附件2：中國藥典三部注釋模板1. 細菌類制品注釋模板皮內(nèi)注射用卡介苗2. 病毒類制品注釋模板流感疫苗3. 治療類制品注釋模板1人血白蛋白4. 治療類制品注釋模板2注射用重組人干擾素1b5. 體外診斷類制品模板人類免疫缺陷病毒抗體診斷試劑盒皮內(nèi)注射用卡介苗卡介苗是一種活的、減毒牛型結(jié)核分枝桿菌制成的疫苗，通過人工方法接種于人體，使未受結(jié)核菌感染的人體產(chǎn)生一次輕微的沒有臨床危險的原發(fā)感染，從而產(chǎn)生一定特異性免疫力，當(dāng)人體再次感染自然結(jié)核菌時，可以限制細菌的生長繁殖，減少體內(nèi)結(jié)核菌的數(shù)量而起到預(yù)防結(jié)核病的作用，對兒童原發(fā)性結(jié)核病、血行播散性結(jié)核病及結(jié)核性腦膜炎有顯著的預(yù)防效果。1901年,法國科學(xué)家Nocard從患結(jié)核性乳腺炎的奶牛身上分離到一株強毒性牛型結(jié)核桿菌，后經(jīng)法國醫(yī)生卡默特（A.Calmette）和獸醫(yī)介蘭（C.Guerin）在含5%甘油牛膽汁的馬鈴薯培養(yǎng)基培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)牛型結(jié)核桿菌毒力逐漸降低，該結(jié)果于1907年發(fā)表。此后持續(xù)13年，經(jīng)過230次的連續(xù)傳代，在1921年動物實驗結(jié)果證明這株牛型結(jié)核桿菌失去了毒力，該菌感染牛、豚鼠、小鼠、猴和家兔都不能使其發(fā)病，但能產(chǎn)生免疫力，該菌株達到了疫苗菌株的標準，將其制成疫苗，1921年7月1日疫苗首次應(yīng)用于人類，經(jīng)過幾年的時間證明其預(yù)防結(jié)核病安全、有效，于1924年在全球應(yīng)用推廣，1928年法國召開國家科學(xué)大會為紀念卡介二氏的功勞，將該菌株制備的疫苗定名為卡介苗（bacelle Calmette Guerin BCG ）。在二十世紀五十年代前，卡介苗是通過口服途徑免疫的， 由于口服卡介苗安全性與有效性都存在缺陷，而改由皮下注射、皮內(nèi)注射以及皮上劃痕的方法進行免疫接種，通過實踐結(jié)果證實，皮下注射會引起膿腫等局部反應(yīng)；而皮上劃痕的方法難以保證接種的劑量。因而皮內(nèi)接種卡介苗的方法得以廣泛使用，其劑型也由早期的液體改為凍干，大大提高了接種的效果。 1974年BCG被納入WHO擴大免疫計劃1。至今BCG共約在172個國家、接種40億人次，每年約1億兒童接種BCG，是世界上接種人數(shù)最多，最安全的疫苗之一。 自原始的卡介苗菌株從巴斯德研究院供應(yīng)到世界各國后，不同的實驗室各自建立了傳代方法，多數(shù)實驗室是在土豆膽汁或土豆蘇通培養(yǎng)基上傳代與保存，這種傳代方式繼續(xù)應(yīng)用到40年代中期，在許多地區(qū)一直應(yīng)用到上世紀50、60年代。經(jīng)過長期傳代，在生物學(xué)特性、免疫學(xué)特性、保護效果和剩余毒力等方面產(chǎn)生顯著差異，形成了不同卡介苗亞株。目前世界上主要的卡介苗制品的菌株分別為卡介苗巴斯德株（Pasteur 1173P2）、丹麥1331株（Danish 1331）、日本172株（Tokyo 172-1）、莫斯科株（Moscow 254） 、巴西株（Moreau）等，我國卡介苗菌株為Danish 823菌株傳代培養(yǎng)而來，名為上海D2PB302PSII甲10菌株，是我國唯一的卡介苗生產(chǎn)用菌株。我國目前所用BCG為凍干皮內(nèi)注射用BCG，包括10人份疫苗（含卡介菌0.40.6mg）和5人份疫苗（含卡介菌0.20.3mg）兩種規(guī)格。主要用于3個月以內(nèi)的嬰兒或PPD皮試陰性兒童預(yù)防結(jié)核病。目前國內(nèi)上市僅為5人份疫苗（0.25mg）一種規(guī)格。 制造概要1、總體工藝情況及國內(nèi)外發(fā)展狀況；BCG作為一種活疫苗，生產(chǎn)過程主要包括菌體培養(yǎng)、菌體收集和洗滌、菌體研磨、定量稀釋等。目前，國際上BCG生產(chǎn)主要采用表面浮膜培養(yǎng)和深層培養(yǎng)兩種技術(shù)。表面浮膜培養(yǎng)是最經(jīng)典的方法，也是應(yīng)用最廣泛的方法，目前世界上有20多個國家采用該方法。我國BCG生產(chǎn)采用表膜培養(yǎng)，原液生產(chǎn)工藝可分為菌種接種與培養(yǎng)、菌液收集和研磨兩個階段，大致工藝可概略如下。啟開工作種子批菌種，接種于蘇通馬鈴薯培養(yǎng)基，培養(yǎng)一段時間，挑取發(fā)育良好的菌膜移種于改良蘇通綜合培養(yǎng)基表面（S1），37-39靜止培養(yǎng)10-14天，連續(xù)在液體蘇通培養(yǎng)基上培養(yǎng)2-3次（S2或S3），收集S2或S3菌膜制成100mg/ml菌懸液，取適量菌懸液接種入蘇通培養(yǎng)基中（S紗），37-39培養(yǎng)10-14天，在液體表面逐漸形成菌膜即為紗膜。用S紗在蘇通培養(yǎng)基上傳代2-3次，成為紗膜第2代或第3代，培養(yǎng)8-12天的第2代或第3代紗膜可用于制備BCG。菌種自啟開至最終收獲物傳代代數(shù)不能超過12代，每代培養(yǎng)結(jié)束后，應(yīng)逐瓶檢查，若有污染、濕膜、渾濁等情況應(yīng)廢棄2。收集菌膜壓干后稱濕重，移入盛有不銹鋼珠瓶內(nèi)，鋼珠與菌體的比例應(yīng)根據(jù)研磨機轉(zhuǎn)速控制在一適宜的范圍，并盡可能在低溫下研磨，或用手工研磨，加入適量無致敏原穩(wěn)定劑稀釋成一定濃度的BCG菌體原液。對BCG原液進行純菌檢查和濃度測定，向原液中加入穩(wěn)定劑，制成1mg/ml或0.5mg/ml半成品。對半成品進行純菌檢查、濃度測定、沉降率測定、活菌數(shù)測定及活力測定，然后分裝凍干，即為BCG成品2，。英國、瑞士和荷蘭等國采用深層培養(yǎng)技術(shù)制備BCG。將凍干菌種開啟重溶后種入改良羅氏雞蛋培養(yǎng)基表面，在羅氏培養(yǎng)基上至少傳2代，第3代在液體Dubos培養(yǎng)基中深層培養(yǎng)，液體培養(yǎng)基中通常需要加Tween80或Triton WR1339。卡介菌在液體培養(yǎng)基中呈均勻分散的生長。然后離心收集菌體、洗滌、再離心集菌，加保護液，制成所需濃度的BCG。2、關(guān)鍵工藝步驟原理及控制條件；疫苗的質(zhì)量安全、有效和一致性，除了依賴于對疫苗的全面檢定，更重要的生產(chǎn)過程中科學(xué)、嚴格的質(zhì)量控制。BCG生產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制主要從如下幾方面進行。種子批的質(zhì)量控制歷史上曾因BCG生產(chǎn)用菌種錯誤出現(xiàn)嚴重不良反應(yīng)的的深刻教訓(xùn)，嚴控生產(chǎn)用菌種十分重要。我國目前使用D2 PB302種子批作為BCG生產(chǎn)用菌種，嚴禁使用通過動物傳代的菌種制造BCG。生產(chǎn)用菌種采用種子批系統(tǒng)，原始種子批樣驗明其記錄、歷史、來源、和生物學(xué)特性。從原代種子批傳代、擴增后凍存保存為主種子批。從主種子批制備工作種子批。主種子批核工作種子批得各種特性應(yīng)與原始種子批一致。BCG種子批生產(chǎn)前應(yīng)作嚴格檢定，檢定合格后方可用于生產(chǎn)，工作種子批啟開至菌體收集傳代應(yīng)不超過12代。主要從以下幾方面進行BCG生產(chǎn)用種子批的質(zhì)量控制。培養(yǎng)特性 BCG在蘇通培養(yǎng)基上經(jīng)3739培養(yǎng)，生長良好、抗酸染色為陽性。在蘇通馬鈴薯培養(yǎng)基上培養(yǎng)的卡介菌應(yīng)是干皺成團略呈淺黃色。在牛膽汁馬鈴薯培養(yǎng)基上為淺灰色黏膏狀菌苔。在雞蛋培養(yǎng)基上有突起的皺型和擴散型兩類菌溶，且?guī)\黃色。在蘇通培養(yǎng)基上卡介菌應(yīng)浮于表面，為多皺、微帶黃色的菌膜。毒力試驗用結(jié)核菌素純蛋白衍生物（TB-PPD）皮膚試驗陰性、體重300400g的同性豚鼠4只，各腹腔注射1ml菌液(5mg/ml)，每周稱體重，觀察5周動物體重不應(yīng)減輕；同時解剖檢查，大網(wǎng)膜上可出現(xiàn)膿皰，腸系膜淋巴結(jié)及脾可能腫大，肝及其他臟器應(yīng)無肉眼可見的病變。無有毒分枝桿菌試驗 用TB-PPD皮膚試驗陰性的同性豚鼠6只，于股內(nèi)側(cè)皮下各注射1ml濃度為10mgml菌液，注射后豚鼠體重不應(yīng)降低，6周和3個月時分別解剖3只豚鼠，各臟器應(yīng)無肉眼可見的結(jié)核病變；若有可疑病灶，應(yīng)做涂片和組織切片檢查，并將部分病灶磨碎，加少量生理氯化鈉溶液混勻后，皮下注射2只豚鼠，若證實系結(jié)核病變，該菌種即應(yīng)廢棄；當(dāng)試驗未滿3個月時，豚鼠死亡則應(yīng)解剖檢查，若有可疑病灶，即按上述方法進行，若證實系結(jié)核病變，該菌種應(yīng)廢棄；若證實屬非特異性死亡，且豚鼠死亡1只以上應(yīng)復(fù)試。免疫力試驗用種子批菌種制備疫苗，經(jīng)4只300400g豚鼠分別皮下注射0.2ml疫苗(1/10人用劑量)，對照組注射0.2ml生理氯化鈉溶液。豚鼠免疫后45周，經(jīng)皮下攻擊103104強毒人型結(jié)核分枝桿菌，攻擊后56周解剖動物，免疫組與對照組動物的病變指數(shù)及脾臟毒菌分離數(shù)的對數(shù)值應(yīng)有顯著差異。 菌種培養(yǎng)和傳代中的質(zhì)量控制 卡介苗作為一種減毒活疫苗，菌種的安全、可靠至關(guān)重要。首先，必須嚴格按照種子批管理系統(tǒng)，啟用和保存菌種，嚴禁使用通過動物傳代的菌種制造BCG。其次，菌種傳代和培養(yǎng)的質(zhì)量高低直接影響疫苗質(zhì)量。我國BCG生產(chǎn)采用表膜培養(yǎng)技術(shù)，培養(yǎng)過程中，表面菌膜的質(zhì)量至關(guān)重要，通常液體表面形成生長快、薄而多縐并富于彈性的菌膜，適合擴大傳代。凍干菌種在馬鈴薯培養(yǎng)基上培養(yǎng)獲得的菌種如果不能及時傳代，可于2-8保存，但保存時間不得超過2個月。生產(chǎn)過程中，為了簡化程序和降低工作量，可將傳代過程中獲得的紗膜移入冷藏室中保存，下次生產(chǎn)時可直接將紗膜接種入蘇通培養(yǎng)基中，而不必每次生產(chǎn)都用馬鈴薯培養(yǎng)基獲取第一代菌膜。但紗膜在冷藏室的保存時間應(yīng)控制在2個月以內(nèi)，并且每代紗膜均需作純菌檢查。在傳代過程中，每代培養(yǎng)結(jié)束后，均需逐瓶檢查，若有污染、濕膜、渾濁等情況應(yīng)予廢棄。另外，應(yīng)確保菌種自啟開至最終收獲物傳代代數(shù)不能超過12代，以保證疫苗的質(zhì)量穩(wěn)定。菌種培養(yǎng)過程中應(yīng)將溫度控制在37-39，培養(yǎng)時間也應(yīng)嚴格控制，通常，紗膜接入液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)時間應(yīng)控制在14-21天，液體培養(yǎng)基菌膜直接接入液體培養(yǎng)基，只需培養(yǎng)6-8天即可，用于制備紗膜或BCG原液的菌膜培養(yǎng)時間控制在8-12天。培養(yǎng)基的質(zhì)量控制卡介苗生產(chǎn)用培養(yǎng)基為蘇通馬鈴薯培養(yǎng)基、膽汁馬鈴薯培養(yǎng)基或液體蘇通培養(yǎng)基。通常，卡介菌培養(yǎng)第一代，即凍干菌種的復(fù)蘇，使用蘇通-馬鈴薯培養(yǎng)基或膽汁馬鈴薯培養(yǎng)基，以后各代培養(yǎng)均使用液體蘇通培養(yǎng)基。其中的氮源有必要進行控制，通常將液體培養(yǎng)菌膜直接轉(zhuǎn)接液體培養(yǎng)基時，待接種培養(yǎng)基使用谷氨酸鈉作為氮源，其他各代培養(yǎng)多用天冬素作為氮源。原液收集和合并（菌體收集和研磨）中的質(zhì)量控制培養(yǎng)結(jié)束后，應(yīng)逐瓶檢查，若有污染、濕膜、渾濁等情況應(yīng)廢棄。收集菌膜壓干，移入盛有不銹鋼珠瓶內(nèi)，鋼珠與菌體的比例應(yīng)根據(jù)研磨機轉(zhuǎn)速控制在一適宜的范圍，并盡可能在低溫下研磨。加入適量無致敏原穩(wěn)定劑稀釋，制成原液。由于水分壓干程度不同，同樣濕重下的疫苗所含實際活菌量不同，進而影響 疫苗濃度，故在對收集的菌膜進行壓干去除水分時，壓力控制是必要的，通常根據(jù)收集的菌量調(diào)整壓力。同樣，菌體經(jīng)研磨后獲得大小不一的菌團，菌團大小可能和臨床上BCG的不良反應(yīng)有關(guān)，通常菌團越大，越易引起局部反應(yīng)并可在淋巴結(jié)處滯留而引起強反應(yīng)，因此，壓干的菌塊移入裝有不銹鋼株的球瓶內(nèi)，鋼珠與菌體的比例應(yīng)根據(jù)研磨機轉(zhuǎn)速控制在適宜范圍，研磨時間也應(yīng)根據(jù)菌量確定。同時應(yīng)對菌液均勻度進行監(jiān)測，以保證生產(chǎn)過程的一致性。總之，在菌體收集、壓干和研磨過程中中，應(yīng)對壓力和研磨轉(zhuǎn)速及時間設(shè)計相應(yīng)的過程參數(shù)并經(jīng)充分驗證。檢定按照原液檢定，半成品檢定和成品檢定分別進行描述，說明檢定項目設(shè)定的原則、意義；1、原液檢定原液檢定有兩個項目，分別為純菌檢查和濃度測定。純菌檢查按現(xiàn)行版藥典無菌檢查法進行，生長物做涂片鏡檢，不得有雜菌。純菌試驗是疫苗的安全性試驗之一，保證疫苗制品不含雜菌。濃度測定用國家藥品檢定機構(gòu)分發(fā)的1 mg/ml的凍干卡介苗參考比濁標準，以分光光度法測定原液濃度，濃度范圍為60-120mg/ml。原液濃度=（樣品A580nm/標準品A580nm）稀釋倍數(shù)1 mg/ml。濃度測定的設(shè)定是為了確保疫苗有效成分的含量，并監(jiān)測生產(chǎn)過程的一致性。2、半成品檢定半成品檢定有5個項目，分別為純菌檢查、濃度測定、沉降率測定、活菌數(shù)測定、活力測定。本成品純菌檢查同原液的純菌檢查。半成品濃度測定同原液的濃度測定，應(yīng)不超過配制濃度的110%。半成品濃度=（半成品A580nm/標準品A580nm）1 mg/ml沉降率測定，可以和濃度測定同時進行，將濃度測定后的半成品室溫靜置2小時，再檢測A580nm，計算靜置前后2小時吸光度值的變化，應(yīng)不大于20%。通過檢測沉降率，可以了解菌液的均勻性及菌團的大小，從而控制制品的質(zhì)量，同時也監(jiān)測生產(chǎn)過程的一致性。沉降率=（半成品A580nm-2小時后的半成品A580nm）/半成品A580nm100%。活菌數(shù)測定，半成品活菌數(shù)經(jīng)凍干后有顯著性下降，為了保證凍干后成品的活菌數(shù)，因此每批半成品均需做凍干前活菌計數(shù)，半成品活菌數(shù)應(yīng)不低于1.0107CFU/mg。活力測定，采用XTT法測定，將相同濃度的半成品與檢測參考品100l/孔加入到培養(yǎng)板中，同時加入25lXTT與中間電子載體混合物，于37-39避光培養(yǎng)24小時，檢測A450nm，半成品的吸光度值應(yīng)大于參考品的吸光度值。卡介苗生產(chǎn)過程中從半成品到成品的周期較短，而常規(guī)的活菌數(shù)測定耗時長，需要4-5周時間，通過XTT法可以快速檢測卡介苗活力，從而可以了解半成品中活菌含量。3、成品檢定成品檢定共有9個項目，除裝量差異、水分測定、活菌數(shù)測定和熱穩(wěn)定性試，驗外，按標示量加入滅菌注射用水，復(fù)溶后進行其余各項檢定。生物學(xué)與物理檢定每批疫苗須做抗酸染色涂片檢查，抗酸染色應(yīng)是抗酸桿菌,細菌形態(tài)與特性符合卡介菌特征;制品外觀為白色疏松體或粉末狀, 殘留水分不高于3.0%,加入稀釋液后，應(yīng)于3分鐘內(nèi)完全溶解；裝量差異限度為15%。安全性檢定純菌試驗按現(xiàn)行版藥典無菌檢查法進行，觀察14天,無污染其他雜菌。無有毒分枝桿菌試驗無有毒分枝桿菌試驗是卡介苗制品重要的安全性試驗，因為結(jié)核桿菌其形態(tài)與培養(yǎng)特性與卡介苗基本一致，如果污染該菌用常規(guī)微生物方法無法區(qū)分，只能根據(jù)結(jié)核桿菌與卡介苗對豚鼠的致病力的差異加以區(qū)別。同一代菌種生產(chǎn)的各批凍干卡介苗應(yīng)抽1個亞批做安全試驗，每間隔兩個月應(yīng)至少抽1亞批進行毒分枝桿菌試驗。用PPD皮膚試驗（10IU）陰性，體重300400g的同性健康豚鼠6只，每只皮下注射相當(dāng)于50人份的凍干皮內(nèi)注射用卡介苗，每2周稱重一次，觀察6周，動物體重不應(yīng)減輕；同時解剖檢查每只動物，若肝、脾、肺等臟器無結(jié)核病變，該批疫苗即為合格。效力檢定活菌數(shù)與熱穩(wěn)定性試驗卡介苗的效力與其活菌數(shù)密切相關(guān)，疫苗中含有足夠數(shù)量的活菌是保證疫苗免疫成功發(fā)揮預(yù)防作用的重要因素，因此活菌數(shù)試驗是卡介苗制品重要的質(zhì)控指標。同時卡介苗是活菌疫苗，活菌易受到環(huán)境溫度的影響而導(dǎo)致活菌數(shù)改變，進而影響疫苗的質(zhì)量，因此對制品進行熱穩(wěn)定性試驗，以評價疫苗的穩(wěn)定性。每批成品抽取5支疫苗稀釋并混合后進行活菌數(shù)測定，培養(yǎng)4周后活菌數(shù)應(yīng)在1.0106CFU/mg以上。同時取凍干后疫苗放置3728天進行加速破壞試驗，測定放置后樣品的活菌數(shù)，與4保存的同一批疫苗同時進行比較，計算活存的百分率。加溫放置制品的活菌數(shù)應(yīng)不低于冷藏疫苗的25%，并不得低于2.5105CFU/mg。活菌數(shù)與熱穩(wěn)定性試驗可以同時進行。動物效力測定同一代菌種生產(chǎn)的各批凍干卡介苗應(yīng)抽1個亞批做效力測定，每間隔兩個月應(yīng)至少抽1亞批進行效力試驗。用結(jié)素試驗（PPD 10IU）陰性，體重300400g的同性健康豚鼠4只，每只皮下注射0.5mg的凍干皮內(nèi)注射用卡介苗，注射5周后皮內(nèi)注射PPD 10IU/0.2ml，注射PPD24小時后觀察結(jié)果，局部硬結(jié)反應(yīng)直徑應(yīng)不小于5mm。PPD 試驗?zāi)芊磻?yīng)卡介苗接種后機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的情況，通常情況下，只有免疫成功，才能出現(xiàn)PPD 反應(yīng)，因此質(zhì)控中的動物效力測定，是反應(yīng)卡介苗制品免疫力的指標。稀釋劑稀釋劑為滅菌注射用水，應(yīng)符合現(xiàn)行版藥典的相關(guān)規(guī)定。4、歷版藥典標準變化的情況、原因及與國外要求的比較；我國皮內(nèi)注射用卡介苗的質(zhì)量標準是規(guī)程根據(jù)世界衛(wèi)生組織卡介苗標準制定，內(nèi)容涵蓋了WHO卡介苗規(guī)程所有內(nèi)容，但WHO標準對濃度、均勻度項目缺少有效的質(zhì)控指標，對臨床使用存在一定的安全隱患，尤其近年來卡介苗不良反應(yīng)增加，而其是否與制品本身有關(guān)缺少依據(jù)。因此我國在2010版藥典中增加半成品沉降率的質(zhì)控項目，目的是為了監(jiān)測生產(chǎn)過程的一致性，從而保證疫苗的質(zhì)量。同時由于半成品至凍干的周期很短，也增加了XTT法快速檢測活菌活力質(zhì)控項目；正在修訂的WHO 卡介苗標準在成品項下有快速檢測卡介苗活菌數(shù)方法，為ATP法， 兩種檢測方法，目的都是為了快速了解制品中卡介苗的活菌含量。我國卡介苗質(zhì)量標準與WHO規(guī)程的主要區(qū)別在是熱穩(wěn)定項目標準不同，我國質(zhì)量標準規(guī)定加溫放置制品的活菌數(shù)應(yīng)由原來標準不低于冷藏疫苗的20%，提高到25%，并由不得低于2.0105CFU/mg，提高到不得低于2.5105CFU/mg。而由于不同卡介苗亞株制備的疫苗制品熱穩(wěn)定不同，WHO的卡介苗熱穩(wěn)定標準仍然為不低于冷藏疫苗的20%，并由不得低于2.0105CFU/mg。5、國內(nèi)外相關(guān)標準發(fā)展變化的趨勢。正在修訂的WHO 卡介苗規(guī)程中包涵了以下修改內(nèi)容工作種子批 （Working seed lot），規(guī)定從主代種子批盡量減少傳代次數(shù)制備工作種子批，如3-4代。而我國對從主代種子批制備工作種子批未規(guī)定傳代代次，實際操作中一般維持在4代內(nèi)。單次收獲物（Single harvests），規(guī)定從主代種子批到單次收獲物傳代代次不得超過12代。我國規(guī)定為從工作種子批到菌體收集傳代不得超過12代。種子批檢定 （Tests on seed lot），補充用分子生物學(xué)方法特異性鑒別卡介苗亞株試驗。半成品濃度測定 (Test for bacterial conceration),歐洲藥典中半成品無濃度檢測項目，在成品中檢測該項。而我國和WHO規(guī)程相似，目前標準規(guī)定在半成品項下進行濃度檢測，成品不檢測。成品鑒別試驗（Identity test），成品鑒別試驗?zāi)茏C明制品為卡介苗BCG ，除了用抗酸染色涂片法檢查細菌的形態(tài)與特性及固體培養(yǎng)基菌落特點符合卡介菌特征，還可應(yīng)用核酸擴增技術(shù)如PCR法來特異性的鑒別不同的卡介苗亞株。英國生物制品標準和檢定研究所（NIBSC）設(shè)計了多重PCR法3，通過檢測不同卡介苗的遺傳學(xué)特性來特異性的鑒別卡介苗及不同的亞株。檢測目標包括卡介苗基因組的缺失區(qū)RD1、 RD2、RD 8、RD 14、RD 16區(qū)及基因座SenX3-RenX3上的串聯(lián)重復(fù)序列數(shù)。其中RD1是卡介苗基因組的特異缺失區(qū)，而存在于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中，包括強毒的人結(jié)核分枝桿菌及牛結(jié)核分枝桿菌，通過檢測RD1的存在與否即可即可特異性鑒別BCG。不同卡介亞株的RD2、RD 8、RD14、RD16區(qū)及基因座SenX3-RenX3上的串聯(lián)重復(fù)序列數(shù)不同，PCR擴增后，通過凝膠電泳指紋圖譜區(qū)分卡介苗與有毒分枝桿菌及不同的卡介苗亞株。不同的卡介苗亞株有不同的凝膠電泳指紋圖譜3，上述多重PCR鑒別實驗方法已經(jīng)過包括中國在內(nèi)的世界上八個獨立實驗室的驗證，旨在替代目前的抗酸染色鑒別實驗方法4。我國藥典目前仍采用抗酸染色涂片法作為卡介苗鑒別試驗的方法。中國食品藥品檢定研究院已對我國生產(chǎn)用卡介苗菌種的遺傳性特性進行了研究，并對傳代12代內(nèi)的產(chǎn)品進行了檢測。 結(jié)果顯示我國卡介苗菌種缺失RD1、RD2，不缺失RD8、RD14、RD16、nRD18及RDDenmark/Glaxo，含有一個IS6110插入序列，SenX3-RenX3 基因座有3個串聯(lián)重復(fù)序列5，并且在12代內(nèi)都是穩(wěn)定的6。我國卡介苗亞株是由Danish823傳代培養(yǎng)而來的，和目前世界上應(yīng)用較多的Danish1331亞株比較，我國卡介苗亞株不缺失RDDenmark/Glaxo，該區(qū)域是目前BCGDanish及BCG Glaxo株的特異缺失區(qū)。另外我國僅有唯一的卡介苗菌株用于生產(chǎn)，不同于世界上其他國家，同時使用不同的卡介苗亞株制品。因此若使用核酸擴增技術(shù)PCR法作為特異性的鑒別卡介苗的試驗方法，僅采用檢測RD1的存在與否及能達到特異鑒別卡介苗制品的目的。成品無有毒分枝桿菌試驗， 若在半成品項檢測無有毒分枝桿菌試驗，且結(jié)果合格，在成品項下有可能去掉該項。我國對半成品不進行無有毒分枝桿菌試驗檢測，對成品進行檢測。無有毒分枝桿菌試驗以卡介苗免疫豚鼠后，連續(xù)觀察6周，實驗到期后解剖豚鼠，觀察動物臟器是否有結(jié)核病變。該方法不但耗時長，而且有動物消耗，不符合節(jié)約動物原則和快速檢驗的需要。鑒于與結(jié)核分支桿菌H37Rv、牛型分枝桿菌相比，卡介苗基因組中缺少了編碼毒力的基因，如H37Rv RD1區(qū)east6和cfp10等基因，檢測毒力特異性基因是否存在即可了解分枝桿菌是否為毒性分枝桿菌。這兩種基因檢測一個即可。中國食品藥品檢定研究院卡介苗實驗室擬用PCR法擴卡介苗是否存在毒力基因來替代動物法，檢測指標為east6毒力基因。檢測結(jié)果顯示，有毒的分枝桿菌H37Rv及牛分枝桿菌存在east6基因，可擴增出320bp目的片段，而卡介苗無此基因，則無320bp的擴增條帶，通過高濃度瓊脂糖凝膠電泳即可以對結(jié)果進行鑒別。該方法可在12小時內(nèi)完成，且用一支0.25mgBCG干粉即可完成檢測，靈敏度較高。PCR方法本身的特異性及節(jié)省時間、減少動物損耗的優(yōu)點，說明該方法有替代目前動物法的可能性與可行性。成品卡介苗活力檢測（Test for viability），除了常規(guī)通過培養(yǎng)法計數(shù)卡介苗菌落形成單位（CFU）來檢查卡介苗活菌數(shù)， 還可采用其他的方法快速檢測卡介苗活力，包括生物發(fā)光法或其他的生化試驗法。生物發(fā)光法是通過檢測卡介苗活菌中三磷酸腺苷含量（ATP法）來快速檢測卡介苗活力。該方法經(jīng)過包括中國在內(nèi)8個不同實驗室的驗證7， 驗證結(jié)果顯示，該方法可區(qū)分4與37存放4周后樣品活菌數(shù)的差異，但ATP含量與活菌數(shù)相關(guān)性較差，還需要進一步驗證。分析認為，只有檢測出單個細菌中ATP含量，才能將該方法應(yīng)用于BCG活菌含量的快速檢測，目前該方法尚在進一步研究中。我國目前對半成品進行卡介苗活力快速檢測，方法為XTT法，原理為活BCG 在代謝過程中，通過氧化-還原反應(yīng)將四唑鎓鹽（Tetrazolium salt，XTT）還原為可溶性的高色產(chǎn)物甲臢（Formazan），甲臢含量反映了 BCG 活菌數(shù)量。該方法操作簡單，24小時可出結(jié)果，不需要特殊儀器。試驗結(jié)果顯示XTT 法能反應(yīng) BCG 制品中活菌的含量差異，與培養(yǎng)法菌落形成單位（CFU）結(jié)果有較好的相關(guān)性，可用于 BCG 活菌含量的快速檢測8。對半成品進行活菌數(shù)的快速檢測比對成品更有實際應(yīng)用意義，因為半成品至成品的周期短，不但可以快速了解半成品中的活菌數(shù)，還可以監(jiān)測生產(chǎn)過程的一致性。卡介苗接種是結(jié)核病預(yù)防和計劃免疫工作內(nèi)容之一，對預(yù)防和減少兒童結(jié)核病,特別是結(jié)核性腦膜炎、血行播散性結(jié)核病的發(fā)揮起著重要作用，但是對于青少年和成人保護效果差異較大,不同的人群和不同地區(qū)的保護力從0%80%不等,尤其是對HIV感染者無法接種卡介苗以提供保護。鑒于以上原因，國內(nèi)外進行了大量結(jié)核新疫苗的研究工作，包括重組卡介苗（rBCG）、DNA疫苗、亞單位疫苗、減毒活疫苗、全菌體滅活疫苗等，希望能夠替代或加強卡介苗的保護作用，但到目前為止，結(jié)核新疫苗的保護作用并未超過卡介苗，因此盡管卡介苗保護效果差、但還將繼續(xù)使用，當(dāng)今結(jié)核新疫苗研究方向應(yīng)該是對不同的人群采用不同的疫苗和免疫策略。針對新生兒預(yù)防結(jié)核感染的免疫，可采用初免用加強型疫苗，該疫苗為替代卡介苗的新疫苗，能產(chǎn)生更強保護力, 以降低結(jié)核的感染率；而對于結(jié)核病高危人群的預(yù)防，可采用初免-加強（Prime- Boost）免疫策略，即初次免疫和加強免疫用不同的疫苗。如初免可用DNA疫苗或亞單位疫苗，加強免疫用BCG、不同載體的DNA疫苗或抗結(jié)核藥等。此種免疫策略期望達到強于卡介苗的保護效果而預(yù)防感染。另外感染結(jié)核菌未發(fā)病者為結(jié)核潛伏感染人群，機體免疫力一旦低下，潛伏的結(jié)核桿菌復(fù)燃導(dǎo)致活動性結(jié)核病的發(fā)生，此類人群用疫苗，是預(yù)防已感染者發(fā)病的疫苗，是目前結(jié)核新疫苗研究的難度與熱點，首先面臨的是有效篩選出潛伏感染者。以結(jié)核桿菌特異性抗原為基礎(chǔ)，發(fā)展簡單、易行、價廉的篩查方法，在我國已經(jīng)取得一定的進展9-10。我國是結(jié)核高負擔(dān)國家之一，目前結(jié)核桿菌感染人群已有5億，加強對新疫苗研究的投入，實施主動預(yù)防、控制已感染者發(fā)病，是結(jié)核病控制的重要途徑。 參考文獻：1. Hawgood BJ. Doctor Albert Calmette 1863-1933: founder of antivenomous serotherapy and of antituberculosis BCG vaccination. Toxicon, 1999; 37(9): 1241-1258.2. 國家藥典委員會， 2010版 中華人民共和國藥典 三部，中國醫(yī)藥科技出版社，2010，80-82。3. Bedwell J, Kairo SK, Behr MA, et al , Identification of substrains of BCG vaccine using multiplex PCR Vaccine,2001 Feb 28;19(15-16):2146-2651.4. Markey K, Ho MM, Choudhury B,Report of an international collaborative study to evaluate the suitability of multiplex PCR as an identity assay for different sub-strains of BCG vaccine. Vaccine. 2010 Oct 8;28(43):6964-95. 趙愛華，賈淑珍，寇麗杰，等 國內(nèi)外卡介苗的分子遺傳學(xué)特性,中國生物制品學(xué)雜志，2009 22(5):583-587。 6. 趙愛華，喬來艷， 賈淑珍，等 我國生產(chǎn)用卡介苗的傳代穩(wěn)定性，中國生物制品學(xué)雜志，2009 22(11):1102-1104。7. Ho MM, Markey K, Rigsby P, Report of an International collaborative study to establish the first WHO reference reagents for BCG vaccines of three different sub-strains. Vaccine. 2011 Jan 10;29(3):512-8.8. 趙愛華，賈淑珍，寇麗杰，等.應(yīng)用四唑鎓鹽（XTT）法快速檢測卡介苗活菌含量，中國醫(yī)藥生物技術(shù)，2009，4（1）：33-36.9. 徐苗，陳保文，沈小兵，蘇城，王國治. 重組Esat-6變態(tài)反應(yīng)原對結(jié)核病的早期發(fā)現(xiàn)的應(yīng)用價值，中國防癆雜志，2004，26（S）：36.10. 徐苗，羅永艾，黎友倫，陳保文，沈小兵，蘇城，王國治.重組結(jié)核分支桿菌11kD蛋白對結(jié)核分支桿菌感染的鑒別作用，中華結(jié)核和呼吸雜志，2006，29（11）：762-765.流感病毒裂解疫苗通用名稱： 流行性感冒病毒裂解疫苗英文名稱：Influenza Vaciine （Split Virion）, Inactivated漢語拼音：Liugan Bingdu Liejie Yimiao流行性感冒（以下簡稱流感）病毒可引起急性呼吸道傳染病，其危害性在于傳染性強，常引起本病的流行甚至引起世界大流行。目前，接種流感疫苗是預(yù)防流感和控制其流行的最有效的措施。 國際上普遍現(xiàn)使用的疫苗均為純化的滅活疫苗，包括流感全病毒滅活疫苗、流感病毒裂解疫苗、流感病毒亞單位疫苗。早期的流感病毒滅活疫苗只是有限的純化后制成，疫苗接種后全身和局部副反應(yīng)大。20世紀60年代，超速離心機和色譜技術(shù)的應(yīng)用，研制出真正意義上的純化全病毒滅活疫苗，盡管接種副反應(yīng)大副降低，但對于兒童使用時仍出現(xiàn)不良反應(yīng)。將病毒顆粒裂解后制成的純化裂解病毒疫苗，接種副反應(yīng)大大降低。20世紀70-80年代，將病毒裂解后，提純血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）， 研制出亞單位疫苗。流感亞單位疫苗接種后雖然不良反應(yīng)明顯降低，但免疫原性不及流感全病毒滅活疫苗。流感減毒噴鼻疫苗已經(jīng)獲得美國FDA批準上市，但使用減毒活疫苗應(yīng)慎重考慮使用安全的問題， 比如疫苗株病毒與野毒病毒株重配產(chǎn)生毒性更強的新型流感病毒，因此這種疫苗只在少數(shù)國家有限地使用。新型佐劑疫苗的研發(fā)成功提高了流感疫苗對機體的體液免疫反應(yīng)和細胞免疫反應(yīng)，美國已經(jīng)研制成功以MF59水/油乳劑作為佐劑的新型佐劑流感疫苗。目前， 國際上正在加緊研制應(yīng)用細胞培養(yǎng)生產(chǎn)流感疫苗，提高規(guī)模化生產(chǎn)，避免了傳統(tǒng)的采用雞胚技術(shù)生產(chǎn)流感疫苗的諸多問題。另外，核蛋白合成肽疫苗、DNA疫苗以及能夠預(yù)防各種亞型流感病毒， 特別是大流感病毒感染通用流感疫苗已成為當(dāng)前研究的熱點。我國1979年版和1990年版生物制品規(guī)程均收載了“流行性感冒活疫苗制造及檢定規(guī)程”，該制品為非經(jīng)純化的單價甲型流感減毒活病毒外用鼻噴制劑。2005年版中國藥典三部開始收載“流感全病毒滅活疫苗”；2010年版中國藥典三部增加收載了“流感病毒裂解疫苗”。2008年版歐洲藥典（6.0版）收載了“流感全病毒疫苗（雞胚/細胞培養(yǎng)）”、“流感病毒裂解疫苗”、“流感病毒亞單位疫苗（雞胚/細胞培養(yǎng)）”、“流感病毒亞單位病毒體疫苗”； 2009年版英國藥典收載了“流感病毒裂解疫苗”、“流感病毒亞單位疫苗”、 “流感全病毒疫苗”。2010年版美國藥典（32版）收載了“流感疫苗”， 但其中內(nèi)容僅為概要性的描述。 一、 制造概要 目前季節(jié)性流感疫苗生產(chǎn)用病毒株（包括甲型H1N1、 H3N2以及B型毒種）由世界衛(wèi)生組織（WHO）流感參比研究中心推薦和提供、經(jīng)國家藥品管理部門批準后依據(jù)批準的生產(chǎn)工藝投產(chǎn)。WHO提供的疫苗生產(chǎn)病毒株均已適應(yīng)于雞胚培養(yǎng)，接種雞胚后可快速大量增殖的病毒用于疫苗生產(chǎn)。目前，國內(nèi)外現(xiàn)批準上市的流感疫苗均系采用傳統(tǒng)的雞胚培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)。將各型流感病毒分別接種雞胚尿囊腔后，在適宜的溫度下培養(yǎng)適宜的時間， 收獲含有流感病毒的雞胚尿囊液、加入適宜濃度的甲醛滅活病毒（病毒滅活也可在純化后進行），經(jīng)純化后，去除大量的雞胚雜蛋白成分， 純化后的病毒液中加入適宜的裂解劑裂解病毒， 裂解后的病毒液采用適宜的方法再次進行純化，進一步去除雞胚蛋白成分和流感病毒的核酸RNA等雜質(zhì)。經(jīng)除菌過濾后制成單價病毒原液。 將制備的三個亞型的病毒原液按標示量的血凝素含量進行混合配制后制成三價流感病毒裂解疫苗。疫苗中可含有防腐劑， 用于預(yù)防與疫苗株抗原性相同的流感病毒引起的流行性感冒。二、 制造 生產(chǎn)用雞胚各型流感病毒株在種子批系統(tǒng)建立過程中，毒種傳代必須使用來源于SPF雞群的雞胚， 以最大程度避免種子批制備過程中污染禽外源感染因子，特別是禽白血病病毒和禽腺病毒。由于全球SPF雞胚的供應(yīng)遠不能滿足生產(chǎn)的需要，同時，考慮到疫苗生產(chǎn)工藝中對流感病毒滅活的同時對雞胚可能引入的潛在外源因子也具有滅活作用，因此，WHO相關(guān)指南規(guī)定， 流感病毒滅活疫苗的生產(chǎn)可使健康雞群來源的雞胚。目前， 國內(nèi)外流感滅活疫苗生產(chǎn)普遍遵循這一原則。疫苗生產(chǎn)使用上通常選用9-11日齡的雞胚， 此階段胚蛋的尿囊液體積量最大、組織蛋白成分含量相對較低， 可獲得更多量的病毒液。雞胚投入生產(chǎn)前，每枚蛋胚都要應(yīng)經(jīng)過燈檢篩查，挑選表面清潔無畸形、血管清晰、存活的雞胚用于生產(chǎn)。由于白色雞蛋易于進行雞胚篩查，國內(nèi)生產(chǎn)用雞胚通常選擇來自“海蘭白”、“海蘭灰”等品種的雞群。【名稱和來源】對于季節(jié)流感疫苗而言，生產(chǎn)用毒種通常包括甲型（H1N1、 H3N2）和乙型（B型）。 流感病毒HA抗原容易發(fā)生變異，一般說來， A型流感病毒株普遍在HA上可被保護性抗體識別的區(qū)域每年會有34個氨基酸的改變， 每25年，這些突變的積累就引起了先前一個周期的毒株的抗原漂移， 從而導(dǎo)致人體通過既往流感疫苗接種或自然感染后產(chǎn)生的免疫不能對新型流感病毒的流行產(chǎn)生保護，因此， WHO建立了遍布全球99個國家的128個流感實驗室的全球流感監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)全球流感病毒流行情況和對流感病毒流行株抗原基因序列分析和比對，以及新型病毒在全球傳播的可能性，每年提出建議，對流感疫苗生產(chǎn)用病毒株適時更換。WHO推薦的疫苗株是采用基因重配方式構(gòu)建的毒力減弱、適合于雞胚培養(yǎng)、病毒產(chǎn)量相對較高的毒株。WHO于每年的2月份和9月份分別向全球發(fā)布北半球、和南半球流感病毒的流行情況，推薦可用于流感疫苗生產(chǎn)的病毒株，并由WHO 流感參比研究中心，包括美國疾病控制與預(yù)防中心（CDC）、英國國立研究院（NIBSC）、 澳大利亞墨爾本原聯(lián)邦血清實驗室（TGA）和日本國立公共衛(wèi)生研究院向各國生產(chǎn)企業(yè)提供用于季節(jié)流感疫苗生產(chǎn)用毒種和檢定用抗原參考品和抗體參考品。對于流感疫苗株的使用，WHO指南中規(guī)定，生產(chǎn)用疫苗株應(yīng)得到國家管理當(dāng)局的批準； 美國藥典規(guī)定，生產(chǎn)用毒株應(yīng)由美國公共衛(wèi)生部推薦并由國家流感專家委員會指定；在我國，生產(chǎn)用疫苗株應(yīng)具有合法來源，明確毒株的名稱、毒種來源的代次以及相關(guān)的傳代背景資料等，并經(jīng)國家藥品管理部門的批準。 【病毒種子批的建立】建立疫苗生產(chǎn)用病毒種子批系統(tǒng)的主要目的是為了使生產(chǎn)的不同批次疫苗間最大限度保持質(zhì)量的一致性、穩(wěn)定性、可控性和可溯源性。應(yīng)按照中國藥典三部通則中“生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理規(guī)程”的要求建立種子批系統(tǒng)。由于流感疫苗生產(chǎn)用毒株是由WHO流感病毒參比中心提供。生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)根據(jù)WHO流感實驗室提供各型毒株的代次，相應(yīng)建立主種子批和工作種子批。WHO提供各型疫苗株的代次往往不盡相同、且每年都有新的疫苗株更換，因此流感疫苗不象其他疫苗一樣種子批代次相對固定，為此在2005年版藥典三部中未對該品種種子批毒種規(guī)定限定代次。考慮到流感病毒在擴增復(fù)制過程中抗原容易發(fā)生改變，所以傳代次數(shù)過多可能影響到毒株的抗原穩(wěn)定性，因此，在滿足生產(chǎn)需要的前提下，應(yīng)盡可能使用早代的毒種用于生產(chǎn)。歐洲藥典中規(guī)定，自批準的重配株或批準的流感病毒分離時的代次至工作種子批毒種的傳代不超過15代， 生產(chǎn)的疫苗為自工作種子批毒種擴增1代制成。根據(jù)目前國內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)在獲得疫苗株后建立種子批的情況，通常是將來源WHO的 疫苗株接種SPF雞胚連續(xù)傳12代建立主種子批，由主種子批毒種接種SPF雞胚連續(xù)傳12代建立工作種子批，工作種子批毒種擴增1代制備成疫苗。據(jù)此，本版藥典三部明確規(guī)定，以WHO推薦并提供的流感毒株代次為基礎(chǔ)，傳代建立主種子批和工作種子批，至成品疫苗病毒總傳代不得超過5代。 【種子批檢定】由WHO流感實驗室獲得的各型流感毒株經(jīng)擴增后應(yīng)進行全面檢定，以證明該毒株可用于疫苗的生產(chǎn)， 檢定項目至少應(yīng)包括鑒別、無菌、支原體檢查、病毒滴度、血凝效價以及外源性禽白血病病毒和外源性禽腺病毒等檢測， 檢測合格的毒種建立主種子批。由于種子批建立均采用SPF雞胚制備， 因此主種子批檢定合格的工作種子批可不進行禽特異性外源因子的檢查，包括禽白血病病毒和禽腺病毒，但至少應(yīng)進行鑒別、無菌、支原體檢查、病毒滴度、血凝效價等項目的檢查。 1. 鑒別試驗鑒別試驗常用方法是血凝抑制試驗。因為流感病毒顆粒表面的HA蛋白含有識別和結(jié)合宿主細胞表面受體的結(jié)構(gòu)。 流感病毒的受體為含唾液酸的糖蛋白或脂蛋白，一些哺乳動物和禽的紅細胞表面均含有此兩種成分， 能被流感病毒所識別和結(jié)合， 并發(fā)生紅細胞凝集現(xiàn)象。如果在病毒液中加入針對流感病毒血凝素的特異性免疫血清，可抑制紅細胞凝集現(xiàn)象的出現(xiàn)，通過特異性免疫血清對病毒血凝現(xiàn)象的抑制， 可對流感毒進行鑒別。 試驗用紅細胞通常為1%的雞紅細胞， 為所作試驗的特異性，檢測的同時做所用免疫血清對照、紅細胞對照和抗原對照。鑒別試驗還可采用單向免疫擴散試驗（SRID）檢測，即將含有一定量抗流感病毒抗體參考品的1.5%瓊脂糖凝膠板上打孔， 將抗原參考品對照和供試品分別加入到相應(yīng)的孔內(nèi)，供試品與相應(yīng)（亞）型特異性抗體參考品產(chǎn)生相應(yīng)沉淀環(huán)，結(jié)果證明其抗原性與推薦的病毒株相一致。試驗使用的抗原參考品和抗體參考品來源于WHO流感參比研究中心。2. 病毒滴度2010年版中國藥典三部種子批檢定中增加了病毒滴度的檢測，該檢測可對病毒在雞胚中的擴增的病毒量進行檢查，以評價疫苗株在雞胚中的復(fù)制能力，同時也是有效確定生產(chǎn)疫苗時工作種子批的稀釋依據(jù)， 可控制每枚雞胚所接受的病毒量。采用半數(shù)雞胚感染劑量法（EID50）檢查，將毒種10倍系列稀釋，每個稀釋度接種10個雞胚尿囊腔，每胚0.2ml。培養(yǎng)48-72小時后篩選活胚，冷胚后取尿囊液進行紅細胞凝集試驗，紅細胞為1%的雞紅細胞。根據(jù)檢測結(jié)果計算病毒滴度，應(yīng)不低于6.5LgEID50/ml。3. 血凝滴度血凝滴度檢測和病毒滴度檢查同樣可對流感病毒的復(fù)制能力進行評價，由于流感疫苗主要以血凝素含量評價做為效力指標，因此血凝效價的測定和結(jié)果對于評估疫苗生產(chǎn)毒種而言比病毒滴度的測定更客觀、可信和重要。檢測方法是取毒種進行系列稀釋（一般為10倍系列稀釋），將每個稀釋度的病毒液與等量的 1雞紅細胞懸液混合于2025放置60分鐘，觀察紅細胞凝集相，以病毒最高稀釋度為判定終點，血凝效價應(yīng)不低于1：160。4. 特異性禽外源因子檢查包括禽白血病病毒和禽腺病毒檢測。將供試品與分別相應(yīng)（亞）型的流感病毒特異性性免疫血清中和后，接種敏感細胞，經(jīng)培養(yǎng)后采用酶聯(lián)免疫法或血清學(xué)方法進行檢查， 結(jié)果應(yīng)為陰性。【毒種保存】一般情況下，主種子批毒種應(yīng)凍干于20以下長期保存， 以保證種子批的性狀穩(wěn)定。一旦第二年WHO公布的流感疫苗株的一株或幾株不變更，則該凍干毒種由于已經(jīng)過全部檢定并經(jīng)前一年疫苗生產(chǎn)的實踐驗證為安全有效，可重新制備工作種子批用于當(dāng)年流感疫苗的生產(chǎn)， 無需重新向WHO索取相應(yīng)的疫苗株。但如果不考慮該因素，由于流感疫苗生產(chǎn)用毒種經(jīng)常更換，可能來年的毒種與今年完全不一致，因此主種子批毒種也不一定需要凍干，制備的液體主種子批保存于60以下也不失為明智之舉。工作種子批由于使用量較大，且往往當(dāng)年使用，則一般均以液體毒種經(jīng)檢定符合規(guī)定后60以下凍存。 【單價病毒原液】單價病毒原液制備的主要工藝步驟包括：將毒種接種雞胚尿囊腔、 培養(yǎng)、病毒收獲、純化，滅活、裂解、再純化等組成。1. 病毒接種、培養(yǎng)為保證生產(chǎn)工藝的一致性，生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)當(dāng)依據(jù)本企業(yè)制備的各型流感病毒工作種子批的病毒滴度，根據(jù)每一雞胚應(yīng)接種的病毒量和體積計算，稀釋成每ml單位內(nèi)的病毒滴度，并應(yīng)遵守同一工作種子批以同一病毒量接種雞胚。由于疫苗生產(chǎn)使用健康雞群來源的雞胚， 因此疫苗生產(chǎn)工藝過程無法保證完全無菌狀態(tài)，為最大限度控制培養(yǎng)過程中的微生物的污染，毒種稀釋液中可加入最低有效抑菌濃度的抗生素。對于在毒種稀釋液中使用抗生素的，應(yīng)按2010年版中國藥典三部的有關(guān)規(guī)定進行檢測，生產(chǎn)工藝其他階段不得加入任何抗生素。 稀釋后的毒種接種雞胚尿囊腔，我國生產(chǎn)企業(yè)現(xiàn)行接種雞胚的工藝有機械全自動或人工接種兩種方式，病毒接種的關(guān)鍵在于接種部位的正確性，應(yīng)當(dāng)正確接種在尿囊腔中，如接種不正確而破壞尿囊腔可導(dǎo)致雞胚死亡。每胚接種病毒液0.2ml， 通常情況下，于3335oC 下進行培養(yǎng)， 由于不同型別的病毒在雞胚中的復(fù)制能力不同，因此培養(yǎng)時間亦有差異，不同型別的流感病毒培養(yǎng)時間一般約為4872小時。 2. 尿囊液收獲培養(yǎng)到期后，經(jīng)燈檢篩選活的雞胚置2-8 oC 過夜或16小時左右冷胚后開始收獲尿囊液,冷胚的目的是使雞胚減少活動度并使雞胚遇冷后血管收縮，易于收集尿囊液。目前收獲方式由機械全自動、 半自動以及人工收獲不同方法。使用機械化自動收獲尿囊液的量較人工收獲方法高。嚴格剔除死胚和控制收獲器具的消毒是有效降低尿囊液細菌內(nèi)毒素含量的關(guān)鍵。每個收集容器中的尿囊液應(yīng)逐一取樣進行檢定。3. 尿囊收獲液檢定31 微生物限度鑒于流感疫苗采用健康雞群來源的雞胚生產(chǎn)， 生產(chǎn)工藝中間產(chǎn)物容易污染細菌， 為最大程度降低有此造成的潛在風(fēng)險， 生產(chǎn)工藝的各中間環(huán)節(jié)進行應(yīng)有效控制微生物的污染程度，加強污染的監(jiān)控。鑒于此，2010年版中國藥典三部新增了尿囊收獲液檢定，包括微生物限度檢查以及特定病原微生物檢查。微生物限度檢查可采用2010年版藥典三部附錄的“微生物限度檢查法”中“細菌、 霉菌及酵母菌計數(shù)”法檢查， 即用將適當(dāng)稀釋的供試品接種到適宜的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)到期后進行菌落計數(shù)并根據(jù)供試品稀釋倍數(shù)計算出供試品中的總菌數(shù)。也可以采用其他適宜的檢測方法作為輔助方法，對尿囊液的污染程度進行有效的控制。雞胚中污染沙門氏菌， 將對人體產(chǎn)生潛在的危害， 因此，對于沙門氏菌等致病菌應(yīng)進行特異性檢測。本版中國藥典三部“微生物限度檢查”中“控制菌檢查法”中， 載明了采用培養(yǎng)基與生化反應(yīng)培養(yǎng)結(jié)合的方式檢測沙門氏菌。 在充分驗證方法一致性的前提下， 也可采用經(jīng)批準的沙門氏菌檢測試劑盒進行快速篩查。 4. 病毒滅活由于收獲的尿囊液不可避免地存在一定數(shù)量的微生物污染，因此， 尿囊液收獲后應(yīng)盡快采用有效的滅活工藝進行病毒滅活，盡可能降低或不增加尿囊液中微生物載荷。 （1）病毒滅活劑可采用甲醛或-丙內(nèi)酯，目前， 國內(nèi)批準上市的均采用甲醛作為滅活劑。甲醛對病毒核酸和病毒蛋白質(zhì)都有破壞作用，蛋白質(zhì)含量對限定甲醛濃度的滅活效果至關(guān)重要， 所以病毒滅活應(yīng)在工藝驗證規(guī)定的蛋白質(zhì)含量范圍內(nèi)進行。在控制蛋白質(zhì)含量的檢測方法上， 國內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)通常采用Lowry法檢測蛋白質(zhì)含量，國外有些生產(chǎn)企業(yè)采用更為便捷的分光光度法控制中間產(chǎn)物的蛋白質(zhì)含量， 檢測波長為280nm的吸收值， 因蛋白質(zhì)在280nm處有最大的吸收峰， 以此作為蛋白質(zhì)含量監(jiān)測的參考指標， 以保證滅活工藝的穩(wěn)定性。（2）WHO指南和歐洲藥典中均規(guī)定病毒滅活工藝應(yīng)在2-8下進行。國內(nèi)企業(yè)病毒滅活一般采用一步法滅活， 滅活溫度通常為2-8； 國外有的企業(yè)采用二步法滅活工藝， 即在2-8冷滅活一定時間后， 再于25放置一定時間進行熱滅活。 對于甲醛滅活劑的濃度， 歐洲藥典規(guī)定， 且生產(chǎn)工藝任何階段加入的滅活劑的濃度不得超過200ug/ml； WHO指南規(guī)定甲醛使用濃度不超過400 ug/ml；為控制甲醛對病毒抗原性的影響， 本版中國藥典三部規(guī)定的甲醛終濃度不高于200g/ml； 對于病毒滅活時間， 國內(nèi)外均沒有統(tǒng)一的要求， 應(yīng)根據(jù)各生產(chǎn)企業(yè)的生產(chǎn)工藝和驗證結(jié)果進行確定， 并按照批準的病毒滅活時間執(zhí)行。（3）國內(nèi)現(xiàn)批準的流感病毒裂解疫苗病毒滅活工藝可在不同工藝階段進行，有些企業(yè)的標準是在尿囊液收獲后立即進行病毒滅活， 有些是在病毒純化后滅活。國外生產(chǎn)企業(yè)的病毒滅活工藝都是在病毒純化后進行，避免了尿囊液中含有大量的組織蛋白，影響甲醛對病毒的作用； 同時， 純化后的尿囊液中極大部分雜蛋白被有效去除，且經(jīng)過超濾濃縮后病毒液體積大大降低，可減少病毒滅活驗證試驗檢測樣品的數(shù)量，抽樣檢測的結(jié)果更具有代表性； 另外， 純化工藝一定程度上可降低尿囊液中污染的微生物數(shù)量，因此， 從工藝優(yōu)化的角度講，病毒滅活工藝在純化