1、淺談rnai干擾及其在植物轉基因研究中的應用彀鬣淺談rnai干擾及其在植物轉基因研究中的應用鄧祖麗穎(鄭州幼兒師范校)【摘要】本文綜述了ra干擾技術(rnai)中sirna和microrna介導的干擾作用機制和植物rnai表達載體的構建rnai現象有著復雜的機理和過程,這對其在植物轉基因中的應用造成了諸多不便如何構建一個高效的rnai表達載體,對轉基因植物中產生rnai的效率非常重要.【關鍵詞】rna干擾sirnamicrorna轉基因植物rna干擾現象(rnainterference,簡稱”rnai”】是指內源或外源雙鏈rna(dsrna)被特異的核酸酶降解后產生的干擾小rna能夠與同源的目

2、標(靶)rna結合,下調或者抑制基因表達,引起靶基因沉默,使其相應的表型功能發生缺失的轉錄后基因沉默現象(p0sttranscriptionalgenesileneing,簡稱”ptgs”).最早,人們僅在矮牽牛和少數幾種植物中發現這種基因沉默現象,但是目前發現在動,植物中都會發生.研究表明在植物抵抗病毒感染,轉座子沉默機制中也會發生rna干擾現象.目前在基因功能的研究中,該技術成為研究某個基因沉默表達的有效工具.rna干擾過程是一個由dsrna誘導的多因素參與的過程,其中smallrna(指sirna和mirna)發揮著核心作用.本文從rna干擾機制方面,探討了其在轉基因植物中的應用,旨在為

3、該技術在轉基因中的應用提供借鑒.一,rna干擾機制目前,rna干擾作用機制的研究主要包括通過sirna介導的目標mr.na降解和mirna介導的翻譯水平的調節引起的基因沉默現象,此外同源基因的甲基化過程以及染色質結構的修飾等也起重要作用.1sirna介導的rnai(1)sirna的產生在起始過程階段,外源長鏈的雙鏈rna(dsrna)可以通過多種方式導入細胞.長鏈的dsrna被dicer酶切割后,變成2223nt的短的雙鏈rna,即sirna.由dicer酶切割產生的一種3端帶有兩個突出堿基的sirna,兩條鏈都含有5端磷酸基團和3端羥基基團,這保證了有效地進入下一階段.發生在轉錄后水平的基因

4、沉默(posttranscriptionalgenesilencing,簡稱“ptgs”】,長鏈的雙鏈rna被dicer酶或其他類似的酶(atp依賴的核酸內切酶,dicerlike,簡稱”dcl”)切割成短鏈的sirna,再與某些作用因子結合形成無活性的rna誘導沉默復合體risc(rnainducedsilencingcomplex).在atp解旋酶的作用下,risc中雙螺旋的sirnas解鏈,risc重新折疊成有活性的risc,正義鏈被降解,靶的mrna同源互補序列識別反義鏈后,按照堿基配對的原則選擇性地識別,切割底物,使其翻譯水平降低,從而引起基因沉默現象.(2)沉默信號的擴增前人在脈胞

5、菌(n.crassa)和秀麗線蟲(c.elegans)中觀察到rna沉默信號的擴增,即小劑量的dsrna能夠阻斷基因的表達,并傳遞到下一代細胞中,但這種效應會慢慢消失.研究發現,rna依賴的rna聚合酶(rnadirectedrnapolymerase,簡稱”rdrp”)參與了sirna的這種擴增機制,可能是由于rdrp類蛋白合成了一種次生sirna,從而把rna干擾的信號加強并放大.lipardi等在果蠅胚胎裂解液中檢測到以sirna為引物的rna合成,表明rdrp在果蠅中對于dsrna及sirna擴增機制起到重要作用.由此他們提出一種隨機降解pcr模型(randomdegradativep

6、crrood-e1),這類似于一種rna聚合酶鏈反應,該反應以靶mrna為模板,sirna中的任意一條鏈為引物,在rdrp作用下擴增靶的mrna,從而產生新的二1611/2011級sirnas(單鏈的具有明顯極性反義rna).在1)ieer酶作用下,這些二級sirnas又反作用靶mrna,使其降解,產生更多的sirnas,作為引物的反義rna其3羥基端又進入下一輪擴增反應.這是一個rnai的循環擴增過程,由此解釋了線蟲中微量的dsrna緣何能夠誘發強烈基因沉默效應.2.mirna介導的rnaimirna是具有5端磷酸基團以及3端羥基基團的22一i單鏈rna,與sirna的長度相同,但二者結構不

7、同,mirna序列位于莖環結構的莖干部分,而這些莖環結構通常是含有一些突起和內環的不完全發夾結構.最近,數以百計的mirnas在人,線蟲等物種中被發現.目前認為在生物體內mirnas首先由不確定的聚合酶在細胞核內轉錄mirnas基因,產生初級轉錄物(primirnas),然后初級轉錄物被加工成約70nt的前mirnas(inemirnas),并輸出到細胞質中.隨后,-el”和其他因子作用形成成熟的mirnas,最后進入一系列的后續調節過程.總之,sirna和mirna是相互關聯的smallrna,二者除了在序列結構上的差別外,其他的主要區別在于,sirna是rnai的主要作用因子,外源dsrn

8、a導入是目前研究sirna介導的rnai的主要方法,而mna抑制rna翻譯,近年來也被列為rnai機制的一部分.二,轉基因植物中的rna沉默研究轉基因植物中rna沉默的發生是一個復雜過程.根據grant研究,rna沉默過程可以有啟動,傳導和保持三個階段,并且轉基因過程和植物病毒侵染都可引發植物rna的沉默效應.在植物的rnai研究中,多采用農桿菌介導的dsrna表達載體轉化法.研究發現,轉基因植物的rna沉默部位常常有小rna片段(2125nt)的積累,雙鏈rna在rna沉默過程中起了重要作用.sirna和mirna可能共同或分別介導了rna沉默現象的發生.此外,轉基因的拷貝數,轉基因的插入位

9、點,轉基因的甲基化,受體植物自身編碼的基因與外源基因的同源性程度等,也是導致rna沉默現象的重要因素.1998年,waterhouse等根據馬鈴薯y病毒(pvy)的輔助因子蛋白基因轉化煙草實驗,提出rna沉默的雙鏈rna模型.他們在轉基因植物中發現,正義rna與反義rna共轉錄對pvy病毒有免疫作用的植株,轉基因植株比例比正義rna與反義1rna分別作用要高,說明共轉錄引起的rna沉默效應較強.rna沉默可以通過細胞間信號傳遞系統傳導和擴增,嫁接試驗中的獲得性沉默現象(systemicacquiredsilencing,簡稱”sas”)表明dsrna或sirna序列特異性信號分子(可能是一種r

10、na一蛋白質復合體)可以通過細胞間的連接和植物維管系統進行傳遞,誘發植物其他部位產生rna沉默.rna沉默實驗中,轉基因的量越大,信號分子進行傳遞的植株部位會越多,繼而啟動新的信號沉默,這樣整個植株會產生免疫反應.一旦rna沉默機制啟動,植物的整個生育期間都會保持這種沉默現象.三,rnai在轉基因植物研究中的應用由于植物細胞與動物細胞不問,具有特殊的細胞壁,不能采用飼喂的方式進行外源dsrna轉化,但是可以通過質粒或者病毒等載體的整合,將彀酶|潦|外源目的基因序列的ds1)na轉移到細胞內.通過轉錄形成dsrna.從而引起rnai現象的發生,然后阻斷內源基因的表達.早在1990年napoli等

11、通過在矮牽牛花的強啟動子后植入查爾酮合成酶基因(chs),發現牽牛花的顏色沒有加深,而是全部或部分變白,進一步研究結果表明轉入的基因及其同源的著色基因都被抑制.在擬南芥的功能基因組研究中,利用rnai干擾技術可以構建一系列的rnai高通量基因沉默表達載體.chuang等和levln等通過重組的包含dsdna結構的質粒,利用農桿菌介導擬南芥轉化,首先將rnai技術用于植物中,通過rnai產生了基因缺失突變體.2006年,楊超等構建了香蕉maasrl基因的rnai表達載體,并采用農桿菌介導轉化法研究發現可以抑制香蕉果肉及愈傷組織中maasrl基因的表達.restb等利用rnai干擾技術抑制番茄cc

12、r基因的表達,獲得了木質素含量降低的轉基因番茄.2009年elias獲得了楊樹抗逆性植株,2010年楊少宗等構建了毛白楊的c3川,cah1,hct1,hcq3四個基因的rnai抑制表達載體,通過rnai技術抑制木質素合成關鍵酶基因的表達.植物中的研究表明,在植物中單鏈自身互補結構(發夾結構,hairpin)與dsrna一樣能夠產生rnai現象.而雙鏈rna之間的長的莖環結構更有利于維持rnai的效率,這可能是由于這種結構更有利于dsrna的穩定.四,植物rnai表達載體的構建植物rnai效應的表型觀察常常依賴于完整的個體,因此需要通過構建植物表達載體,進而獲得轉基因植株.因此,如何構建一個高效

13、的rnai表達載體,對于轉基因植物中rnai的效率非常重要.許多研究結果表明,rnai的效應隨其長度,序列同源性以及在靶mrna上的位點不同而有較大差異.xiongaisheng等人構建了番茄acc氧化酶rnai表達載體,研究了rnai使acc氧化酶基因在轉基因植株中的不同沉默效果.他們用1,002一bp或7一nt(tcaagag)片段作為間隔(spacer),連接欲干擾基因的正義及反義片段.結果表明,用1,002一bp片段作為間隔子(spacer)連接欲干擾基因的正義和反義片段,然后構建表達載體,轉化番茄后獲得的轉基因植株中,72.3%沒有rnai(nonrnainterference)現象

14、,18.1%出現半rnai(semirnainterference)現象,只有9.6%出現全rnai(fullrnainterference)現象;用7一nt(tcaagag)片段連接時,三種現象依次為13.0%,18.0%和69.o%.由此可知,短的間隔子(spacer)連接欲干擾基因的正義和反義片段,會使轉基因番茄植株中生發生rnai的幾率更大一些.chuang和meyerowitz采用組成型啟動子camv35s構建了ag,clv3,api,pan等基因的35s:aguss植物表達載體,高效地獲得了相關基因的rnai干擾的轉基因植株;而采用nos啟動子(胭脂堿合酶基因啟動子)則不能達到理想

15、效果.另外,采用35s:anos:s方式構建的載體,轉化后獲得rnai突變體的比率也較低.這說明啟動子功能的強弱對rnai現象有較大影響,這可能與基因表達的強弱有關.mallory等人報道了采用35s為啟動子,以hprna(hairpinrna】中因剪接反應被去除的內含子作為間隔子,來連接欲干擾基因的正義及反義片段,即ihprna(introncontainingconstructs),所使用的基因是馬鈴薯病毒的pro基因,并且研究了內含子以正向和反向兩種方式連接正義和反義片段后的結果,最終當內含子以正向方式插入(可以被拼接反應去除)時發生rnai的比率,遠高于內含子以反向方式插入時的比率.對

16、此可能的解釋為,在內含子因剪接反應被去除的過程中,由于剪接體的存在,ihprna(in.troncontainingconstructs)可能更容易形成dsrna.但是,mallory等人的載體構建方法是在啟動子后先連接正義片段,而chuang和meyerowitz則是先連接反義片段,如同xiongaisheng等人構建的番茄acc氧化酶rnai表達載體,兩種方法所獲得的rnai的結果不同.chuang和meyerowitz獲得rnai的比率即使在沒有采用內含子的情況下,依然達到很高的比率,而且他們采用了相同的啟動子,這也許表明啟動子后面首先連接反義片段的方式對rnai的效果更好.五,討論rn

17、ai現象有著復雜的機理和過程,這對其在植物轉基因中的應用造成了諸多不便.如何構建一個高效的rnai表達載體.對轉基因植物中產生rnai的效率非常重要.構建植物rnai表達載體時,首先要考慮啟動子和間隔子(spacer)的影響.啟動子強弱對于外源基因的表達水平有重要影響,雖然camv35s啟動子是應用廣泛的啟動子,但它在禾本科植物中的表達強度比在雙子葉植物中要低,因此在構建轉化禾本科植物的表達載體時,可用ubiquitin啟動子等,以期獲得較高的干擾程度.間隔子的類型,片段大小對于rnai的效率也有影響,在構建植物表達載體時,可以考慮采用在正義片段和反義片段之間插入內含子的方式.有結果顯示,臂長

18、98853nt,包含內含子的ihprna(introncontainingconstructs)載體的沉默水平達66100%(平均90%),而不含內含子的hprna的沉默水平達48%69%(平均58%).同時,也可以考慮先連接反義片段的做法.但是,由于hprna(hairpinrna)需要借助構建的表達載體導入細胞,然后整合進核基因組dna并獲得轉錄才能產生,涉及的環節較多,其中不同的轉化方法可能也影響rnai的效應.因此,如何構建一個高效的表達載體,是今后研究的一個重點.隨著人們對轉基因植物中rnai沉默機制認識的深入,必將有助于提高轉基因植物中rnai的效率.參考文獻:1kimv.n.rn

19、ainterferenceinfunctionalgenomicsandmedicine,j.koreanmed.sci,2003,18(3).2nykanena.,haleyb.andzamorep.d.,atprequirementsandsmallinterferingrnastructureinthernainterferencepathway,cell,2001,107(3).3varshawesleys.helliwellc.a.,smitn.a.,wangm.,roused.t.,liuq.,goodingp.s.,singhp.s.,constructdesignforeffi

20、cient,el-fectiveandhighthroughputgenesilencinginplants,plantjournal,2001,27(6).4makeyeve.v.andbarnfordd.h.,cellularrnadependentrnapolymeraseinvolvedinposttranscriptionalgenesilencinghastwodis-tinctactivitymodes,mo1.cell,2002,10(6).5lipardic.,weiq.andpatersonb.m.,rnaiasrandomdegradativepcr:sirnaprime

21、rsconvelmrnaintodsrnasthataredegradedtogeneratenewsirnas,cell,2001,107(3).6lagos?quintanam.rauhutr.meyerj.,lendeckelw.,andtusehlt.newmicrornasfrommotlscandhuman,rna,2003,9(2).7liral.p.,laun.c.weinsteine.g.,abdelhakima.,yektas.,rhoadesm.w.,burgec.b.,andbarteld.p.,themicrornasofcaenorhabditiselegans,genes.dev.,2003,17(8).8grants.r.dissectingthemechanismsofposttranscriptionalgenesilencing:divi