1、第一節 概 述一、酶工程簡介酶工程(enzyme engineering)是酶學和工程學相互滲透發展而成的一門新的技術科學，它是從應用的目的出發研究酶、應用酶的特異性催化功能并通過工程化將相應原料轉化成有用物質的技術。酶工程的名稱出現在20世紀20年代初，在當時，主要是指自然酶制劑在工業上的大規模應用。在1953年，Grubhofer和Schleith首先將羧肽酶、淀粉糖化酶、胃蛋白酶和核糖核酸酶等，用重氮化聚氨基聚苯乙烯樹脂進行固定，提出了酶的固定化技術。1969年，日本的千田一郎等人首先應用固定化酶技術成功地拆分了DL-氨基酸。隨著科學的發展和酶技術研究的深入，酶工程所涉及的范圍也越來越廣

2、。1971年，第一屆國際酶工程會議提出的酶工程的內容主要是：酶的生產、分離純化、酶的固定化、酶及固定化酶的反應器、酶與固定化酶的應用等。近年來，由于酶在工業、農業、醫藥和食品等領域中應用的迅速發展，酶工程也在不斷地增添新的內容。從現代觀點來看，酶工程主要有以下幾個方面的研究內容:酶的分離、提純、大批量生產及應用開發。酶和細胞的固定化及酶反應器的研究(包括酶傳感器、反應檢測等。酶生產中基因工程技術的應用及遺傳修飾酶（突變酶)的研究。酶的分子改造與化學修飾以及酶的結構與功能之間關系的研究。有機相中酶反應的研究。酶的抑制劑、激活劑的開發及應用研究。抗體酶、核酸酶的研究。模擬酶、合成酶及酶分子的人工設

3、計、合成的研究。酶工程技術研究的深入和應用，使其在工業、農業、食品和醫藥等方面發揮著極其重要的作用。二、酶的來源酶作為生物催化劑普遍存在于動物、植物和微生物中，可以直接從生物體中分離提純。從理論上講，酶與其他蛋白質一樣，也可以通過化學合成法來制得。現在已經有了一整套固相合成多肽的自動化技術，大大加快了合成速度，但從實際應用上講，由于試劑、設備和經濟條件等多種因素的限制，通過人工合成的方法來進行酶的生產還需雯相當長的一段時間，因此酶的生產目前還是直接從生物體中抽提分離。早期酶的生產多以動植物為主要原料，由植物提供的酶主要有蛋白酶、淀粉酶、氧化酶等，由動物組織提供的酶主要有胰蛋白酶、脂肪酶和用于奶

4、酪生產的凝乳酶等，有些酶的生產至今還應用此法。如從豬頜下腺中提取激肽釋放酶，從菠蘿中制取菠蘿蛋白酶，從木瓜汁液中制取木瓜蛋白酶等。但隨著酶制劑應用范圍的日益擴大以及技術、經濟和倫理上的問題，使得單純依賴動植物來源的酶已遠遠不能滿足要求，而且動植物原料的生長周期長、來源有限，又受地理、氣候和季節等因素的影晌，不適于大規模生產。近10多年來，動植物組織和細胞培養技術取得了較大的進步，但因其周期長、成本高，因而還有一系列問題正待解決，估計在不久的將來會出現利用動植物細胞培養的方法來生產酶的新技術工業。所以目前工業生產一般都以微生物為主要來源，在千余種被使用的商品酶中，大多數都是利用微生物生產的。利用

5、微生物生產酶制劑，主要是因為微生物具有如下突出的優點:微生物種類繁多，酶的品種齊全，可以說一切動植物體內存在的酶幾乎都能從微生物中得到。微生物生長繁殖快、生產周期短、產最高。培養方法簡單，原料來源豐富，價格低廉，經濟效益高，并可以通過控制培養條件來提高酶的產量。微生物具有較強的適應性和應變能力，可以通過各種遺傳變異的手段，培育出新的高產菌株。所以，目前工業上應用的酶大多采用微生物發酵法來生產。三、酶的生產菌1.對菌種的要求利用微生物生產酶制劑，首先要獲得高產酶的優良菌種，然后用適當的方法進行培養和擴大繁殖，并積累大量的酶。這種有目的地利用微生物生產酶的方法稱為酶的發酵技術。雖然同一種酶，往往可

6、以從多種微生物中得到，但菌種性能的優劣、產量的高低，會直接影響到微生物發酵生產酶的成本，所以作為一個優良的產酶菌種應具備以下幾點要求:繁殖快、產酶量高，酶的性質應符合使用要求，而且最好是產生胞外酶的菌。不是致病菌，在系統發育上與病原體無關，也不產生有毒物質。這一點對醫藥和食品用酶尤為重要。產酶性能穩定，不易變異退化，不易感染噬菌體。能利用廉價的原料，發酵周期短，易于培養。2.生產菌的來源生產菌種可以從菌種保藏機構和有關研究部門獲得但大量的工作應該是從自然界中分離篩選。自然界是產酶菌種的主要來源，土壤、深海、溫泉、火山、森林等都是菌種采集地。篩選產酶菌的方法與其他發酵微生物的篩選方法基本一致，主

7、要包括以下幾個步驟菌樣采集、菌種的分離初篩、純化、復篩和生產性能鑒定等。為了提高酶的產量，在酶的生產過程中應不斷改良生產菌，主要應用遺傳學原理進行改良，其基本途徑有：基因突變、基因轉移和基因克隆。3.目前常用的產酶微生物大腸桿菌是應用最廣泛的產酶菌，一般分泌胞內酶，需經細胞破碎才能分離得到。由于其遺傳背景清楚還可被廣泛用于遺傳工程改造成為外來基因的宿主，而成為優良性狀的工程菌。 如工業上常用大腸桿菌生產谷氨酸脫羧酶、天冬氨酸酶、青霉素酰化酶、-半乳糖苷酶等。枯草桿菌是工業上應用最廣泛的產酶菌之一，主要用于發酵生產一淀粉酶、-葡萄糖氧化酶、堿性磷酸酯酶等。啤酒酵母是工業上廣泛應用的酵母，主要用于

8、生產啤酒、乙醇、飲料和面包，也用于生產轉化酶、丙酮酸脫羧酶、乙醇脫氫酶等。曲霉(黑曲霉和黃曲霉)可用于生產多種酶而在工業上被廣泛應用，如糖化酶、蛋白酶、淀粉酶、果膠酶、葡萄糖氧化酶、氨基酰化酶和脂肪酶等的生產。其他常用的產酶菌還有:主要用于生產葡萄糖氧化酶、青霉素酰化酶、5-磷酸二酯酶、脂肪酶等的青霉，主要用于生產纖維素酶的木霉，主要用于生產淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶的根霉，主要用于生產葡萄糖異構酶的鏈霉菌。微生物發酵法生產酶制劑是一個十分復雜的過程，由于具體的生產菌和目的酶不間，菌種的制備、發酵方法和條件、酶的分離提純方法也各不相同。四、酶在醫藥領域的應用1.在疾病診斷方面的使用疾病治療效果的

9、好壞，在很大程度上取決于診斷的準確性。疾病診斷的方法很多，其中酶學診斷發展迅速。由于酶催化的高效性和特異性，酶學診斷方法具有可靠、簡便又快捷的特點，在臨床診斷中已被廣泛使用。酶學診斷包括兩個方面：一是根據體內原有酶活力的變化來診斷某些疾病，如利用谷丙轉氨酶活力升高來診斷肝炎;二是用酶測定體液中某些物質的量診斷疾病. 如利用葡萄糖氧化酶測定血糖含量，診斷糖尿病等。2.在疾病治療方面的應用由于酶具有專一性和高效率的特點，所以在醫藥方面使用的酶具有種類多、用量少和純度高等特點。主要的醫藥用酶有：蛋白酶，主要用于消化不良和食欲不振等。溶菌酶，具有抗菌、 消炎、鎮痛等作用。超氧化物歧化酶，具有抗輻射作用

10、。L-天冬酰胺酶，用于治療白血病。尿激酶，具有溶血栓的活性。其他相關酶制劑，如細胞色素c等。3在藥物生產方面的應用酶在藥物制造方面的應用是利用酶的催化作用將前體物質轉變為藥物。這方面的應用日益增多。主要的應用有:利用青霉素酰化酶制造半合成青霉素和頭孢霉素、利用-酪氨酸酶制造多巴、利用核苷磷酸化酶生產阿糖腺苷、利用蛋白酶和羧肽酶將豬胰島素轉化為人胰島素等。4在分析檢測方面的應用用酶進行物質分析檢測的方法統稱為酶法檢測或酶法分析。酶法檢測是以酶的專一性為基礎、以酶作用后物質的變化為依據來進行的。根據酶反應的不間，酶法檢測可以分成單酶反應、 多酶偶聯反應和酶標免疫反應等三類。第二節酶和細胞的固定化酶

11、反應幾乎都是在水溶液中進行的，屬于均相反應。均相酶反應系統雖然簡便，但也有許多缺點，如溶液中的游離酶只能一次性地使用，不僅造成酶的浪費，而且會增加產品分離的難度和費用，影響產品的質量，另外溶液酶很不穩定，容易變性和失活。如能將酶制劑制成既能保持其原有的催化活性、性能穩定又不溶于水的固形物，即固定化酶，就可以像一般固定催化劑那樣使用和處理，大大提高酶的利用率。與固定化酶類似，細胞也能固定化。生物細胞雖屬固相催化劑，但因其顆粒微小難于截留或定位，也需固定化。固定化細胞既有細胞特性和生物催化的功能，還具有固相催化劑的特點。一、固定化酶的制備1.固定化酶的定義固定化酶是20世紀50年代開始發展起來的一

12、項新技術。最初主要是將水溶性酶與不溶性載體結合起來，成為不溶于水的酶的衍生物，所以也曾被稱為水不溶酶和固相酶。但是后來發現，也可以將酶包埋在凝膠內或置于超濾裝置中，高分子底物與酶在超濾膜一邊，而反應產物可以透過膜逸出，在這種情況下，酶本身仍是可溶的，只不過被固定在一個有限的空間內不再自由流動罷了。因此，用水不溶酶或固相酶的名稱就不恰當了 。在1971年第一屆國際酶工程會議上，正式建議采用固定化酶的名稱。所謂固定化酶，是指限制或固定于特定空間位置的酶，具體來說，是指經物理或化學方法處理，使酶變成不易隨水流失即運動受到限制，而又能發揮催化作用的酶制劑，制備固定化酶的過程稱為酶的固定化。固定化所采用

13、的酶，可以是經提取分離后得到的有一定純度的酶，也可以是結合在菌體(死細胞)或細胞碎片上的酶或酶系。2固定化酶的特點酶類可粗分為天然酶和修飾酶，固定化酶屬于修飾酶。在修飾酶中，除固定化酶外還包括經過化學修飾的酶和用分子生物學方法在分子水平上進行改良的酶等。固定他酶的最大特點是既具有生物催化劑的功能，又具有固相催化劑的特性。與天然酶相比，固定化酶具有下列優點 ：可以在較長時間內多次使用，而且在多數情況下，酶的穩定性提高。如固定化的葡萄糖異構酶，可以在6065oC條件下連續使用超過1000 h，固定化黃色短桿菌中的延胡索酸酶用于生產L一蘋果酸，連續反應4年，其活力仍保持不變，反應后，酶與底物和產物易

14、于分開，產物中無殘留酶，易于純化，產品質量高。反應條件易于控制，可實現轉化反應的連續化和自動控制。 酶的利用效率高，單位酶催化的底物量增加，用酶量減少，比水溶性酶更適合于多酶反應。與此同時，固定化酶也存在一些缺點：固定化時，酶活力有損失。增加了生產的成本，工廠初始投資大。只能用于可溶性底物，而且較適于小分子底物，對大分子底物不適宜。胞內酶必須經過酶的分離純化過程。與完整菌體相比不適宜用于多酶反應，特別是需要輔助因子的反應。3.酶的固定化方法與制備技術酶的固定化，就是通過載體等將酶限制或固定于特定的空間位置，使酶變成不易隨水流失即運動受到限制，而又能發揮催化作用的酶制劑，自20世紀60年代以來，

15、科學家一直就對酶和細胞的固定化技術進行研究，雖然具體的固定化方法達百種以上，但迄今為止，幾乎沒有一種固定化技術能普遍適用于每一種酶，應根據酶的應用目的和特性，來選擇其固定化方法。目前已建立的各種各樣的固定化方法，按所用的載體和操作方法的差異，一般可分為載體結合法、包埋法及交聯法三類，此外細胞固定化還有選擇性熱變性(熱處理）方法。酶和細胞的固定化方法的分類，如圖6-1所示。酶的固定化方法見圖6 - 2。(1)載體結合法載體結合法是將酶結合到不溶性載體上的一種固定化方法，根據結合形式的不同，可以分為物理吸附法、離子結合法和共價結合法等三種。物理吸附法。物理吸附法是用物理方法將酶吸附在不溶性載體上的

16、一種固定化方法，此類載體很多，無機載體有活性炭、多孔玻璃、酸性白土、漂白土、 高嶺石、氧化鋁、硅膠、膨潤土、羥基磷灰石、磷酸鈣、金屬氧化物等；天然高分子載體有淀粉、谷蛋白等，最近大孔樹脂、陶瓷等載體也已被應用；此外還有具有疏水基的載體(丁基或己基-葡聚糖凝膠)，它可以疏水性地吸附酶，以及以單寧作為配基的纖維素衍生物等載體。物理吸附法的優點在于操作簡單，可選用不同電荷和不同形狀的載體，固定化過程可與純化過程同時實現，酶失活后載體仍可再生，若能找到合適的載體，這是一種很好的方法;其缺點在于最適吸附酶量無規律可循，對不同載體和不同酶的吸附條件不同，吸附量與酶活力不一定呈平行關系，同時酶與載體之間結合

17、力不強，酶易于脫落，導致酶活力下降并污染產物。物理吸附法也能固定細胞，并有時能在研究此方法過程中開發出固定化細胞的優良載體。離子結合法。離子結合法是酶通過離子鍵結合于具有離子交換基的水不溶性載體上的固定化方法，此法的載體有多糖類離子交換劑和合成高分子離子交換樹脂，如DEAE-纖維素、Amberlite CG50、XE-97、IR-45和Dowex-50等。離子結合法的操作簡單，處理條件溫和，酶的高級結構和活性中心的氨基酸殘基不易被破壞，能得到酶活回收率較高的固定化酶。但是載體和酶的結合力比較弱，容易受緩沖液種類或pH的影響，在離子強度高的條件下進行反應時，往往會發生酶從載體上脫落的現象。離子結

18、合法也能用于微生物細胞的固定化，但是由于微生物在使用中會發生自溶，故用此法要得到穩定的固定化微生物比較困難。以上兩種方法均是利用載體表面性質作用將酶吸附于其表面的固定化方法。物理吸附法是將酶的水溶液與具有高度吸附能力的載體混合，然后洗去雜質和未吸附的酶即得固定化酶。物理吸附法中酶與載體結合力較弱，酶容易從載體上脫落，導致活力下降，故不常用；離子結合法是將解離狀態的酶溶液與離子交換劑混合后，洗去未吸附的酶和雜質即得固定化酶，此方法中離子交換劑的結合蛋白質能力較強.所以常被采用。影響載體吸附的因素較多，如溶液的pH 、離子強度、溫度、酶濃度及載體的比表面積等。 pH的影響在于對酶與載體電荷量的改變

19、，除少數情況外，酶通常在等電點時吸附量最大；離子強度對吸附作用的影響是復雜的，通常在低離子強度下吸附能力增強；溫度對酶的吸附影響是溫度升高吸附力增強，只是溫度太高會造成酶的失活；酶濃度與其吸附量有關系，在一定范圍內，單位重量吸附劑對酶的吸附量隨酶濃度的增加而增加，此外，酶吸附量與載體的比表面積和多孔性有關，當載體孔徑適當時，載體顆粒越小，比表面積就越大，因此吸附量越大，同時載體的預處理有時對某些酶的吸附也很重要，為保證有效吸附，載體需用緩沖液處理。共價結合法。共價結合法是酶以共價鍵結合于載體上的固定化方法，也就是使酶分子上非活性部位功能團與載體表面活潑基團之間發生化學反應而形成共價鍵的連接方法

20、。它是研究最廣泛、內容最豐富的固定化方法，歸納起來有兩類，一是將載體有關基團活化，然后與酶有關基團發生偶聯反應；另一類是在載體上接上一個雙功能試劑，然后將酶偶聯上去。其原理是酶分子上的功能團，如-氨基或-氨基，、或位的羧基、羥基、咪唑基，巰基、酚基等和載體表面的反應基團之間形成共價鍵，因而將酶固定在載體上。共價結合法有數十種，如重氮化、疊氮化、酸酐活化法、酰氯法、異硫氰酸酯法、縮合劑法、溴化氰活化法、烷基化及硅烷化法等。在共價結合法中，首先必須要使載體活化，使載體獲得能與酶分子的某一特定基因發生特異反應的活潑基 團；同時要考慮到酶蛋白上參與共價結合的氨基酸殘基不應是酶催化活性所必需的，否則往往

21、造成固定化后的酶活力完全喪失；另外，反應條件應盡可能溫和。共價結合法與離子結合法和物理吸附法相比，其優點是酶與載體結合牢固，穩定性好，一般不會因底物濃度高或存在鹽類等原因而輕易脫落。缺點是反應條件苛刻，操作復雜，而且由于采用了比較強烈的反應條件，會引起酶蛋白高級結構的變化，破壞部分活性中心，所以往往不能得到比活高的固定化酶，甚至底物的專一性等酶的性質也會發生變化。因此，在進行共價結合之前應先了解所用酶的有關性質，選擇適當的化學試劑，并嚴格控制反應條件，提高固定化酶的活力回收率和相對活力。在共價結合法中，載體的活化是個重要問題。目前用于載體活化的方法有酰基化、芳基化、烷基化及氨甲酰化反應等。盡管

22、共價結合法制備固定化酶的研究比較多，但因固定化操作煩瑣，酶的損失大，起始投資也大，所以在醫藥工業中應用的例子很少。(2)交聯法交聯法是用雙功能或多功能試劑使酶與酶或微生物的細胞與細胞之間交聯的固定化方法。常用的交聯劑有戊二醛、雙重氮聯苯胺-2,2-二磺酸、1,5-二氟-2,4-二硝基苯及己二酰亞胺二甲酯等。參與交聯反應的酶蛋白的功能團有N端的-氨基、賴氨酸的-氨基、酪氨酸的酚基、半胱氨酸的巰基及組氨酸的咪唑基等。以戊二醛為交聯劑的酶結合模式如圖6 - 2（b）所示。交聯法與共價結合法一樣也是利用共價鍵固定酶的，所不同的是它不使用載體。最常用的交聯劑是戊二醛，它的兩個醛基與酶分子的游離氨基反應形

23、成Schiff堿，彼此交聯，其方式如下交聯法又可分為交聯酶法、酶與輔助蛋白交聯法、吸附交聯法及載體交聯法4種。其內容有酶分子內交聯、分子間交聯或輔助蛋白與酶分子間交聯，也可以先將酶或細胞吸附于載體表面后 再交聯或者在酶與載體之間進行交聯。交聯酶法是向酶液中加入多功能試劑，在一定的條件下使酶分子內或分子間彼此連接成網絡結構而形成固定化酶的技術。反應速度與酶的濃度、試劑的濃度、pH、離子強度、溫度和反應時間有關，例如0.2%的木瓜蛋白酶和0.3%的戊二醛在pH 5. 27. 2，0oC時.24 h即完成反應，并且反應速度隨溫度的升高而增大。若pH低于4. 0，即使長時間反應也不能實現酶的固定化。酶

24、晶體也可以用交聯法實現固定化，但在交聯過程中酶容易失活。酶-輔助蛋白交聯法是指在酶熔液中加入輔助蛋白的交聯過程。輔助蛋白可以是明膠、膠原和動物血清蛋白等。此法可以制成酶膜或在混合后經低溫處理和預熱制成泡沫狀的共聚物，也可以制成多孔顆粒。酶-輔助蛋白交聯法的酶的活力回收率和機械強度都比交聯酶法高。吸附交聯法是吸附與交聯相結合的技術，其過程是先將酶吸附于載體上，再與交聯劑反應。吸附交聯法所制得的固定化酶稱為殼狀固定化酶。此法兼有吸附與交聯的雙重優點，既提高了固定化酶的機械強度，又提高了酶與載體的結合能力，酶分布于載體表面，與底物接觸容易。載體交聯法是指同一多功能試劑分子的一些化學基團與載體偶聯而另

25、一些化學基團與酶分子偶聯的方法。其過程是多功能試劑(如戊二醛)先與載體(氨乙基纖維素、部分水解的尼龍或其他含伯氨基的載體)偶聯，洗去多余的試劑后再與酶偶聯，如將葡萄糖氧化酶、丁烯- 3，4 -氧化物和丙烯酰胺共聚偶聯即可得到固定化的葡萄糖氧化酶。微囊包埋的酶也可以用戊二醛交聯使之穩定化。另外，交聯酶也可以再用包埋法來提高其穩定性并防止酶的脫落。交聯法的反應條件比較激烈，固定化酶的酶活回收率一般較低，但是盡可能降低交聯劑的濃度和縮短反應時間將有利于固定化酶比活的提高。一般用交聯法所得到的固定化酶顆粒小，結構性能差、酶活性低，故常與吸附法或包埋法聯合使用，如先用明膠(蛋白質)包埋，再用戊二醛交聯；

26、或先用尼龍(聚酰胺類)膜或活性炭、Fe2O3等吸附后再交聯。由于酶的功能團，如氨基、酚基、羧基、巰基等參與了反應，會引起酶活性中心結構的改變，導致酶活性下降。為了避免和減少這種影響，常在被交聯的酶溶液中添加一定量的輔助蛋白如牛血清白蛋白以提高固定化酶的穩定性。(3)包埋法包埋法可分為網格型和微囊型兩種。將酶或細胞包埋在高分子凝膠細微網格中的稱為網格型，將酶或細胞包埋在高分子半透膜中的稱為微囊型。包埋法一般不需要酶蛋白的氨基酸殘基參與反應，很少改變酶的高級結構，酶活回收率較高，因此可以應用于很多酶、微生物細胞和細胞器的固定化，但是在發生化學聚合反應時包埋酶容易失活，必須合理設計反應條件。包埋法只

27、適合作用于小分子底物和產物的酶，對于那些作用于大分子底物和產物的酶是不適合的，因為只有小分子才能通過高分子凝膠的網格進行擴散，另外這種擴散阻力會導致固定化酶動力學行為的 改變，降低酶活力。網格型。用于這種方法的載體材料有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光敏樹脂等合成高分子化合物，以及淀粉、明膠、膠原、海藻膠和角叉菜膠等天然高分子化合物。應用合成高分子化合物時，可以在聚合單體的產物聚合反應的同時實現包埋法固定化(如聚丙烯酰胺包埋法)，其過程向酶、混合單體及交聯劑緩沖液中加人催化劑，在單體產生聚合反應形成凝膠的同時，將酶限制于網格中，經破碎后即成為固定化酶。而應用天然高分子化合物時，其基本過程是先將凝膠材料

28、 (如卡拉膠、海藻膠、瓊脂及明膠等)與水混合，加熱使之溶解，再降至接近其凝固點的溫度，然后加入預保溫的酶液，混合均勻，最后冷卻凝固成型和破碎即成固定化酶。網格型包埋法是固定化細胞中用的最多、最有效的方法。用合成和天然高聚物凝膠包埋時可以通過調節凝膠材料的濃度來改變包埋率和固定化酶的機械強度，高聚物濃度越大，包埋率越高，固定化酶的機械強度就越大。為防止酶或細胞從固定化酶顆粒中滲漏，可以在包埋后再用交聯法使酶更牢固地保留于網格中。微囊型。由包埋法制得的微囊型固定化酶通常為直徑幾微米到幾百微米的球狀體，包有酶的微囊半透膜厚約20 nm，膜孔徑40 nm左右，其表面積與體積比很大，包埋酶量也多，顆粒比

29、網格型要小得多，比較有利于底物與產物的擴散，但是反應條件要求高，制備成本也高。其基本制備方法有界面沉降法及界面聚合法兩類。界面沉降法是物理法，是利用某些在水相和有機相界面上溶解度極低的高聚物成膜的過程將酶包理的方法。其基本過程必將酶液在與水不混溶的、沸點比水低的有機相中乳化，使用油溶性表面活性劑形成油包水的微滴，再將溶于有機溶劑的高聚物加入攪拌下的乳化液中，然后再加入另一種不能溶解高聚物的有機溶劑，使高聚物在油水界面上沉淀、析出及成膜。最后在乳化劑作用下使微囊從有機相中轉移至水相，即成為固定化酶。用于制備微囊的高聚物材料有硝酸纖維素、聚苯乙烯及聚甲基丙烯酸甲酯等，由于微囊化的反應條件溫和，在制

30、備過程中一般不會引起酶的變性，但要完全除去半透膜上殘留的有機溶劑卻不容易。界面聚合法是化學制備法，其基本原理是利用不濟于水的高聚物單體在油-水界面上聚合成膜的過程制備微囊。成膜的高聚物有尼龍、聚酰胺及聚脲等。現以尼龍610為例，其基本過程是將含酶的10%血紅蛋白溶液與己甲叉二胺水溶液混合，再傾入含有1% Span85的氯仿一環己烷中分散乳化，加入溶于有機相的癸二酰氯后，便在油-水界面上發生聚合反應，棄去上清后，加 入Tween20去乳化，洗去有機溶劑及未聚合的單體，將其轉移至水相中即得微囊。本法制備的微囊直徑一般在1300m之間，比表面積大，每毫升酶溶液可制得2500cm2總表面積的微囊。本法

31、制備的微囊的大小隨著乳化劑的濃度和乳化時的攪拌速度而變化，而且制備時間短。 用尼龍610構成的微囊的外觀比硝酸纖維素微囊要好，但不穩定，而且有些酶在化學反應過程中 容易失活。此外.近年來正在研究一種利用脂質體的包理方法，它是由表團活性劑和卵磷脂等形成液膜包埋酶的方法，其特征是底物或產物的膜透性不依賴于膜孔徑的大小，而只依賴于對膜成分的溶解度。纖維包埋法是將可形成纖維的高聚物溶于與水不混溶的有機溶劑中，再與酶溶液混合并乳化，然后將乳化液經噴頭擠入促凝劑(如甲苯及石油醚等）中形成纖維，即成為固定化酶，也稱為酶纖維，可以將酶纖維制成酶柱或酶布使用。酶纖維的比表面積大，酶的包埋量也大，每克聚合物可以包

32、埋1.5g轉化酶，并且酶的穩定性較好。但在操作過程中使用有機溶劑容易引起酶的失活。包埋法制備固定化酶的條件溫和，不改變酶的結構，操作時保護劑及穩定劑均不影響酶的包埋率，適用于多種酶、粗酶制劑、細胞器和細胞的固定化。但包埋的固定化酶只適用于小分子底物及小分子產物的轉化反應，不適于催化大分子底物或產物的反應，而且擴散阻力會導致酶的動力學行為發生改變而降低其活力。(4)選擇性熱變性法此法專用于細胞固定化，是將細胞在適當溫度下處理使細胞膜蛋白變性但不使酶變性而使酶固定于細胞內的方法。4.酶和細胞的固定化載體在酶的固定化過程中所用的水不溶性固體支持物稱為載體或基質。固定化載體種類很多，其來源、結構和性質

33、各不相同。因此在固定化過程中，需根據酶促反應性質、底物類型及固定化方法，選擇相應的載體或基質。固定化過程中使用的載體需符合如下條件:固定化過程中不引起酶變性。對酸堿有一定的耐受性。有一定的機械強度。有一定的親水性及良好的穩定性。有一定的疏松網狀結構，顆粒均勻。共價結合時具有可活化基因。有耐受酶和微生物細胞的能力。廉價易得。酶和細胞的固定化載體見表6 - 1。主要有以下三類.吸附載體。用于吸附法制備固定化酶，有物理吸附和離子吸附。物理吸附所用的載體有無機物和有機物。包埋載體。包埋法制備固定化酶或細胞的載體有卡拉膠等。目前，工業上應用的包埋載體主要為卡拉膠、海藻膠等。交聯載體。交聯法與吸附法和包埋

34、法所用的載體相同。二、固定化細胞的制備 1固定化細胞的定義將細胞限制或定位于特定空間位置的方法稱為細胞固定化技術。被限制或定位于特定空間位置的細胞稱為固定化細胞。它與固定化酶一起被稱為固定化生物催化劑。細胞固定化技術是酶固定化技術的發展，因此固定化細胞也稱為第二代固定化酶。固定化細胞主要是利用細胞內酶和酶系，它的實際應用比固定化酶更為普遍，發展的更加迅速，現在該技術已擴展至動植物細胞，甚至線粒體、葉綠體及微粒體等細胞器的固定化。細胞固定化技術的應用比固定化酶更為普 遍，已在醫藥、食品、化工、醫療診斷、農業、分析、環保、能源開發及理論研究等應用中取得了舉世矚目的成就。2.固定化細胞的特點生物細胞

35、雖屬固相催化劑，但因其顆粒小、難于截流或定位，也需固定化。固定化細胞既有 細胞特性，也有生物催化劑功能，又具有固相催化劑特點。其優點在于，無需進行酶的分離純化。細胞保持酶的原始狀態，固定化過程中酶的回收率高。細胞內酶比固定化酶穩定性更高。細胞內酶的輔因子可以自動再生。細胞本身含多酶體系，可催化一系列反應。抗污染能力強。同時，固定化細胞技術也有它的局限性：利用的僅是胞內酶，而細胞內多種酶的存在，會形成不需要的副產物。細胞膜、細胞壁和載體都存在著擴散限制作用。載體形成的孔隙大小影響高分子底物的通透性。但這些缺點并不影響它的實用價值。由于固定化細胞除具有固定化酶的特點外，還有其自身的優點，應用更為普

36、遍，對傳統發酵工藝的技術改造具有重要的影響。目前工業上己應用的固定化細胞有很多種，如固定化Ecoli 生產L-天冬氨酸或6-氨基青霉烷酸、固定化黃色短桿菌生產L-蘋果酸、固定化假單胞菌生產L-丙氨酸等。3.固定化細胞的制備技術細胞的固定化技術是酶的固定化技術的延伸，其制備方法和應用方法也基本相間，但細胞的固定化主要適用于胞內酶，要求底物和產物容易透過細胞膜，細胞內不存在產物分解系統及其他副反應，若存在副反應，應具有相應的消除措施。固定化細胞的制備方法有載體結合法、包埋法、交聯法及無載體法等。載體結合法。載體結合法是將細胞懸浮液直接與水不溶性的載體相結合的固定化方法。本法與吸附法制備固定化酶的原

37、理基本相同，所用的載體主要為陰離子交換樹脂、陰離子交換纖維素、多孔磚及聚氯乙烯等。其優點是操作簡單，符合細胞的生理條件，不影響細胞的生長及其 酶活性。缺點是吸附容量小，結合強度低。目前雖行采用有機材料與無機材料構成雜交結構的 載體，或將吸附的細胞通過交聯及共價結合來提高細胞與載體的結合強度，但吸附法在工業上尚未得到推廣應用。包埋法。將細胞定位于凝膠網格內的技術稱為包埋法，這是因定化細胞中應用最多的方法。常用的載體有卡拉膠、聚乙烯醇、瓊脂、明膠及海藻膠等，包埋細胞的操作方法與包埋酶法相 同，優點在于細胞容量大，操作簡便，酶的活力回收率高。缺點是擴散阻力大，容易改變酶的動 力學行為，不適于催化大分

38、子底物與產物的轉化反應。目前已有凝膠包埋的E. coli、黃色短桿菌 及玫瑰暗黃鏈霉菌等多種固定化細胞，并已實現6-APA、L-天冬氨酸、L-蘋果酸及果葡糖的工業化生產。交聯法。用多功能試劑對細胞進行交聯的固定化方法稱為交聯法。由于交聯法所用的 化學試劑的毒性能引起細胞破壞而損害細胞活性，如用戊二醛交聯的E. coli細胞，其天冬氨酸 酶的活力僅為原細胞活力的34.2% ，因此，工業生產中交聯法應用得也較少。無載體法。靠細胞自身的絮凝作用制備固定化細胞的技術稱為無載體法。本法是通過 助凝劑或選擇性熱變性的方法實現細胞的固定化，如含葡萄糖異構酶的鏈霉菌細胞經檸檬酸處 理，使酶保留在細胞內，再加絮

39、凝劑脫乙酰甲殼素，獲得的菌體干燥后即為固定化細胞，也可以在 60 對鏈霉茵加熱10 min，即得固定化細胞。無載體法的優點是可以獲得高密度的細胞，固定化條件溫和；缺點是機械強度差。三、固定化方法與載體的選擇依據 1固定化方法的選擇比較各種固定化方法的特點，可以為選擇合適的方法提供必要的依據。酶和細胞的固定化 方法很多。同一種酶或細胞采用不同的固定方法，制得的固定化酶或細胞的性質可能相似或相差 甚遠。不同的酶或細胞也可以采用同一種固定方法，制得不同性質的固定化生物催化劑，因此酶 和細胞的固定化方法沒有特定的規律可以遵循，需要根據具體情況和試驗摸索出具體可行的方 法。另外如果是為了工業化應用，還必

40、須考慮各種試劑和原材料的來源及價格，制備方法的繁簡等。所以選擇固定化方法時應考慮以下幾個因素。(1)固定化酶應用的安全性盡管固定化生物催化劑比化學催化劑更為安全，但也需要按照藥品和食品領域的檢驗標準 做必要的檢查。因為除了吸附法和幾種包埋法外，大多數固定化操作都涉及化學反應，必須了解 所用的試劑是否有毒性和殘留，應盡可能選擇無毒性試劑參與的固定化方法。(2)固定化酶在操作中的穩定性在選擇固定化的方法時要求固定化酶在操作過程中十分穩定，能長期反復使用，這樣才能在 經濟上有較強的競爭力。因此應考慮酶和載體的連接方式、連接鍵的多寡和單位裁體的酶活力， 從各方面進行權衡，選擇最佳的固定化方法，以制備穩

41、定性高的固定化酶或細胞。(3)固定化的成本固定化成本包括酶、載體和試劑的費用，也包括水、電、氣、設備及勞務投資，如酶、載體及試 劑價格較高，但由于固定化酶(細胞)能長期反復使用，提高了酶的利用效率，也比原工藝優越。 即使固定化成本不低于原工藝，而對原工藝有較大改進，或可簡化后處理工藝，提高產品質量和 收率，節省勞務，該固定化方法仍有實用價值。此外，固定化前成本通常僅占生產成本的極小部 分，在價格昂貴的藥品生產中，固定化酶對產品純度和收率的提高是非常有利的，因此仍需采用 固定化酶。當然，為了工業應用，應盡可能采用操作簡單，活力回收率及載體和試劑價格低廉 的固定化方法。2載體的選擇為了工業化應用，

42、最好選擇工業化生產中巳大量應用的廉價材料為載體，如聚乙烯醇、卡拉膠及海藻膠等。另外離子交換樹脂、金屬氧化物及不銹鋼碎屑等，也都是有應用前途的載體。載 體的選擇還需考慮底物的性質，當底物為大分子時，包埋型的載體不能用于轉化反應，只能用可溶性的固定化酶；若底物不完全溶解或黏度大，宜采用密度高的不銹鋼屑或陶瓷等材料制備吸附 型的固定化酶，以便實現轉化反應和回收固定化酶。四、固定化酶固定化細胞的形狀和性質1.固定化酶與固定化細胞的形狀由于應用目的和反應器類型的不同，所以需要 不同物理形狀的固定比酶。目前已有多種物 理形狀的固定化酶，如酶膜、酶管、酶纖維、微囊和顆粒狀的固定化酶，顆粒狀的固定化酶包括酶

43、珠、酶塊、酶片和酶粉等。固定化酶的物理形狀也與基質的性質和制備方法有關，不同的材料可 制成相同形狀的固定化酶，如卡拉膠、瓊脂和海藻膠，均可制成酶片或酶塊。同一種材料也可以 制成不同形狀的固定化酶，如海藻膠既可以制成酶片或酶塊，也可以制成酶珠。此外， 同一種方 法可以制造不同形狀的固定化酶，如包埋法既可制造酶珠，也可制造酶膠囊。不同的方法也可以 制造出相同形狀的固定化酶，如交聯法、吸附法和共價結合法均可以制造酶粉。因此制造何種形狀的固定化酶.需要根據底物和產物的性質、基質材料的性能、固定化的方法、酶反應的性質、反應器的類型和應用目的來決定。(l)顆粒狀固定化酶顆粒狀的固定化酶包括酶珠、酶塊、酶片

44、和酶粉等，每種固定化方法均可制備顆粒狀的固定化酶，制備方法簡單，顆粒比表面積大，轉化效率高，適用于各種類型的反應器。如海藻膠溶液和釀酒酵母的混合液經噴珠機壓入到CaCl2，溶液中即可制成固定化的酵母酶珠，可用于工業化中 乙醇的大規模生產。(2)纖維狀固定化酶某些材料，如三醋酸纖維素，用適當的溶劑溶解后與酶混合，再采用噴絲的方法就可制成酶 纖維。如將含酶的甘油水溶液滴入三醋酸纖維素的二氯甲烷溶液中，乳化后經噴絲頭噴入含丙酮的凝固液中即成為纖維狀，取出后真空干燥即得固定化酶。纖維狀固定化酶的比表面積大，轉 化效率高，但只適用于填充床反應器。此外，酶纖維也可以織成酶布用于填充床反應器。(3)膜狀固定

45、化酶膜狀固定化酶也稱為酶膜，可以通過共價結合法將酶偶聯到濾膜上制備，也可以將酶和某些 材料如火棉膠、硝酸纖維素、骨膠原和明膠等，用戊二醛交聯或其他方法處理后制成膜狀。酶膜 的表面積大，滲透阻力小，可用于酶電極，破碎后也可用于填充床反應器。目前已制備出本瓜酶、 葡萄糖氧化酶、過氧化物酶、氨基酰化酶和脲酶等多種酶膜。(4)管狀固定化酶管狀固定化酶稱為酶管，某些管狀載體如尼龍、聚氯苯乙烯和聚丙烯酰胺等，經活化后與酶 偶聯即得固定化酶管。如尼龍管用弱酸水解后釋放出氨基和羧基，用亞硝酸破壞其氨基，在碳二 亞胺的存在下，酶分子的氨基與載體的羧基縮合生成管狀的固定化酶，也可以將酶與經弱酸部分水解的尼龍管用戊

46、二醛交聯來制備酶管。目前已制備出糖化酶、轉化酶和脲酶等酶管，酶管在化 學分析中可用于連續測定，酶管的機械強度大，切短后可用于填充床反應器，也可以組裝成列管式反應器。細胞的固定化技術是酶的固定化技術的延伸，制備方法也基本相同，因此許多固定化細胞的 形狀與固定化酶的形狀相同，如珠狀、塊狀、片狀或纖維狀等。固定化細胞的方法主要是包埋法， 其次是交聯法或二者相結合的方法，用無載體法制備的是粉末狀的固定化細胞，工業上 應用最多的就是用包埋法制備的各種形狀的固定化細胞。2固定化酶的性質天然酶經過固定化后即成為固定化酶， 其催化反應體系也由均相反應轉變為非均相反應。由于固定化方法和所用載體的不同，制得的固定

47、化酶可能會受到擴散限制、空間障礙、微環境變化和化學修飾等因素的影響，可能會導致酶學性質和酶活力的變化。(l)酶活力的變化酶經過固定化后活力大都下降，其原因主要是：酶分子在固定化過程中，空間構象發生變 化，影響了活性中心的氨基酸。固定化后，由于空間位阻效應，影響了活性中心對底物的定位作用。內擴散阻力使底物分子與活性中心的接近受阻.包埋時酶被高分子物質半透膜包 圍，大分子物質不能透過膜與酶接近。要減少固定化過程酶活力的損失，反應條件要溫和。此 外，在固定化反應體系中加入仰制劑、底物或產物時以保護酶的活性中心。如在乳糖酶的固定化時，在其抑制劑葡萄糖酸-內酯的存在下進行聚丙烯酰胺凝膠的包埋，即可獲得高

48、活力的固 定化乳糖酶 ；又如包埋天冬氨酸酶時，在其底物(延胡索酸銨)或其產物(L-天冬氨酸)的符在下， 進行聚丙烯酰胺凝膠的包埋，也可以獲得高活力的固定化天冬氨酸酶。不過也有個別情況，酶在 固定化后反而比原酶活力提高，原因可能是偶聯過程中酶得到化學修飾，或固定化過程提高了酶的穩定性。(2)酶穩定性的變化固定化酶的穩定性包括對溫度、pH、蛋白酶變性劑和抑制劑的耐受程度。如蛋白酶經過固定化后，限制了酶分子之間的相互作用，阻止了其自溶，穩定性明顯增加。其他的酶經過固定化 后可以增加酶構型的牢固程度，因此穩定性提高。但是如果固定化的過程影響到酶的活性中心和酶的高級結構的敏感區域，也可能引起酶的活性降低

49、，不過大部分酶在固定化后，其穩定性和 有效壽命均比游離酶高。主要體現在以下幾個方面：(1)操作穩定性。固定化酶的操作穩定性是能否實際應用的關鍵因素。操作穩定性通常用 半衰期表示，固定化酶的活力下降為最初活力一半時所經歷的連續操作時間稱為平衰期。進行 長時間的實際操作是一種直接的觀察方法，但往往通過較短時間的操作便可以推算出半哀期，假 定活力損失和時間是呈指數關系，那么半衰期可按下式計算：t1/2 =0. 693/KD ;式中，KD為衰減系數，KD可按下式計算：KD= -2.303Lg(E/E0)/t 式中，E0為起始酶活力，E為時間t后殘留酶活力。固定化酶穩定性的測定過程必須注明測定和處理條件

50、，通常半衰期達1個月以上時，就具有 工業應用價值。貯藏穩定性。酶經過固定化后最好立即投入使用。否則活力會逐漸降低。若需長期貯存，可在貯存液中添加底物、產物、仰制劑和防腐劑等，并于低溫下放置。有些酶如果貯存適當， 可較長時問保存活力，如固定化的胰蛋白酶于20保存數月，其活力仍不減弱。熱穩定性。固定化酶的熱和定性反映了它對溫度的敏感程度，熱穩定性越高，工業化的 意義就越大。熱穩定性高可以提高反應溫度，進而提高反應速度，提高效率。許多酶如乳酸脫氫 酶和脲酶等，固定化后的熱穩定性均比游離酶高。此外，有些酶的不同存在形式或用不同的固定 化方法，其熱穩定性也不同，如游離的葡萄糖異構酶用多孔玻璃吸附后，在6

51、0下連續操作，其 半衰期為14.4d；但細胞內的葡萄塘異構酶用膠原固定后，于70連續操作，半衰期為50d。因此，要制備熱穩定性高的固定化酶，需要考慮多種因素。對蛋白酶的穩定性。大多數天然酶經固定化后對蛋白酶的耐受力有所提高，可能由于空間位阻效應使蛋白酶不能進入固定化酶顆粒的內部。如尼龍、聚脲膜、或聚丙烯酰胺凝膠包理 的固定化天冬脫胺酶對蛋白酶極為穩定，而在同樣條件下的游離酶幾于完全失活。因此，在工業生產中應用固定化酶是極為有利的。(3) 酶學特性的變化天然酶經過固定化后，許多特性如底物專一性、最適pH、最適溫度、動力學常數及最大反應 速度等，均可能發生變化。底物專一性。酶經過固定化后，由于位阻

52、效應，對高分子底物的活性明顯下降。如糖化酶用CM一纖維素疊氮衍生物固定化后，對于相對分子質量為8000的直鏈淀粉的水解活力為游離酶的77%，但相對分子質量為5X105的直鏈淀粉的水解活力僅為游離酶的15% 17% ， 反映了固定化酶的底物專一性有所改變。最適pH。經固定化后， 其反應的最適pH ，可能變大，也可能變小； pH-酶活曲線也可能發生改變， 其變化與酶蛋白和載體的帶電性質有關。在固定化酶的反應體系中，酶顆粒周圍存在著一個極薄的擴散層，帶電載體使固定化酶的微 環境中的帶電狀態不同于微環境以外的料液。帶負電荷的載體會使料液中的H+局部地集中于擴散層，使固定化酶微環境的pH低于其外側料液的

53、pH，為抵消這種影響，需提高料液的pH，才能使固定化酶達到最大的催化速度。所以帶負電荷的載體通常使固定化酶的最適pH向堿側偏移；反之，帶正電荷的載體則使固定化酶的最適 pH向酸側偏移；中性的載體通常不改變固定化 酶的最適pH。固定化酶的pH-酶活曲線與游離酶相比，或保持相間的鐘罩形，或變得更陡，或變得更平坦。最適溫度。酶經過同定化后可能導致其空間結構更為穩定，大多數酶經固定化后，最適溫度升高。如CM-纖維素共價結合的膜蛋白酶和糜蛋白酶的最適溫度比天然酶高5一 15；有些酶則不變或下降，如多孔玻璃共價結合的葡萄糖異構酶和亮氨酸氨肽酶的最適溫度與游離酶一樣。米氏常數(Km)。Km值是表示酶和底物的

54、親和力大小的客觀指標。天然酶經固定化后。其Km值均發生變化，有的增加很少，有的增加很多，但Km值不會變小，Km值變化的幅度視具體情況而定，當底物為大分子時，如果對酶采用包埋法固定，則Km值增加較大，若底物為小分F子時，Km變化甚微，例如凝膠包埋法制備的固定化葡萄糖異構酶的Km 值變化不大。最大反應速度(Vmax)。大多數的天然酶經間定化后，其Vmax與天然酶相同或相近，但也有由于固定化方法的不同而有差異者。如多孔玻璃共價結合的轉化酶，其Vmax與天然酶相同；但用聚丙烯酰胺包埋的轉化酶，其Vmax比天然酶小10%。3固定化細胞的性質細胞被固定化后，其中酶的性質、穩定性、最適pH，最適溫度和Km值

55、的變化基本上與固定化酶相仿。細胞的固定化主要是利用胞內酶，因此固定化的細胞主要用于催化小分子底物的反 應，而不適于大分子底物。無論采用哪種固定化方法，都需采用適當的措施來提高細胞膜的通透性，以提高酶的活力和轉化效率。細胞經過固定化后最適pH的變化無特定規律，如聚丙烯酰胺凝膠包埋的E. coli (含天冬氨酸酶)和產氨的短桿菌(含延胡索酸酶)的最適pH分別與游離的細胞相比，均向酸側偏移；但用同一方法方法包埋的無色短桿菌(含L-組氨酸脫氨酶)、惡臭假單胞菌（含-精氨酸脫亞胺酶）和 E. coliC（含青霉素酰胺酶)的最適pH均無變化。因此，可選擇適當的固定化方法處理相應的細 胞，使其最適pH符合反

56、應要求。細胞被固定化后，最適溫度通常與游離細胞相同，如用聚丙烯酰胺疑膠包埋的E.coli (含天冬氨酸酶、青霉素酰胺酶)和液體無色桿菌（含L-組氨酸脫氨酶)，最適溫度和游離細胞相同，但用同一種方法包理的惡臭假單胞菌(含L-精氨酸脫亞胺酶)的最適溫度卻提高20。固定化細胞的穩定性一般都比游離細胞高，如含天冬氨酸酶的E. coli經三醋酸纖維素包理后，用于生產L-Asp，于37 連續運轉兩年后，仍保持原活力的97%；用卡拉膠包埋的黃色短桿菌（含延胡索酸酶)生產L一蘋果酸，在37 (連續運轉一年后，其活力仍保持不變。由此可見，細 胞的固定化具有廣闊的工業應用前景。五、評價固定化酶(細胞)的指標1.固

57、定化酶(細胞)活力的測定在酶促反應過程中，因反應性質的差異，酶活力的測定方法不完全一樣，但都是用在單位時間內，單位體積中的底物減少量或產物增加量來表示的。通常在酶促反應中，如底物或產物具有光吸收、旋光、電位差或熒光等性質的變化，可以進行直接測定。如某些脫氧酶的反應過程，要求有NAD+或NADP-參與，NAD+和NADP-在340 nm處的消光系數很小，而NADH和NADPH在340 nm處的消光系數較大，因此可以根據反應過程中在340 nm處的光吸收的變化來確定NADH或NADPH的變化量，從而計算出酶活力。對于某些不能通過底物或產物的變化是來測定其活力的酶促反應，也可通過與其產物相偶聯的酶促

58、反應來測定其活力，即使第一個酶促反應的產物成為第二個酶促反應的底物，如：因此，也可通過在340nm處的光吸收的增加來測定己糖激酶的活力。此外，為了便于觀察，也可以根據某些能直接或間接產生有色化合物的偶聯反應進行測定。如某些氧化酶的酶促反應過程中，可利用過氧化物酶和某些色素反應的偶聯作用，通過它們所 產生的紅色化合物在500nm處的最大吸收變化來確定酶的活力。固定化酶通常為顆粒狀態，傳統的溶液酶的測定方法需要作一些改進。固定化酶具有兩個基本反應系統，即填充床反應系統和懸浮攪拌反應系統。因此，根據固定化酶的反應系統，其活力的測定可以分為分批測定法和連續測定法兩種。分批測定法。分批測定法是固定化酶在

59、攪拌或振蕩的情況下進行測定的方法，與測定天然酶的方法基本一致，即間隔一定時間取樣，過濾后按常規測定，方法比較簡便。但測定結果與反應器的形狀、大小和反應液的數量有關，同時也與攪拌和振蕩的速度有關，速度加快，活力上升，達到一定程度后活力不再改變，但若攪拌過快會導致固定化酶破碎成更小的細粒而使酶的活力升高，因此測定過程中應嚴格控制反應條件。連續測定法。不管是分批反應器、連續攪拌反應器或填充床反應器，都可以從其中引出 反應液到流動比色杯中進行分光測定。在連續流反應器中，可以根據底物的流入速度和反應速度之間的關系來計算酶的活力，但反應器的形狀可能影響反應速度。除分光法外，也可以在緩沖能力弱的情況下用自動

60、pH滴定儀來測定質子的產生和消耗過程，或者測定反應過程中氧氣、 NH4+ 、電導和旋光的變化來確定酶的活力。影響酶活力測定的因素較多，如測定環境、pH、溫度、離子強度、酶濃度、激活劑、振蕩和攪拌速度以及固定化酶的顆粒大小的變化均影響酶活力的測定。此外，對于帶電載體制備的固定化酶和反應過程中發生質子變化的固定化酶，靜電作用也影響其酶的活力，為抵消靜電作用的影響，測定系統需要有較高的離子強度。因此，在酶活力的測定過程中，為了確保可比性，必須控制反應條件的一致。在實際應用中，固定化酶不一定在底物飽和的條件下反應，因此測定條件應盡可能與實際I工藝相同，這樣才能對整個工藝過程進行估價，否則無可比性。2.