第 25 卷 第 6 期農 業 工 程 學 報Vol.25No.6 2142009 年6 月Transactions of the CSAEJun. 2009 能源甜菜酒精發酵的工藝優化及數學模型 史淑芝 1,2，程大友2，徐德昌2，馬鳳鳴1，魯兆新2， 董愛軍 2，代翠紅2，羅成飛2 （1東北農業大學農業部寒地作物生理生態重點開放試驗室，哈爾濱 150056； 2哈爾濱工業大學食品科學與工程學院，哈爾濱 150090） 摘要：利用菌種 ADY（Saccharomyces cerevisiae）對能源甜菜 NY0503 進行酒精發酵。應用 Plackett- Burman 設計法從 底物濃度、料液比、加菌量、營養鹽添加量、加磷量、pH 值、轉速、發酵溫度和發酵時間 9 個因素中篩選出了加磷量、 發酵溫度和底物濃度為主要影響因素，并用響應面分析法求出回歸方程。結果表明，經優化后最佳工藝條件為：底物濃 度 12%、料液比（質量比）11、加菌量 15%、營養鹽添加量 0.5、加磷量 1.9%、pH 5.0、轉速 130 r/min、發酵溫度 31 和發酵時間 44 h，共進行 5 批次驗證試驗，結果為酒精轉化率的平均值為 95.48%，與模型的理論值 96.54%的差值僅占 理論值的 1.09%，進一步說明所建立的模型是切實可行的。 關鍵詞：酒精發酵，工藝優化，數學模型，能源甜菜 doi：10.3969/j.issn.1002-6819.2009.06.040 中圖分類號：TS261.4文獻標識碼：A文章編號：1002-6819(2009)-6-0214-05 史淑芝，程大友，徐德昌，等.能源甜菜酒精發酵的工藝優化及數學模型J. 農業工程學報，2009，25(6)：214218. Shi Shuzhi, Cheng Dayou, Xu Dechang, et al. Technological optimization and mathematical model of alcohol fermentation of energy beetJ. Transactions of the CSAE, 2009,25(6)：214218.(in Chinese with English abstract) 0引言 隨著全世界能源的不斷擴展，可再生的生物質能源 將是本世紀主要的能源物質1- 4。從 20 世紀 70、80 年代 開始，世界上許多國家就開始尋求利用可再生的生物質 進行能源開發5。而隨著我國經濟的飛速發展，能源的消 耗越來越大，石油資源的短缺，長期供應能力不足的問 題日顯突出6。 酒精是一種可再生能源,也是石化燃料最有希望的替 代產品7,8。這在世界上許多國家的人們都已達成共識。 但怎樣才能找到一種適宜的能夠產生酒精的可再生的生 物質，又擺在人們面前。 甜菜作為糖料作物早已為人類所利用， 從 20 世紀 90 年代末開始，由于受世界食糖市場不穩定和石油能源緊 張的影響，少數發達國家便開始嘗試選育能源甜菜的研 究9。由于能源甜菜是新興的可再生能源作物10，它具有 生物學產量高，含糖量適中等特點，是環保能源，又是 糖飼兼收的作物11。同時，利用能源甜菜發酵生產燃料 酒精還具有良好的環境效益和經濟效益。 利用能源甜菜進行酒精發酵，主要是對篩選所得到 的其組分適于酒精發酵的甜菜塊根進行研究。本研究針 收稿日期：2008- 10- 28修訂日期：2009- 12- 30 基金項目： 農業部寒地作物生理生態重點開放試驗室開放基金： 國家科技部 專項基金（NCSTE- 2006- JKZX- 022） 作者簡介：史淑芝（1967） ，女，博士研究生，副研究員，研究方向：植 物生理及農產品深加工。 哈爾濱市南崗區海河路 202 號哈爾濱工業大學食 品學院 2649 信箱，150090。Email: 通訊作者：馬鳳鳴（1947） ，男，教授，博士生導師，從事作物生理研 究。哈爾濱市香坊區木材街 59 號東北農業大學農學院，150030。 Email: Fengming_ 對酒精發酵過程中存在的共性技術難題開展研究，研究 利用能源甜菜塊根發酵生成酒精的最佳工藝參數，建立 適宜的數學模型12，最終獲得較高的酒精轉化率，從而 為工業化生產和提高經濟效益提供理論依據。 1材料與方法 1.1試驗材料 材料：能源甜菜 NY0503。 供試菌種：ADY（Saccharomyces cerevisiae） 。 試劑：AlCl36H2O，(NH4)2SO4，Mg SO4，KH2PO4， CaCl2，過磷酸鈣，鹽酸，蒸餾水。 儀器及用品：500 mL 容量瓶，100 mL 量筒，自制鋸 糊機， VENEMA 甜菜檢糖自動線， 天平， pH 計， DH5000 型恒溫培養箱，HZQ- F160A 型恒溫振蕩培養箱，EYELA N- 1000 旋轉蒸發儀，酒精計。 1.2試驗方法 1.2.1發酵底物制備 每個處理設 3 個平行試驗，按以下順序及方法進行。 1）制糊：取切削標準的 NY0503 甜菜塊根洗凈后用 自制的鋸糊機加工成糊狀，充分混勻。 2）蔗糖測定及配制底物濃度：用荷蘭進口的 VENEMA 甜菜檢糖自動線檢測樣品的蔗糖含量，具體做 法為：先配制 AlCl3溶液，使其含量為 85 g/L，待使用前 將其稀釋 47 倍達 1.81 g/L 后作為浸提液使用；浸糖時用 26 g 甜菜糊加入 177 mL 浸提液，充分攪拌后用甜菜檢糖 自動線檢測樣品的蔗糖含量，然后根據其蔗糖含量將樣 品分別配制成 12%和 15%的底物濃度。 3） 配制料液比： 取 100 g 甜菜糊放入 500 mL 三角瓶 內， 用蒸餾水按試驗要求分別配成 10.5 和 11 的料液 第 6 期史淑芝等：能源甜菜酒精發酵的工藝優化及數學模型215 比（質量比） 。 4）殺菌：在每個三角瓶內分別加入藥料比為 0.004% 的五氯苯酚鈉，混勻后將三角瓶放在 50的搖床內以 180 r/min 的轉速殺菌 30 min13。 5）添加營養鹽：每種營養鹽的添加量見表 1。 表 1營養鹽的添加量 Table 1Addition amount of nutrition saltsgL- 1 水平(NH4)2SO4MgSO4KH2PO4CaCl2 0.50.552.52.5 111055 6）調整磷含量：將過磷酸鈣溶解，再加入到每個三 角瓶中使其終濃度達到試驗所要求的 1%或 2%水平。 7）調節 pH 值：用酸度計對每個三角瓶內的樣品用 濃鹽酸進行 pH 值調節，最終達到試驗方案的要求。 8）加菌：將活化好的菌種按試驗方案要求分別以 10%或 15%的菌量加到每個三角瓶中，然后混勻。 9）稱重：最后用天平將每個培養瓶進行稱量，并記 錄數據，以便進行發酵過程控制的 CO2失重測定。 1.2.2酒精發酵 首先，將已制備好的三角瓶放在 28的搖床培養箱 中，以 150 r/min 的轉速培養 4 h，并將瓶塞旋松，使部分 氧氣進入，以使酵母菌在有氧條件下快速繁殖。 然后，再將培養箱溫度分別調至 31和 35，轉速 分別調至 100 r/min 和 130 r/min，使培養瓶在近乎厭氧條 件下進行酒精發酵達到試驗所要求時間， 并且每隔 6 h 測 定一次 CO2失重量。 最后，以 CO2失重小于 0.1 g/h 時視為發酵終止，將 三角瓶取出，進行蒸餾14。 1.2.3酒精蒸餾及測定 將成熟的發酵醪全部倒入 500 mL 的圓底燒瓶中， 并 將旋轉蒸發儀的水浴鍋溫度調至 52，緩慢蒸發，以使 發酵所產生的酒精盡可能全部蒸出；最后將收集瓶中的 餾出液定容至 100 mL，混勻后倒入 100 mL 量筒中,用酒 精計 （標溫 20） 測酒精度（下緣為準） ，同時測定溫度， 然后換算成 20時的酒精度。每個處理做 3 次平行試 驗15。 1.2.4酒精轉化率計算方法 = mLg/mL g%53.8 100% 酒精轉化率 發酵醪體積() 發酵醪酒精含量(體積百分數) 相應密度() 發酵底物質量( ) 含糖率( ) 式中53.8100 g 蔗糖理論上轉化為酒精的質量，g。 1.3試驗設計 應用 SAS（Statistical Analysis System）V8.2 統計分 析軟件進行試驗設計和分析。 1.3.1Plackett- Burman（P- B）設計 Plackett- Burman（P- B）設計法是一種近飽和的兩水 平試驗設計方法。它能用最少試驗次數估計出因素的主 效應，以從眾多的考察因素中快速有效地篩選出最為重 要的幾個因素，供進一步研究16。 應用 Plackett- Burman（P- B）試驗設計法篩選重要因 素，并根據有關參考文獻和單因素試驗的結果9，設計 Plackett- Burman（P- B）試驗因素及水平，如表 2 所示。 表 2Plackett- Burman（P- B）設計的試驗因素與水平 Table 2Experimental factors and levels of Plackett- Burman(P- B) design 水平 因素 - 11 底物濃度/%1215 料液比1:0.51:1 加菌量/%1015 營養鹽0.51 加磷量/%12 pH 值4.55.5 轉速/rmin- 1100130 發酵溫度/3135 發酵時間/ h4460 注：1）營養鹽的添加為水平值，無單位；2）發酵時間在 4460 h 之間， CO2失重均小于 0.1 g/h，酒精轉化率稍有降低，但到 60 h 以后酒精轉化率 急劇下降，故設這兩個水平。 1.3.2Box- Behnken 設計及響應面分析 根據 Plackett- Burman（P- B）試驗設計法所篩選出的 3 個重要因素，利用 SAS V8.2 統計分析軟件進行試驗 Box- Behnken 設計，并進行響應面分析，從而確定 3 個重 要因素的最佳水平。 2結果與分析 2.1根據 PlackettBurman 設計法篩選重要因素 本文根據以前的研究和文獻報道17，選用試驗次數 N=12的試驗設計，對底物濃度（X1）、料液比（X2）、 加菌量（X3）、營養鹽（X4）、加磷量（X5）、pH（X6）、 轉速（X7）、發酵溫度（X8）和發酵時間（X9）9個因素 進行考察，響應值為酒精轉化率（Y）。發酵試驗設計及 試驗結果見表3。 表 3Plackett- Burman 試驗設計表及響應值 Table 3Plackett- Burman design table and response values 序號X1X2X3X4X5X6X7X8X9Y/% 11- 11- 1- 1- 111176.15 211- 11- 1- 1- 11174.79 3- 111- 11- 1- 1- 1197.43 41- 111- 11- 1- 1- 182.28 511- 111- 1- 1- 1- 197.44 6111- 111- 11- 191.33 7- 1111- 111- 1190.15 8- 1- 1111- 111- 192.95 9- 1- 1- 1111- 11187.46 101- 1- 1- 1111- 1187.36 11- 11- 1- 1- 1111- 187.02 12- 1- 1- 1- 1- 1- 1- 1- 1- 189.10 注：底物濃度（X1）、料液比（X2）、加菌量（X3）、營養鹽（X4）、加磷 量（X5）、pH（X6）、轉速（X7）、發酵溫度（X8）和發酵時間（X9）9 個 因素進行考察，響應值為酒精轉化率（Y）。 采用 SAS V8.2 進行各因素主效應分析結果見表 4。 可見針對 ADY 菌種， 發酵起重要作用的 3 個因素依 216農業工程學報2009 年 次為加磷量，底物濃度和發酵溫度，這 3 個因素均達到 了 95%的顯著水平；而加磷量的效應值為正值，底物濃 度和發酵溫度的效應值為負值，這在下一步水平設計時 需要充分考慮。 進而從表 4 的估計效應和 t 值兩列中也可 以發現：發酵過程中加入磷量的多少對試驗結果影響極 大，另外發酵溫度和底物濃度對最終轉化率影響也較大。 表 4統計分析結果 Table 4Results of statistic analysis 因素 符號 因 素 估計 效應 標準差t 值P 值排序 X1底物濃度- 5.79330.1812- 4.90480.03912 X2料液比3.810.18123.22560.08425 X3加菌量1.18670.18121.00470.42097 X4營養鹽- 0.55330.1812- 0.46850.68558 X5加磷量9.080.18127.68740.01651 X6pH 值- 0.37670.1812- 0.31890.78009 X7轉速1.44670.18121.22480.34536 X8發酵溫度- 5.67670.1812- 4.80600.04073 X9發酵時間- 4.46330.1812- 3.7780.06344 注：表中標準差是針對整個實驗的處理誤差，故為同一值。 2.2應用響應面分析法確定重要因素的最佳水平 2.2.1試驗因素水平設計 通過上述 Plackett- Burmen 設計得到的結果可知，各 因素水平可按表 4 中的效應值選取適當的水平，并分析 出：針對 ADY 菌種，加磷量，發酵溫度和底物濃度為影 響酒精發酵結果的 3 個主要因素，根據其效應值的大小 和正負按排響應面試驗 3 個因素和水平如表 5。 表 5響應面分析試驗因素與水平 Table 5Experimental factors and levels of Response Surface Methodology(RSM) 水平 編號因素 - 101 X5加磷量/%11.82.5 X8發酵溫度/283133 X1底物濃度/%81215 2.2.2響應面分析試驗設計及結果 由表6可見：本試驗共通過15次試驗來完成，其中12 次試驗為析因點分析試驗，并設置三次中心點重復試驗， 用來估計試驗誤差；以酒精的轉化率為響應值，根據表6 中Box- Behnken設計的試驗結果， 運用SAS軟件對表6的結 果進行二次回歸分析，得到二次回歸方程Y= 96.14333 + 2.8075X5- 1.4375X8- 2.48X1- 11.96667X5X5- 0.565X5X8+ 0.29X5X1-5.72666X8X8-1.905X8X1- 9.481667X1X1，回歸 方程方差分析及模擬可信度分析結果見表7和表8。 從方差分析表7可以看出模型在 =0.01 水平上回歸 顯著，一次項、二次項對響應值有顯著性影響，但交互 項影響不顯著，說明所選因素之間的交互作用不明顯， 采用該模型時可以不考慮因素間的交互作用；失擬項反 映的是試驗數據與模型不相符的情況， P=0.2805720.1， 說明失擬不顯著，因此證明模型選擇正確。 從表8可見：決定系數R2為98.64%，說明此模型可以 解釋98.64%試驗所得的酒精轉化率的變化，表明方程擬 合程度較好。而Y的變異系數CV則表示試驗的精確度， CV值越高，試驗的可靠性越低，本試驗中CV=2.043647， 數據較低，說明此試驗操作可信。綜上說明該回歸方程 為能源甜菜固態發酵產生酒精預測提供了一個合理的模 型。 表 6響應面分析試驗設計及發酵結果 Table 6Design of RSM and fermentation results 序號X5X8X1響應值 Y/% 1- 1- 1077.23 2- 11073.45 31- 1084.58 411078.54 50- 1- 182.45 60- 1180.26 701- 185.42 801175.61 9- 10- 174.44 1010- 178.87 11- 10169.94 1210175.53 1300096.52 1400097.08 1500094.83 表 7回歸方程的方差分析 Table 7Analysis of variance for regression equation 變異來源自由度平方和方差F值P值 X5163.0564563.0564522.646710.005065 X8116.5312516.531255.9371950.058897 X1149.203249.203217.671320.008459 X5X51528.7426528.7426189.89780.0001 X5X811.27691.27690.4585980.52834 X5X110.33640.33640.1208180.742303 X8X81121.0882121.088243.488790.001205 X8X1114.516114.51615.2134550.071244 X1X11331.9459331.9459119.21830.000112 模型91011.583112.398240.367780.000387 一次項3128.790942.930315.418410.00584 二次項3866.6631288.8877103.7540.0001 交互項316.12945.3764671.9309570.242783 誤差項513.921772.784353 失擬項311.17773.72592.7156050.280572 純誤差22.7440671.372033 所有項141025.505 表 8模型可信度分析 Table 8Fit statistics for the model 平均值決定系數R2校正后的R2模型誤差的平方根 Y的變異系數CV 81.6598.64%96.20%1.6686382.043647 注：表中的81.65為所有響應值的平均值。 2.2.3響應面分析及試驗因素的最佳水平確定 通過回歸方程繪制分析圖，研究所擬合的相應曲面 的形狀， 響應面立體分析圖和相應等高線圖， 分別見圖1、 圖2和圖3。從圖1、2、3中及軟件分析可見，回歸方程存 第 6 期史淑芝等：能源甜菜酒精發酵的工藝優化及數學模型217 在穩定點，同時穩定點為極大值。從圖1、圖2和圖3的等 高線圖中可以看出：其等高線圖近乎為圓形，說明任意 兩因素間交互作用不顯著；而從線條的疏密程度可以得 出：X5（加磷量）比X8（發酵溫度）和X1（底物濃度）對 響應值所起的作用要大， 而X8和X1對響應值所起的作用差 異不明顯。 圖1Y=f(X5, X8)響應面立體分析圖和等高線圖 Fig.1Response surface and contours of adding phosphor and fermentation temperature 圖2Y=f(X5, X1)響應面立體分析圖和等高線圖 Fig.2Response surface and contours of adding phosphor and substrate concentration 圖3Y=f(X8, X1)響應面立體分析圖和等高線圖 Fig.3Response surface and contours of fermentation temperature and substrate concentration 通過嶺脊分析得到，Y 值的預測極大值為 96.54%， 而該預測值的標準誤為 0.9516，表明該試驗達到了顯著 水平；極大值所對應的 3 個主要因素（X5，X8，X1）的編 碼值及對應量見表 9。 表 9嶺脊分析因素與水平 Table 9Factors and levels for ridge analysis 因素編碼值Y/% X50.118521.88 X8- 0.1117730.66 X1- 0.1177411.53 2.2.4驗證試驗 根據實際情況分別將加磷量 （X5） ，發酵溫度 （X8） ， 底 物濃度（X1）的水平定為加磷量 1.9%,發酵溫度 31，底 物濃度 12%。在以上優化條件下進行驗證試驗，共進行 5 批次 500 mL 搖瓶試驗，酒精轉化率平均結果為 95.48%， 該試驗值（95.48%）與模型的理論值（96.54%）的差值 僅占理論值的 1.09%， 可見該模型可以較好地反映出利用 ADY 菌種將能源甜菜 NY0503 塊根轉化成酒精的條件。 3結論 1）從底物濃度、料液比、加菌量、營養鹽添加量、 加磷量、pH、轉速、發酵溫度和發酵時間 9 個與發酵相 關的因素中篩選出加磷量、發酵溫度和底物濃度 3 個主 要影響因素。 2）利用響應面分析法優化后最佳工藝條件為：底物 218農業工程學報2009 年 濃度 12%、料液比 11、加菌量 15%、營養鹽 0.5、加磷 量 1.9%、pH 5.0、轉速 130 r/min、發酵溫度 31和發酵 時間 44 h。 3）優化條件下驗證試驗結果為：酒精轉化率的平均 值為 95.48%， 與模型的理論值 96.54%的差值僅占理論值 的 1.09%，進一步說明所建立的模型是切實可行的。 參考文獻 1路 明開發生物質能源發展能源農業N人民日報， 2005- 06- 20 2Berndes G, Hoogwijk M, Broek R. 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