密級 ： 論文編號 ： 學位論文 辣椒分子連鎖圖譜的構建及抗疫病 位 ap ap I 摘 要 辣椒是世界上最重要的蔬菜作物之一， 辣椒疫病 (.) 是一種毀滅性的土傳病害 , 在世界各地均有發生，且有逐年加重的趨勢。世界許多辣椒生產國已將辣椒抗 疫病育種作為辣椒育種的主要目標之一 , 我國從 “八 五 ”開始將選育辣椒抗疫病品種列入了國家科技攻關項目。 本研究用抗辣椒疫病的材料 “與 綜合 園藝性狀優良 的高 感 材料 “83及其 群體（ 144 株）為試材，采用 術，利用親本從 物組合中篩選多態性引物，在 椒分子遺傳圖譜的構建 及 研究。本研究得到如下結果： （ 1） 從 512 對 物組合中篩選出具有多態性 的引物組合 380 對 ，應用其中的 28 對引物組合在 群體中進行抗病性標記的分析。得到 146 個多態性標記，結合 子標記（胡勇勝，碩士論文），應用 件進行分析，取 等于 ，構建了一張有 12 個連鎖群， 70 個分子標記的辣椒分子連鎖圖譜，其中 54 個為 子標記。 圖譜覆蓋長度為 每個連鎖群長度在 間，標記間平均圖距為 （ 2） 采取切莖法進行抗病性鑒定 ，病原菌為辣椒疫霉菌 ( )長沙分離株，在 養基上 恒溫培養 3 天， 濃度為 103 個游動孢子 /種 10 天后調查發病情況。以病斑長度和病斑形態進行抗病性分級。 0 級 24 株、 1 級 29 株、 2 級 41 株、 3 級 20 株、 4 級 18株、 5 級 12 株。 （ 3） 運用 件的區間作圖法進行 析。應用能，計算出顯著 值區間是 在第四連鎖群上檢測到 2 個 點 ，一個 點的 為 在連鎖群上的支持區域是 0 距離最近的標記 一個 點的 為 連鎖群上的支持區域 是 距離最近的分子標記 7個 釋表型差異的貢獻率分別為 本試驗的研究結果為分子標記輔助育種提供可 參考 的標記，為加快辣椒抗疫病優良品種的 培育提供可 能的途徑。 關鍵詞 ：辣椒 ， 抗疫病 ， 分子連鎖圖譜 ， 分子標記輔助育種 I is of in As a . in is a . in . in &D In a F2 44 83of 2 a of TL . as (1) 380 of 12 of 28 of to of 2 146 A of on 2 by 4 5 , 2 an (2) to . , 832 .,DA at 8 03 in 0th (to of (3) ,000on , of TL is 41TL is 41of of of 文縮略表 縮寫符號 英文名稱 中文名稱 擴增片斷長度多態性 過硫酸銨 堿基對 2 混合分離個體分析法 酶解擴增多態序列 厘摩爾根 十六烷基三甲基溴銨 脫氧核苷三磷酸 溴化乙錠 乙二胺四乙酸 標記輔助選擇 聚丙烯酞胺凝膠電泳 聚合酶鏈式反應 脈沖電場凝膠電泳 聚乙烯毗咯烷酮 隨機擴增多態性 限制片段長度多態性 序列特異擴增區域 簡單重復序列 硼酸電泳緩沖液 緩沖液 N,N,N,N四甲基乙二胺 錄 第一章 文獻綜述 . 1 1 1 辣椒疫病的研究概況 . 1 1 1 1 辣椒疫病 . 1 1 1 2 辣椒疫病抗源的篩選 . 1 1 1 3 辣椒疫病接種鑒定方法 . 2 1 1 4 辣椒抗疫病遺傳規律的研究 . 2 1 2 分子標記技術 . 3 1 2 1 分子標記的類型 . 3 1 2 2 分子標記在辣椒育種上的應用 . 4 1 2 3 術在蔬菜育種中的應用 . 4 1 3 分子遺傳圖譜 . 6 1 3 1 親本選擇 . 6 1 3 2 作圖群體 . 6 1 3 3 作圖群體的大小 . 7 1 3 4 辣椒分子遺傳圖譜的研究進展 . 7 1 4 數量性狀基因定位方法及應用 . 8 1 4 1 位方法 . 8 1 4 2 辣椒抗疫病的 析 . 9 1 5 研究目的、意義及試驗設計 . 10 1 5 1 研究目的及意義 . 10 1 5 2 試驗設計 . 11 第二章 辣椒分子連鎖圖譜的構建 . 12 2 1 材料與方法 . 12 2 1 1 試驗材料 . 12 2 1 2 模板 提取 . 12 2 1 3 析及反應體系的優化 . 12 2 1 4 標記數據記錄 . 16 2 1 5 數據統計分析 . 16 2 2 結果與分析 . 16 2 2 1 提取 . 16 2 2 2 應體系的優化 . 17 2 2 3 利用親本進行 物篩選 . 17 2 2 4 構圖分子標記的篩選 . 19 2 3 辣椒分子連鎖圖譜的構建 . 22 2 4 小結 . 22 第三章 辣椒抗疫病 位 . 24 3 1 材料與方法 . 24 3 1 1 試驗材料 . 24 3 1 2 辣椒疫病人工接種鑒定 . 24 3 1 3 數據統計分析 . 24 3 2 結果與分析 . 25 3 2 1 抗病性鑒定結果 . 25 2 2 析 . 29 3 3 小結 . 30 第四章 討 論 . 32 4 1 試驗親本及作圖群體的選擇 . 32 4 2 辣椒疫病抗病性鑒定方法 . 32 4 3 辣椒分子遺傳圖譜的構建 . 32 4 4 辣椒抗疫病 析 . 33 第五章 全文結論 . 32 5 1 采用切莖法進行辣椒疫病的人工接種及抗病性鑒定 . 32 5 2 構建辣椒分子連鎖圖譜 . 32 5 3 初步檢測到 2 個辣椒抗疫病性狀的 . 32 參考文獻 . 35 附錄 . 38 致謝 . 41 作者簡介 . 42 中國農業科學院碩士學位論文 第一章 文獻綜述 1 第一章 文獻綜述 椒疫病的研究概況 辣椒 (.)是一種重要的蔬菜作物 ，為農民創造了很高的經濟效益， 自 2002年以來我國的辣椒播種面積均在 130 萬公頃以上， 在世界上排名第一 ，并且 種植 面積還在不斷的增加。 該病于 1918 年首次在美國新墨西哥洲發現，現已在世界各辣椒產區普遍發生。近年來，國內很多地方都有大面積發生的報道，給辣椒生產 帶來了很大的損失，使 農民的收入 受 到了嚴重的影響，我國從 “八五 ”開始將選育辣椒抗疫病品種列入了國家科技攻關項目。 椒疫病 辣椒疫病是由辣椒疫霉菌引起的一種毀滅性的土傳病害。 辣椒疫霉菌（ .）是由 1922 年命名的，屬于鞭毛菌亞門疫霉屬。 辣椒疫霉菌的寄主范圍很廣，除可侵染辣椒外，還可侵染番茄、茄子等蔬菜。辣椒疫病是一種土傳病害，病菌主要以卵孢子、厚垣孢子在病殘體、土壤及種子上越冬，越冬后的病原菌在適合的條件下從植株根部入侵，病菌也會隨著雨水或 灌溉進行傳播。 溫度對該菌潛育期影響較大，潛育期最適溫度 25 35 。不同的季節土壤中病原菌的數量也明顯不同（徐秉良 等 ， 1996）， 黃鳳蓮等 對辣椒疫霉病田土壤進行病菌分離、菌株配對培養、越冬存活形式等研究，發現病田土壤中的疫霉菌數量有明顯的季節性變化，以 5 8 月最多，冬季和初春最少（黃鳳蓮 等， 1999）。 辣椒疫病是一種 易暴發、易流行、毀滅性很強的病害，該病一旦大暴發就 會導致 辣椒的大面積減產，甚至絕產 ， 所以在辣椒感病前或感病初期進行防治就特別重要。一般來講，在感病初期采取的是化學防治或生物防治，化學防治 應 在植株地上部分發現病癥前用藥，如果在疫病大面積發生時再用藥，就基本上沒有效果；生物防治采用對辣椒疫霉菌有較強的抑制作用的生防菌 在土壤和植物根際建立起有效的群體，控制或減少辣椒疫霉病菌孢子的產生，從而控制辣椒疫病的流行。 在 病害 發生后進行防治 通常 效果 都不理想，所以至今還沒有一種有效的疫病防治方法，而培育抗病品種可以解決這一問題。 培育抗病品種的主要方法 仍然是常規育種 ，但常規育種在進行抗性選擇時操作程序較為繁瑣，而且選育時間較長，也易受環境條件的影響。隨著生物技術的 逐漸成熟 ，通過生物技術選育抗病品種已逐漸成為重要 的防治手段之一，即 子標記輔助育種。 椒疫病抗源的篩選 培育抗病品種的 關鍵 是尋找合適的抗源，有了合適的抗源材料，就為 抗 病品種的培育打下了良好的基礎。 尖辣椒一般對疫病的抗性較強，甜椒大多不抗病。尋找優良的辣椒疫病的抗源 一般是在現有的辣椒主栽品種或 野生種 中 尋找及人工誘變。 目前 我國利用苗期灌根法鑒定了 2061份辣、甜椒種質資源對疫病的抗性，發現達到中抗以上的材料有 93份，其中可做抗源的有 9份（李振歧等，中國農業科學院碩士學位論文 第一章 文獻綜述 2 2005） （表 1） 。 表 1 我國篩 選的辣椒抗疫病材料 to of 全國辣椒科研育種工作者的共同努力下，采用合適的辣椒抗疫病的材料， 現 已育成了一批優良的抗（耐）疫病的辣、甜椒品種，其中包括蘇椒 5 號、甜雜 6 號、中椒 5 號、碧玉、 85 1、西雜 1 號、西雜 2 號、 9185、湘研 2 號、湘研 3 號、湘研 5 號、哈雜椒 1 號等（李樹德， 1995）。 椒疫病接種鑒定方法 準確可靠的抗病性鑒定結果是開發抗病分子標記的基礎。 “八五 ”國家 攻關項目課題組（ 1992）制定了辣椒苗期對 簡述如下 ： 選擇本地區致病力中等偏上 、 來源于青椒上的辣椒疫霉用于接種鑒定。接種體的制備 ， 推薦使用 養基或 V 8 汁液體培養基 ， 25 28 條件下 , 前者光照培養 7 10 d， 后者先暗培養 3 4 d 后 ， 再培養 3 4 d。 近年來，一些學者對影響抗病性鑒定結果的因素做了進一步的 研究， 林柏青等 （ 1994） 提出單株根際灌根接種 3000個游動孢子 , 與 “八五 ”攻關要求的 3一致，但認為接種苗齡應使用 60日齡幼苗； 毛愛軍 （ 1998） 提出接種量應為 5，接種苗齡為 8究發現，接種方法、接種體濃度、辣椒生育期、接種時的環境溫度等對品種的抗病性有較大的影響 （林柏青等， 1994）。易圖永等比較了離體葉片接種、切莖接種、游動孢子液灌根接種 3種方法對 8 個辣椒品種 (品系 )的影響。其中離體葉片接種法是從田間采集葉片進行室內鑒定，能夠在短時間內檢測多個品種，并且對植株的生長無明顯影響，最適合對種質資源稀少株的生長無明顯影響，最適合對種質資源稀少的品種進行抗疫病鑒定； 切莖接種法操作簡單，可以測量病斑的長度，反映病斑的擴展 速度，適宜對抗病性進行量化；游動孢子液灌根接種法基本上模擬田間病害的發生過程， 最能反映品種的真實抗病性，但工作量大，操作較復雜 （易圖永等， 2003） 。 所以 這 3種方法均能用于鑒定辣椒對辣椒疫霉菌的抗病性 在實驗中可根據自己的實際情況選擇合適的接種鑒定方法。 椒抗疫病遺傳規律的研究 辣椒疫病的抗病機制比較復雜，最早開始對辣椒抗疫病遺傳規律進行研究的是 et 1967） ,他從 1967 年開始研究 ,認為辣椒抗疫病是由兩個顯性基因控制的。在隨后的幾十年中，有許 多 學者也致力于辣椒抗 疫病遺傳規律的研究，認為辣椒抗疫病呈遺傳多樣化的特點，不同的材料名稱 選單位 of 料名稱 選單位 of 119 北京農業大學蔬菜科學系 牛角椒 黑龍江省哈爾濱市農科所 蘇省農科院蔬菜研究所 79 號 遼寧省農科院園藝研究所 941001 天津市農科院蔬菜研 究所 5904 湖南省農科院蔬菜研究所 93國農業科學院蔬菜花卉研究所 京市蔬菜研究所 關中線椒 西北農業大學園藝系 中國農業科學院碩士學位論文 第一章 文獻綜述 3 抗病品種，甚至不同的株系，其抗病性的遺傳方式也會有差異。一般認為辣椒疫病的抗病性是由：單基因遺傳、寡基因遺傳或多基因遺傳。 多年來，許多學者應用不同的抗病材料進行了辣椒抗疫病遺傳規律的研究，作為研究對象的抗病材料基本上都屬于 。 認為辣椒疫病抗病性是由單基因控制的，但是由一個顯性基因還是一個隱形基因控制沒有得到統一； 人認為是由寡基因，即兩個顯性基因或兩個隱形基 因控制；進入 90 年代后，大多數學者的研究發現都傾向于多基因控制。之所以多位學者研究得到的結論不同，可能是由于在某些辣椒材料 中 水平抗性和垂直抗性并存，而且辣椒疫霉菌不同的生理小種的致病力也由差異。此外，不同的抗病性鑒定方法以及接種鑒定時的環境條件的差異，都會導致得到不同的結果。 子標記技術 分子標記是在 繼形態學標記 、 細胞學標記及生化標記之后出現的 ， 經過二十多年的發展，分子標記已廣泛地應用于種質資源遺傳多樣性研究、品種品系鑒定、遺傳圖譜構建、目的基因的定位和克隆以及標記輔助選擇育種等各個方面。 子標記的類型 近年來用于蔬菜遺傳育種上的分子標記越來越多 ， 分子育種與常規育種結合的方式已經成為育種工作主要的發展趨勢 。 常用的分子標記包括 術 (擴增片段長度多態性 )、 術 (隨機擴增多態性 微衛星技術 (簡單重復序列 )等等， 每種分子標記技術都有其優缺點，可根據研究內容采用適合的分子 標記技術。 基本原理是基因組 用限制性內切酶切割 ， 然后將雙鏈接頭連接到 段的末端 ， 通過選擇在 3端分別添加 1 3 個選擇性堿基的不同引物 ， 選擇性地識別具有特異配對順序的酶切片段與之結合 ， 從而實現特異擴增 。 然后用聚丙烯酰銨凝膠電泳將擴增的 段分離。術近年來被廣泛應用在圖譜的構建、品種的鑒定等很多方面。 優點主要是所需少；多態性檢測能力高， 能檢測酶切位點不同造成的多態性，又能檢測隨機選擇堿基造成的多態性；簡單高效， 次選擇擴增就能比較幾十甚至 上百個位點；分辨率高，增片段短，片段多態性檢出率高。 有自身的缺點 ： 技術流程長、難度較大，對操作人員的技術水平要求高；模板反應遲鈍，譜帶可能發生錯配與缺失；成本較高。 以一個人工合成的隨機寡核苷酸序列為引物 ， 通過凝膠電泳分析擴增產物 增片段多態性反應了基因組相應區域的 板 15 25純度要求不高； 事先無需知道 沒有種屬的特異性 ， 一套引物可適用于不同基因組分析 ； 快速 ， 無需克隆制備、同位素標記、 10年來， 點是擴增產物易受反應條件的影響，實驗結果的重復性差，這些缺點限制了其應用。 6個微衛星長度一般小于 同品種中國農業科學院碩士學位論文 第一章 文獻綜述 4 或個體核心序列的重復次數不同，但重復序列兩側的 用與核心序列互補的引物，通過 復性好、共顯性、在基因組中隨機分布、操作簡單。但是由于 而需要大量的人力、物力和時間，另外其種屬特異性強，開發所需的費用高昂，因此一些實驗室進行了合作，共同開發微衛星引物。 子標記在辣椒育種上的應用 分子標記技術在國內的廣泛應用使得辣椒育種得到了很快的發展， 現 已將 子純度的鑒定、遺傳圖譜的構建和基因定位等方面的工作。李麗等 （ 2004） 應用 記的方法對甜 (辣 )椒進行了多態性分析。黃三文等 （ 2001） 對辣椒 應的各個環節進行了篩選和優化 ， 確定了一個簡單、高效、相對穩定的 統 ， 并篩選出 12 個較穩定的 記 ， 可以用于 “中椒 ”系列辣椒的 9 個雜交種的純度鑒定。在基因定位方面，已有多個辣椒抗病及其他性狀基因被定位，大多數的基因定位都是采用 子標記方法，也有少數基因定位應用的是 其它分子標記技術 （表 2） 。 術在蔬菜育種中的應用 辨率高等 優點，在蔬菜育種上得到了廣泛地應用，主要應用在品種純度鑒定、親緣關系分析、圖譜構建及基因定位等方面上。 種純度鑒定 在親緣關系較近，遺傳背景較窄的蔬菜品種純度鑒定方面， 比常規的根據田間表型性狀的鑒定方法相比，利用分子技術鑒定有著簡單、方便、用時短等優點。 常被用來進行品種純度的鑒定。 有研究者 利用 個甘藍雜交組合及其 到了清晰的 雷等， 2001）。 緣關系分析 利用分子標記技術進行親緣關系的分析是在 受外界環境的干擾，準確性高。孫德嶺等（ 2001）利用分子標記技術對白菜類蔬菜間的親緣關系進行了研究，使用 10對選擇性引物組合，擴增出 4173條擴增帶，并對其進行聚類分析，結果表明：蕪菁與結球白菜和不結球白菜親緣關系遠；而結球白菜與雞冠菜和毛白菜親緣關系較近，與其它不結球白菜親緣關系較遠。顧興芳等（ 2000）利用 果認為： 用該技術對黃瓜進行遺傳多樣 性和物種親緣關系分析是完全可行的。 譜構建 分子遺傳圖譜的構建是蔬菜遺傳研究的重要內容之一，建立有效的、準確的遺傳圖譜是基因定位、基因克隆的基礎。 復性好，且在一次相互實驗中可觀察到大量的 以目前 盧剛等利用白菜和蕪菁雜交建立的 建了含 131個 蓋 1810 9（盧 中國農業科學院碩士學位論文 第一章 文獻綜述 5 表 2 辣椒主要抗病基因及其它性狀的 位 in 狀 關基因 圖群體 ( 數目 ) 圖標記 （ 數目） 在染色體or 獻 節花數 22(46) 218) 2， P， 1993 抗 69) 117) , 1995 果實形態 H(169) 117) , 1995 控制辣味 c 69) 117) , 1995 控制果實顏色 2(151) , 1998 抗疫病 18H(94) 9 同工酶 1 表型 5 003 抗 2(23) 4 ， 1996 抗 2(23) 4 ， 1996 抗 ，1996 抗 ，1996 抗 H(94) 38 ， 1997 抗 2(151) ， 1999 抗細菌性斑點病 H， 1999 抗 2(153) 10 ， 2000 抗 3(29) 0 C， 2000 抗 2(200) 0 ， 2000 育性恢復 2 X， 2000 抗白粉病 5H(101) 4 5,6,9,10,12 ， 2003 果實相關性狀 53(183) B， 2001 產量相關性狀 848) 2 U， 2003 中國農業科學院碩士學位論文 第一章 文獻綜述 6 剛等， 2002）。 2群體為作圖群體，將 177個標記（ 建了一張辣椒分子遺傳圖譜（ B et 2001）。 因定位 基因定位是以后基因分離及克隆的基礎，質量性狀的基因定位一般是利用近等基因系或分離群體分組分析法（ （ 1995）利用 術結合 檢測與番茄抗葉霉病基因 密連鎖的標記，在 78 對引物所產生的 42000 個 段中，發現了 3 個標記與 因表現共顯性，通過轉座子標記法分離 因，分析含此基因的質粒克隆，將其中 2 個 因 位點兩側約 區域內。蔬菜很多的農藝性狀和抗病性狀都是數量遺傳，數量性狀的基因定位，即 位也被研究得越來越多。郜剛等（ 2005）運用 記技術對馬鈴薯青枯病抗性基因進行了定位。鄭曉鷹等（ 2002）將大白菜耐熱品種 177 和熱敏感品種 276進行雜交，從雜交后代中獲得遺傳性穩定的重組近交系群體，采用 術并結合 同工酶方法鑒定了與大白菜耐熱數量性狀相關的遺傳標記，單因子方差分析和多元線性回歸分析檢測到了 9 個與耐熱性 密連鎖的分子標記。 1 3 分子遺傳圖譜 在蔬菜作物中， 目前已構建了番茄、馬鈴薯、辣椒、萵苣、甘藍、胡蘿卜、芥菜、豌豆、黃瓜、白菜 、 芹菜等約 20種蔬菜遺傳圖譜 ， 其中有些圖譜包含了上千個分子標記（陸朝福等， 1995）。其中番茄和馬鈴薯的遺傳圖譜相對其他蔬菜作物更為飽和。 本選擇 親本的選擇直接影響到構建連鎖圖譜的難易程度及所建圖譜的適用范圍。一要選擇 態性好的作為親本，這樣圖譜上連鎖的標記就會越多，圖譜的經濟價值也就越大；二要選擇純度較高的材料作為親本； 三要考慮親本雜交后代的可育性。在已構建成的辣椒分子遺傳圖譜中， 種間親本的多態性 較 好（ et 1993； et 1999） ，但 如果從育種的實際意義來考慮，種 內 圖譜則更有優越性，較為常用的抗源材料有 些材料都屬于 et 995； et 002； 張寶璽， 2003） 。 圖群體 到目前