3、耐藥監(jiān)測(cè)項(xiàng)目”中推薦的統(tǒng)一方法,后者是我國(guó)各級(jí)實(shí)驗(yàn)室30 多年來(lái)普遍沿用的方法。近年來(lái),隨著我 國(guó)部分省陸續(xù)加入WHO 耐藥監(jiān)測(cè)項(xiàng)目,二種方法的一致性問(wèn)題以及藥敏試驗(yàn)是否向比例法轉(zhuǎn)軌已成為國(guó)內(nèi)爭(zhēng)議的熱點(diǎn)結(jié)核藥敏試驗(yàn)價(jià)值比例法和絕對(duì)濃度法的一致性 綜合以往國(guó)內(nèi)有關(guān)比例法和絕對(duì)濃度法的試驗(yàn)報(bào)道，對(duì)2種方法研究結(jié)果顯示,比例法和絕對(duì)濃度法檢測(cè)結(jié)果的一致率4 藥均高達(dá)6 %以上,對(duì)于結(jié)核分支桿菌,二種方法測(cè)試H、S、R 和E 的耐藥率均無(wú)顯著性差異。絕對(duì)濃度法向比例法轉(zhuǎn)軌，將會(huì)使我們的藥敏試驗(yàn)結(jié)果與國(guó)際接軌 ，與國(guó)際具有可比性，而不會(huì)影響到與我國(guó)既往資料的連續(xù)性和可比性結(jié)核藥敏試驗(yàn)價(jià)值比例法和絕對(duì)濃度

4、法的區(qū)別 (1) 絕對(duì)濃度法對(duì)接種量（ 10 3mg）要求十分嚴(yán)格,既要避免由于過(guò)量接種產(chǎn)生自然突變的可能,又要保證對(duì)照培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)旺盛,相比之下,比例法由于設(shè)定了高、低2 個(gè)（10-4 、10-6 mg ）接種量的參考系統(tǒng),且試驗(yàn)結(jié)果的判定是通過(guò)計(jì)算活性單位的比值獲得,因此對(duì)接種量這一藥敏試驗(yàn)的重要變異因素進(jìn)行了一定程度的校正結(jié)核藥敏試驗(yàn)價(jià)值比例法和絕對(duì)濃度法的區(qū)別 (2) 比例法定義1 %為“敏感”和“耐藥”的臨界點(diǎn),而絕對(duì)濃度法規(guī)定低濃度含藥培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落數(shù)多于20 個(gè)判斷為耐藥,按接種菌量的活菌單位計(jì)算與比例法的1 %耐藥有相同的理論基礎(chǔ)。在此基礎(chǔ)上,由于絕對(duì)濃度法每種藥物設(shè)定

5、高、低2 個(gè)藥物濃度,所以絕對(duì)濃度法在一定程度上反映了耐藥的程度和水平。如果說(shuō)比例法是定性的藥敏試驗(yàn),絕對(duì)濃度法則包含有“半定量試驗(yàn)”之意。 （3）比例法操作較為繁瑣，且需定量技術(shù)。結(jié)核藥敏試驗(yàn)價(jià)值藥敏試驗(yàn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基 為無(wú)淀粉改良羅氏培養(yǎng)基，配方與酸性羅氏培養(yǎng)基相比只有磷酸二氫鉀(KH 2 PO 4 )的量不同，其他成分完全相同。結(jié)核藥敏試驗(yàn)價(jià)值 抗結(jié)核藥物溶液的配制和稀釋 （略） 含藥培養(yǎng)基制備 （略） 藥敏試驗(yàn)方法 （略） 比例法藥敏試驗(yàn) （過(guò)程略）結(jié)核藥敏試驗(yàn)價(jià)值藥敏試驗(yàn)流程 23周新鮮純培養(yǎng)物磨菌制備mg/ml的菌液稀釋至適當(dāng)濃度接種適當(dāng)菌量至含藥培養(yǎng)基和對(duì)照斜面 37 培養(yǎng)4周報(bào)告結(jié)

6、果 結(jié)核藥敏試驗(yàn)價(jià)值比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果報(bào)告及解釋 按以下方式記錄菌落生長(zhǎng)情況. (1)少于50個(gè)菌落: 報(bào)實(shí)際菌落數(shù) (2)50100個(gè)菌落: 1+ (3)100200個(gè)菌落: 2+ (4)大部分融合(200500個(gè)菌落): 3+ (5)融合(大于500個(gè)菌落): 4+結(jié)核藥敏試驗(yàn)價(jià)值結(jié)核藥敏試驗(yàn)價(jià)值結(jié)核藥敏試驗(yàn)價(jià)值確定耐藥臨界點(diǎn)的機(jī)構(gòu)確定耐藥臨界點(diǎn)的機(jī)構(gòu) WHO the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI; formerly known as the NCCLS)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì) the European Union C

7、ommittee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) 歐洲抗菌藥物敏感性試驗(yàn)委員會(huì)結(jié)核藥敏試驗(yàn)價(jià)值細(xì)菌耐藥臨界點(diǎn)的選擇依據(jù)細(xì)菌耐藥臨界點(diǎn)的選擇依據(jù)耐藥臨界點(diǎn)耐藥臨界點(diǎn)藥敏試驗(yàn)方法藥敏試驗(yàn)方法耐藥機(jī)制研究耐藥機(jī)制研究臨床實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)臨床實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)PK/PDMonte Carlo 模型模型結(jié)核藥敏試驗(yàn)價(jià)值PK/PD耐藥臨界點(diǎn)Monte Carlo 模型耐藥臨界點(diǎn)(Monte Carlo Simulation Breakpoints) 借助已 獲得的藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)數(shù)據(jù) ,結(jié)合當(dāng)?shù)丶?xì)菌MIC資料，通過(guò)模擬大樣本人群以及致病菌的不同MIC時(shí)的設(shè)定耐

8、藥的給藥方案和藥物濃度檢測(cè)PK-PD參數(shù)所設(shè)定的臨界點(diǎn)。 已成為CLSI修改抗菌藥物臨界點(diǎn)的重要依據(jù)。結(jié)核藥敏試驗(yàn)價(jià)值細(xì)菌耐藥臨界點(diǎn)的類型微生物學(xué)的耐藥臨界點(diǎn)（Microbiological Breakpoint, Wild-type Cut-Off Value, Epidemiological Cut-Off Values） 確定和驗(yàn)證抗結(jié)核藥物耐藥臨界點(diǎn)的主要方法 一線抗結(jié)核藥物（除吡嗪酰胺）耐藥臨界點(diǎn)經(jīng)過(guò)充分驗(yàn)證 二線抗結(jié)核藥物耐藥臨界點(diǎn)： Consensus-based critical concentration 區(qū)分野生型細(xì)菌和獲得性耐藥的細(xì)菌,不代表細(xì)菌對(duì)治療的反應(yīng)結(jié)核藥敏試驗(yàn)價(jià)

9、值結(jié)果解釋 耐藥百分比計(jì)算： 耐藥百分比=含藥培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落數(shù)/對(duì)照培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落數(shù)*100% 若耐藥百分比1 %則認(rèn)為受試菌對(duì)該抗結(jié)核藥耐藥結(jié)核藥敏試驗(yàn)價(jià)值判讀舉例接種量對(duì)照INHEMB10 4+310 62690耐藥%34.60.1判讀耐藥（R）敏感(S)結(jié)核藥敏試驗(yàn)價(jià)值耐藥臨界點(diǎn)的選擇藥物耐藥臨界點(diǎn)：僅限于特定培養(yǎng)基和特定細(xì)菌L-J培養(yǎng)基報(bào)道的NTM“敏感”不代表真正敏感L-J培養(yǎng)培養(yǎng)基基7H107H11BACTEC460MGIT960利福平耐藥臨界點(diǎn)（ g/ml）40.01.01.02.01.0快速生快速生長(zhǎng)分枝長(zhǎng)分枝桿菌分桿菌分枝桿菌枝桿菌堪薩斯堪薩斯分枝桿分枝桿菌菌MAC克

10、拉霉素耐藥臨界點(diǎn)（ g/ml）83232結(jié)核藥敏試驗(yàn)價(jià)值 利福平耐藥利福布汀敏感存在嗎？結(jié)核藥敏試驗(yàn)價(jià)值影響藥敏試驗(yàn)的價(jià)值藥敏試驗(yàn)的價(jià)值的因素細(xì)菌因素 耐藥與敏感（抗結(jié)核藥用前存在自然突變株）藥敏試驗(yàn)的影響因素藥敏試驗(yàn)的影響因素藥物因素 藥代學(xué)(Cmax, AUC, timeMIC) 藥效學(xué) (MIC, MBC, PAE) 藥物特性 (透過(guò)血腦屏障的比例)機(jī)體因素 合并癥 疾病程度和年齡(藥物吸收不良) 感染部位結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗(yàn)的價(jià)值和局限結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗(yàn)的價(jià)值和局限結(jié)核藥敏試驗(yàn)價(jià)值藥敏試驗(yàn)的影響因素培養(yǎng)基 利福平對(duì)MTB的MIC 7H9培養(yǎng)基不含Tween 0.05-0.2 g/ml

11、 7H9培養(yǎng)基含Tween 0.005-0.02 g/ml Ogawa培養(yǎng)基 10 g/ml LJ培養(yǎng)基 2.5-10 g/ml接種量：標(biāo)準(zhǔn)化問(wèn)題 (接種量過(guò)多:假耐藥 接種量過(guò)少:假敏感)培養(yǎng)時(shí)間 (培養(yǎng)時(shí)間 越長(zhǎng)藥物失效越多 ,固體培養(yǎng)基的MIC高于液體培養(yǎng)基的MIC)藥敏試驗(yàn)的方法結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗(yàn)的價(jià)值和局限性結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗(yàn)的價(jià)值和局限性結(jié)核藥敏試驗(yàn)價(jià)值藥敏試驗(yàn)方法的局限性 在得到純細(xì)菌的培養(yǎng)物后仍需4周報(bào)告結(jié)果，遠(yuǎn)滯后臨床診治的需要 試驗(yàn)比較繁瑣，結(jié)果受多種因素影響，可重復(fù)性較差 實(shí)驗(yàn)室耐藥與臨床耐藥之間有一定差距結(jié)核藥敏試驗(yàn)價(jià)值“敏感”結(jié)核病療效欠佳的原因分析 1 合并其它

12、病原菌的感染（細(xì)菌、真菌）。侵襲性肺曲菌病結(jié)核藥敏試驗(yàn)價(jià)值2 、合并肺外結(jié)核 結(jié)核性腦膜炎、肝脾結(jié)核，結(jié)核性胸膜炎、骨結(jié)核、腎結(jié)核結(jié)核藥敏試驗(yàn)價(jià)值3 將耐藥結(jié)核病判斷誤判為“敏感”。（1）Monte Carlo 模型評(píng)估耐藥臨界點(diǎn)Gumbo T.New susceptibility breakpoints for first-line antituberculosis drugs based on antimicrobial pharmacokinetic/pharmacodynamic science and population pharmacokinetic variability.An

13、timicrob Agents Chemother. 2010 Apr;54(4):1484-91.結(jié)核藥敏試驗(yàn)價(jià)值2）野生型MIC分布法評(píng)估耐藥臨界點(diǎn)結(jié)核藥敏試驗(yàn)價(jià)值4 、未發(fā)現(xiàn)低度耐藥菌 四種方法：改良羅氏比例法，瓊脂比例法，BACTEC，MGIT 四種方法結(jié)果一致：2株敏感株（2/2），3株可能敏感株(3/3)，1株耐藥株(1/6)和1株可能耐藥株(1/8) 目前的自動(dòng)化肉湯培養(yǎng)基的方法（BACTEC460和MGIT960）容易遺漏低度耐藥的利福平菌株Van Deun A, et al. Mycobacterium tuberculosis strains with highly dis

14、cordant rifampin susceptibility test results.J Clin Microbiol. 2009 Nov;47(11):3501-6. 結(jié)核藥敏試驗(yàn)價(jià)值5 、表型敏感，基因型有耐藥突變Williamson DA, Roberts SA, Bower JE, et al.Clinical failures associated with rpoB mutations in phenotypically occult multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis. Int J Tuberc Lung Dis. 2

15、012 Feb;16(2):216-20. 結(jié)核藥敏試驗(yàn)價(jià)值6、 生理屏障 血腦屏障 血-漿膜屏障 血-骨屏障分子量小分子量小親脂性親脂性血漿蛋白結(jié)合率低血漿蛋白結(jié)合率低良好腦膜良好腦膜通透性通透性結(jié)核藥敏試驗(yàn)價(jià)值腦膜通透性異煙肼和吡嗪酰胺：中度親脂，小分子異煙肼和吡嗪酰胺：中度親脂，小分子丙硫異煙胺：親脂丙硫異煙胺：親脂鏈霉素：親水，大分子鏈霉素：親水，大分子利福平：親脂，血漿蛋白結(jié)合率利福平：親脂，血漿蛋白結(jié)合率結(jié)核藥敏試驗(yàn)價(jià)值7 、藥物在肺組織未能達(dá)到有效血藥濃度和最佳效果（1）合并糖尿病的肺結(jié)核患者利福平血藥濃度下降（2）免疫功能下降（3）血管破壞（4）組織壞死、低氧、酸性環(huán)境影響藥效

16、(特別是氨基糖苷類和 喹諾酮類)結(jié)核藥敏試驗(yàn)價(jià)值Nijland HMJ, et al. Exposure to Rifampicin Is Strongly Reduced in Patients with Tuberculosis and Type 2 Diabetes. Clinical Infectious Diseases 2006; 43:84854Nijland HMJ, et al. Exposure to Rifampicin Is Strongly Reduced in Patients with Tuberculosis and Type 2 Diabetes. Clini

17、cal Infectious Diseases 2006; 43:84854結(jié)核藥敏試驗(yàn)價(jià)值耐藥結(jié)核病的治療策略 個(gè)體化治療 標(biāo)準(zhǔn)化治療策略1可靠的藥敏試驗(yàn)： 采用受公認(rèn)的方法 有良好質(zhì)量控制體系理解藥敏試驗(yàn)、PK/PD含義的臨床醫(yī)生策略2 中低收入國(guó)家結(jié)核病控制的重要手段！結(jié)核藥敏試驗(yàn)價(jià)值個(gè)體化治療的局限性1Interpretation of DST to some of the first- and second-line drugs is difficult and could mislead regimen design. These guidelines do not recomme

18、nd using DST of ethambutol, pyrazinamide and the drugs in Groups 4 and 5 to base individual regimen design.對(duì)某些一線藥物和二線藥物DST（藥敏試驗(yàn)）（結(jié)果）進(jìn)行解釋, 比較困難， 并且可能會(huì)誤導(dǎo)治療方案的設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)室不能對(duì)某些藥物進(jìn)行DST（藥物敏感試驗(yàn)），或者即使能進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，也不能進(jìn)行不同時(shí)間點(diǎn)的藥敏試驗(yàn) ， 2The laboratory may not perform DST of certain drugs, or may perform them at different times.（實(shí)驗(yàn)室不能對(duì)某些藥物進(jìn)行DST（藥物敏感試驗(yàn)），或者即使能進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，也不能進(jìn)行不同時(shí)間點(diǎn)的藥敏試驗(yàn) ）The programmatic management of drug-resistant tuberculosis emergency update 2008. Geneva: World Health Organization; 2008.