1、實驗二大腸菌群的檢驗1 大腸菌群的定義大腸菌群的定義 大腸菌群系指一群能發酵乳糖、產酸產氣、需氧和兼 性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。 大腸菌群不是細菌學上的分類命名，而是根據衛生學 方面的要求，提出的與糞便污染有關的細菌，即作為 食品、水體等是否受過人畜糞便污染的指示菌，這些 細菌在生化及血清學方面并非完全一致。根據進一步 的生化試驗，可將這群細菌再分為大腸艾希氏菌（俗 稱大腸桿菌）、弗氏檸檬酸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和 陰溝腸桿菌等。 實驗二大腸菌群的檢驗2 大腸桿菌的定義大腸桿菌的定義 大腸桿菌（也稱大腸埃希氏菌），分類于腸桿菌科， 歸屬于埃希氏菌屬。 大腸桿菌指革蘭氏陰性無芽孢桿菌、乳糖發酵

2、產酸產 氣、IMViC試驗（靛基質、MR、V-P、檸檬酸鹽試驗） 為+-或-+-的細菌。 與人類有關的大腸桿菌統稱為致瀉性大腸桿菌，包括 五種：腸毒素性大腸桿菌（ETEC）、致病性大腸桿菌 （EPEC）、出血性大腸桿菌（EHEC）、侵襲性大腸 桿菌（EIEC）、黏附性大腸桿菌（EAEC）。 實驗二大腸菌群的檢驗3 大腸菌群和大腸桿菌的關系大腸菌群和大腸桿菌的關系 實驗二大腸菌群的檢驗4 衛生學意義 大腸菌群和大腸桿菌是評價衛生質量的重要指標，作為食品中的糞 便污染指標。 食品中檢出大腸菌群，表明該食品有糞便污染，既可能有腸道致病 菌存在，因而也就有可能通過污染的食品引起腸道傳染病的流行。 大腸

3、菌群數的高低，表明了糞便污染的程度，也反映了對人體健康 危害性的大小。 大腸桿菌在外界存活時間與一些主要腸道致病菌接近，它的出現預 示著某些腸道病原菌的存在，因此該菌是國際上公認的衛生監測指 示菌。近年來，有些國家在執行HACCP管理中，將大腸桿菌檢測 作為微生物污染狀況的監測指標和HACCP實施效果的評估指標。 實驗二大腸菌群的檢驗5 大腸桿菌的生物學特性 基本形態： 此菌為兩端鈍圓的短小桿菌，一般約 0.5-0.8m*1.0-3.0 m，多單獨存在或 成雙，但不呈長鏈排列。約50%的菌株 有周生鞭毛，但多數只有1-4根，一般 不超過10根，故菌體動力弱。多數菌株 有菌毛，有的有莢膜或微莢膜

4、，不形成 芽孢，對普通堿性染料著色良好，革蘭 氏染色陰性。 實驗二大腸菌群的檢驗6 大腸桿菌的生物學特性 培養特性： 大腸桿菌合成代謝能力強，在含無機鹽、銨鹽、葡萄糖的普通培 養基上生長良好。最適生長溫度為37，在42-44 條件下仍能 生長，生長溫度范圍15-46 。 l 在普通營養瓊脂上有3種菌落形態： 1）光滑型：菌落邊緣整齊，表面有光澤、濕潤、 光滑、呈灰色，在生理鹽水中易分散； 2）粗糙型：菌落扁平、干澀、邊緣不整齊，易 在生理鹽水中自凝； 3）黏液型：常為含有莢膜的菌株。 實驗二大腸菌群的檢驗7 大腸菌群及大腸桿菌測定 MPN法檢驗流程（FDA BAM） 檢樣50g+450ml稀釋

5、液 適當十倍稀釋樣品 選擇3個適宜的連續稀釋度的樣品稀釋液， 每個稀釋度接種三管LST肉湯（每管9ml LST肉湯并加有導管）， 每管接種1mL 35 ，24 2h 48 2h 沒有產氣管 有產氣管 報告陰性 接種BGLB肉湯管 接種EC肉湯 35 ，48 2h 44.50.5 （水浴培養） 24 2h 48 2h 查MPN表報告結果 產氣管接種EMB平板（35、1824h） （大腸菌群） 從EMB平板上挑取5個可疑菌轉接到PCA斜 面，進行革蘭氏染色、IMVC生化鑒定、接 種LST復檢產氣 查MPN表報告結果（大腸桿菌） 實驗二大腸菌群的檢驗8 大腸菌群測定MPN法檢驗幾點說明 MPNMPN

6、檢索表：檢索表： MPN 為最大可能數(Most Probable Number)的簡稱。這種方法，對樣品進行連續系列稀釋， 加入培養基進行培養，從規定的反應呈陽性管數的出現率，用概率論來推算樣品中菌數最近 似的數值。MPN檢索表只給了三個稀釋度，如改用不同的稀釋度，則表內數字應相應降低或增 加10倍。 初發酵和證實試驗：初發酵和證實試驗： 1）兩步法進行了兩次乳糖發酵試驗。初發酵和證實實驗所用培養基不同，但都是為了證實培 養物是否符合大腸菌群的定義，即“在37分解乳糖產酸產氣”。 LST中提供了磷酸鹽緩沖 體系，氯化鈉可維持滲透壓，月桂基硫酸鈉可抑制非大腸菌群的生長，這個緩沖蛋白胨乳糖 肉湯

7、允許“緩慢乳糖發酵（Slow lactose fermentations）”來促進菌體產氣。BGLB中膽鹽和 煌綠可以抑制革蘭氏陽性細菌和除了大腸菌群的很多革蘭氏陰性細菌。 2）初發酵陽性管，不能肯定就是大腸菌群細菌，經過證實試驗后，有時可能成為陰性。有數 據表明，食品中大腸菌群檢驗步驟的符合率，初發酵與證實試驗相差較大。因此，在實際檢 測工作中，證實試驗是必需的。 產氣量與倒管：產氣量與倒管： 在乳糖發酵試驗工作中，經常可以看到在發酵倒管內極微少的氣泡（有時比小米粒還小）， 有時可以遇到在初發酵時產酸或沿管壁有緩緩上浮的小氣泡。實驗表明，大腸菌群的產氣量， 多者可以使發酵倒管全部充滿氣體，少

8、者可以產生比小米粒還小的氣泡。如果對產酸但未產 氣的乳糖發酵如有疑問時，可以用手輕輕打動試管，如有氣泡沿管壁上浮，即應考慮可能有 氣體產生，而應作進一步試驗。 實驗二大腸菌群的檢驗9 大腸桿菌測定EMB選擇性分離鑒別 EMB平板典型大腸桿 菌菌落特征： 中心黑色或紫紅色，有 或無綠色金屬光澤 實驗二大腸菌群的檢驗10 大腸桿菌測定EMB選擇性分離鑒別 EMB是一種弱選擇性培養基，一些球 菌也可在該培養基上生長； 高壓滅菌可使得美藍還原從而使培養 基的顏色呈不均一橘黃色，輕輕搖動 培養基可以恢復原有的正常紫色，傾 注平板前應先搖勻； 大腸桿菌在該培養基上并不一定總是 呈現綠色的金屬光澤； 該培養

9、基受可見光易使其中的成分氧 化，儲存及培養細菌時都應在避光條 件。 菌名菌落形態 大腸埃希氏菌 紫黑色，有綠色 金屬光澤 肺炎克雷伯氏菌粉色，中心色深 陰溝腸桿菌粉色，中心色深 弗氏志賀氏菌無色 鼠傷寒沙門氏菌 無色 糞鏈球菌無色 實驗二大腸菌群的檢驗11 大腸桿菌測定革蘭氏染色 基本原理： 革蘭氏染色法是細菌學中廣泛使用的一種重要的鑒別染色法。 1884年由丹麥醫師Gram創立。此法可將細菌分為革蘭氏陰性菌 和革蘭氏陽性菌兩大類。 革蘭氏染色的機理主要是利用兩類細菌的細胞壁成分和結構 的不同。革蘭氏陰性菌的細胞壁中含有較多的類脂質，而肽聚糖 的含量較少。當用酒精或丙酮酸脫色時，類脂質被溶解，

10、增加了 細胞壁的通透性，使初染后的結晶紫和碘的復合物易于滲出，結 果細胞被脫色，經復染后，又染上復染液的顏色。而革蘭氏陽性 菌細胞壁中肽聚糖的含量多而且交聯度大，類脂質含量少，經乙 醇或丙酮洗脫后，肽聚糖層的孔徑變小，通透性降低，因此細胞 仍保留初染時的顏色。 實驗二大腸菌群的檢驗12 大腸桿菌測定革蘭氏染色 基本步驟： 將涂片在火焰上固定，滴加結晶紫染液， 染1min，水洗； 滴加革蘭氏碘液，作用1min，水洗； 滴加95%乙醇脫色約1530s,直至染色 液被洗掉，不要過分脫色，水洗； 滴加番紅復染液，復染1min，水洗、待 干、鏡檢。 結果：革蘭氏陽性菌呈，革蘭氏陰 性菌呈。 實驗二大腸菌

11、群的檢驗13 大腸桿菌測定生化鑒定 Testpositivenegativebiotype1biotype2reagent Indole紅色環不變色+-Kovacs MR紅色不變色+甲基紅 V-P玫瑰紅 色環 不變色-V-P甲、 乙液 Citrate生長不生長- 實驗二大腸菌群的檢驗14 實驗二實驗二大腸菌群的檢驗大腸菌群的檢驗 一、實驗目的一、實驗目的 1、學習食品中大腸菌群檢測程序、方法；、學習食品中大腸菌群檢測程序、方法； 2、掌握食品中大腸菌群檢測結果的報告方式。、掌握食品中大腸菌群檢測結果的報告方式。 二、實驗材料二、實驗材料 1、設備和材料、設備和材料 溫箱、水浴鍋、天平、顯微鏡、

12、均質器或乳缽、溫度計、溫箱、水浴鍋、天平、顯微鏡、均質器或乳缽、溫度計、 平皿、試管、發酵管、吸管、載玻片、接種針平皿、試管、發酵管、吸管、載玻片、接種針 2、培養基及試劑、培養基及試劑 乳糖乳糖膽鹽發酵管、乳糖發酵管、蛋白胨水、靛基質試劑、膽鹽發酵管、乳糖發酵管、蛋白胨水、靛基質試劑、 麥康凱、伊紅美藍瓊脂（麥康凱、伊紅美藍瓊脂（EMB）、革蘭氏染色液）、革蘭氏染色液 實驗二大腸菌群的檢驗15 GB4789.3-2010 大腸菌群計數 實驗二大腸菌群的檢驗16 GB4789.3-2010 大腸菌群計數 實驗二大腸菌群的檢驗17 實驗二大腸菌群的檢驗18 （一）最先準備的器材（一）最先準備的器

13、材 規格名稱 數量 用途 1、500ml三角瓶 1個 稀釋樣品 2、250ml三角瓶 1個 制EMB瓊脂 3、18180mm試管 9支 單料乳糖膽鹽發酵管 4、18180mm試管 3支 稀釋樣品（9ml） 5、1ml移液管 5 支 6、10ml移液管 3 支 7、直徑為90mm平皿 2套制EMB平板 8、250ml量筒 1支 9、玻璃珠：直徑約5mm （二）應滅菌消毒的器材（二）應滅菌消毒的器材 剪刀1把不銹鋼藥匙1把 滴管膠頭5只稱量紙適量 實驗二大腸菌群的檢驗19 （三）應制備的培養基（三）應制備的培養基 培養基 總量 所用容器 l蒸餾水 225ml 500ml三角瓶 l蒸餾水 9ml/

14、3支 27ml 18180mm試管（稀釋樣品） l乳糖膽鹽發酵管（單料）： 10ml/ 9支 100ml18180mm試管(裝杜氏小管 ) lEMB瓊脂： 1瓶 150ml 250ml三角瓶（每 組配一瓶） 實驗二大腸菌群的檢驗20 蛋白胨20g、膽鹽5g、乳糖10g、0.4%溴甲酚紫乙醇溶液25ml、 蒸餾水1000ml（將蛋白胨、膽鹽及乳糖溶于水中，校正PH值 至7.4，加入指示劑）；或購買制好的乳糖膽鹽發酵培養基、 按說明配置。分裝試管，每管10ml，并放入一個到氣管（杜氏 小管），高壓滅菌115、15分鐘。 雙料乳糖膽鹽發酵培養基除蒸餾水外，其它成分加倍。 乳糖膽鹽發酵培養基：乳糖膽鹽

15、發酵培養基：P99 實驗二大腸菌群的檢驗21 A.1 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯）肉湯 A.1.1 成分成分 胰蛋白胨或胰酪胨 20.0 g 氯化鈉 5.0 g 乳糖 5.0 g 磷酸氫二鉀（K2HPO4） 2.75 g 磷酸二氫鉀（KH2PO4） 2.75 g 月桂基硫酸鈉 0.1 g 蒸餾水 1 000 mL pH 6.80.2 A.1.2 制法制法 將上述成分溶解于蒸餾水中，調節 pH。分裝到有玻璃小倒管的試管 中，每管10 mL。121 高壓滅菌15 min。 實驗二大腸菌群的檢驗22 A.2 A.2 煌綠乳糖膽鹽（煌綠乳糖膽鹽（BGLBBGLB）肉湯）肉

16、湯 A.2.1 A.2.1 成分成分 蛋白胨 10.0 g 乳糖 10.0 g 牛膽粉（oxgall或oxbile）溶液 200 mL 0.1%煌綠水溶液 13.3 mL 蒸餾水 800 mL pH 7.20.1 A.2.2 A.2.2 制法制法 將蛋白胨、乳糖溶于約500 mL蒸餾水中，加入牛膽粉溶液200 mL（將20.0 g脫水牛膽粉溶于200 mL蒸餾水中，調節pH至7.07.5），用蒸餾水稀釋到 975 mL，調節pH，再加入0.1%煌綠水溶液13.3 mL，用蒸餾水補足到1 000 mL，用棉花過濾后，分裝到有玻璃小倒管的試管中，每管10 mL。121 高 壓滅菌15 min。 實

17、驗二大腸菌群的檢驗23 A.3 結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA） A.3.1 成分 蛋白胨 7.0 g 酵母膏 3.0 g 乳糖 10.0 g 氯化鈉 5.0 g 膽鹽或3號膽鹽 1.5 g 中性紅 0.03 g 結晶紫 0.002 g 瓊脂 15 g18 g 蒸餾水 1 000 mL pH 7.40.1 A.3.2 制法 將上述成分溶于蒸餾水中，靜置幾分鐘，充分攪拌，調節 pH。煮沸2 min，將培養基冷卻至45 50 傾注平板。使用前臨時制備，不得超過3 h。 實驗二大腸菌群的檢驗24 蛋白胨 10.0g 乳糖 10.0g 磷酸氫二鉀 2.0g 瓊脂 15.0g 伊紅 0.4g 美藍0.0

18、65g 或20ml 伊紅 (20g /L)和 10ml 美藍(6.5 g /L) 蒸餾水 1000.0mL 最終pH7.10.2 (25) 先將蒸餾水中加入磷酸氫二鉀及蛋白胨、乳糖使之溶解，后 加瓊脂加熱溶解，再調pH=7.2-7.4,再加入伊紅,美藍水溶液, 高壓滅菌115、15分鐘。 蛋白胨提供細菌生長發育所需的氮源、維生素和氨基酸，乳糖提供發酵 所需的碳源，磷酸氫二鉀維持緩沖體系，伊紅Y和美藍抑制絕大部分革蘭 氏陽性菌的生長。瓊脂是凝固劑。 大腸桿菌在EMB上發酵乳糖，形成黑色菌落，大部分有金屬光澤。沙門 氏菌形成無色菌落。金黃色葡萄球菌基本上不生長。 EMB（伊紅美藍瓊脂）（伊紅美藍瓊

19、脂） 實驗二大腸菌群的檢驗25 質控：質控： 此培養基呈紫色，可有細微沉淀。質此培養基呈紫色，可有細微沉淀。質 控菌株接種后，控菌株接種后，3535培養培養18182424小時，小時， 觀察結果應如下表所示：觀察結果應如下表所示： 菌株 菌號 生長情況 菌落 產氣腸桿菌 ATCC 13048 好 粉紅，無光澤 大腸埃希氏菌 ATCC 25922 好，極好 有紫綠金屬光澤中心 肺炎克雷伯氏菌 ATCC 13883 好 綠金屬光澤，有黑心 奇異變形桿菌 ATCC 25933 好，極好 無色 鼠傷寒沙門氏菌 ATCC 14028 好，極好 無色 金黃色葡萄球菌 ATCC 25923 被抑制 實驗二大

20、腸菌群的檢驗26 說明： （1）伊紅又稱署紅或四溴熒光素，為酸性染料。美藍又稱亞甲藍，為堿 性染料。當大腸桿菌分解乳糖產酸時，細菌帶正電荷，染上紅色，再與美藍 結合而形成紫黑色菌落，并有綠色金屬光澤。二者除了作為指示劑外，還有 抑制格蘭氏陽性菌的作用。 （2）在堿性環境中，不分解乳糖產酸的細菌不著色。伊紅、美藍不能結 合，故沙門氏菌和志賀氏菌等為無色或琥珀色半透明菌落。 （3）此培養基用于鑒別大腸桿菌及產氣桿菌，并可快速鑒定白色念珠菌 及鑒定凝固酶陽性葡萄球菌。美國公共衛生協會和美國細菌協會推薦，用于 增殖或鑒別大腸桿菌的檢查。但某些沙門氏菌、志賀氏菌可被抑制。培養基 保存應注意避光防止氧化。

21、 實驗二大腸菌群的檢驗27 樣品 1.酸奶1 2.鮮奶 3.水樣1 4.水樣2 5.水樣3 6.水樣4 7.水樣5 8.酸奶2 實驗二大腸菌群的檢驗28 A1組組 酸奶1 A2A2組組 水樣1 A3組組 水樣2 A4組組 水樣3 實驗二大腸菌群的檢驗29 B1B1組組 鮮奶 B2B2組組 水樣4 B3B3組組 水樣5 B4組組 酸奶2 實驗二大腸菌群的檢驗30 三、實驗方法與三、實驗方法與步驟步驟 1、采樣及稀釋、采樣及稀釋 以無菌操作將檢樣以無菌操作將檢樣25g（或（或25ml）放于含有）放于含有225ml滅菌生理滅菌生理 鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶內（瓶內預置適當數量的玻璃鹽水或其他稀釋

22、液的滅菌玻璃瓶內（瓶內預置適當數量的玻璃 珠）或滅菌乳缽內，經充分振搖或研磨做成珠）或滅菌乳缽內，經充分振搖或研磨做成1：10的均勻稀釋的均勻稀釋 液。固體檢樣最好用無菌均質器，以液。固體檢樣最好用無菌均質器，以800r/min1000r/min的的 速度處理速度處理1min，做成，做成1：10的稀釋液。的稀釋液。 用用1ml滅菌吸管吸取滅菌吸管吸取1：10稀釋液稀釋液1ml，注入含有，注入含有9ml滅菌生滅菌生 理鹽水或其他稀釋液的試管內，振搖混勻，做成理鹽水或其他稀釋液的試管內，振搖混勻，做成1：100的稀釋的稀釋 液，換用液，換用1支支1ml滅菌吸管，按上述操作依次作滅菌吸管，按上述操作

23、依次作10倍遞增稀釋倍遞增稀釋 液液 實驗二大腸菌群的檢驗31 2. 乳糖初發酵試驗乳糖初發酵試驗 即通常所說的假定試驗。其目的在于檢查樣品中有無發即通常所說的假定試驗。其目的在于檢查樣品中有無發 酵乳糖產生氣體的細菌。酵乳糖產生氣體的細菌。 將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發酵管內，接種量在將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發酵管內，接種量在1ml以上以上 者，用雙料乳糖膽鹽發酵管；者，用雙料乳糖膽鹽發酵管；1ml及及1ml以下者，用單料乳糖以下者，用單料乳糖 發酵管。每一個稀釋度接種發酵管。每一個稀釋度接種3管，置（管，置（361）0C溫箱內，培溫箱內，培 養（養（242）h，如所有乳糖膽鹽發酵管都不產氣，

24、則可報告，如所有乳糖膽鹽發酵管都不產氣，則可報告 為大腸菌群陰性，如有產生者，則按下列程續進行為大腸菌群陰性，如有產生者，則按下列程續進行 根據食品衛生要求或對檢驗樣品污染情況估計，選擇三根據食品衛生要求或對檢驗樣品污染情況估計，選擇三 個稀釋度，每個稀釋度接種個稀釋度，每個稀釋度接種3管。也可直接用樣品接種。管。也可直接用樣品接種。 10， 100, 1000 倍稀釋（倍稀釋（-1，-2，-3） 實驗二大腸菌群的檢驗32 3.分離培養分離培養（10倍稀釋倍稀釋） 將產氣的發酵管分別轉種在伊紅美藍瓊脂板或麥康凱瓊將產氣的發酵管分別轉種在伊紅美藍瓊脂板或麥康凱瓊 脂平板上，置（脂平板上，置（361）0C溫箱內，培養溫箱內，培養18h24h，然后取出，然后取出， 觀察菌落形態并作革蘭氏染色鏡檢和復發酵試驗。觀察菌落形態并作革蘭氏染色鏡檢和復發酵試驗。 4.乳糖復發酵試驗乳糖復發酵試驗 即通常所說的證實試驗，其目的在于證明從乳糖初酵管即通常所說的證實試驗，其目的在于證明從乳糖初酵管 試驗呈陽性反應的試管內分離到的革蘭氏陰性無芽胞桿菌，試