農林學類論文-番茄細菌性斑點病菌無毒基因研究進展作者：張月娟朱秀秀陳新趙廷昌論文關鍵詞無毒基因；抗病基因；植物防御反應；過敏性壞死反應論文摘要番茄細菌性斑點病是影響番茄產量和品質的重要病害，Pseudomonassyringaepv.tomato(Pst)為其病原菌，其與番茄的互作系統是研究植物抗感病機理的典型模式系統。Pst存在2種無毒基因：avrPto和avrPtoB，它們編碼的蛋白質均能與番茄抗性基因P0編碼的serThr蛋白激酶互作，符合Flor“基因對基因”學說。AvrPto和AvrPtoB在表達Pto的抗性植物中，與Pto互作，表現無毒功能，引發植物防御反應；而在缺失Pto的感病植物中，它們具有毒性，促進細菌的生長。本文綜述了番茄細菌性斑點病菌無毒基因avrPto及avrPtoB的結構特點及其功能，這有助于了解病原物與植物的互作機制，對認識植物的感病性、抗病性以及植物防御反應都具有重要意義。番茄是重要的經濟作物，每年因病蟲危害，造成其大量減產。番茄細菌性斑點病是危害番茄生產的重要病害之一，為一種世界性病害，主要危害番茄的葉、莖、花、葉柄和果實。自1933年首次報道以來，在全球26個國家均有發現，我國也于1998年發現。據報道，該病可造成575的產量損失。該病的病原菌是丁香假單胞番茄致病變種Pseudomonassyringaepv.tomato(Pst)。Pst與番茄的互作系統是研究病原物與植物互作的典型模式系統，該系統的無毒基因(avirulencegene，avr)和抗病基因(resistencegene，R)符合Flor“基因對基因”學說。當病原物中存在無毒基因avrPto或avrPtoB，寄主中存在并表達相應抗病基因Pto時，無毒蛋白就會與抗病蛋白相識別，激活植物防御反應系統，引起過敏性壞死反應(hypersensitivereaction，HR)，從而抑制細菌的生長。本文綜述了番茄細菌性斑點病無毒基因avrPto及avrPtoB的結構特點及其功能，從無毒基因的角度闡述病原物與植物的互作機制，這對認識植物的感病性、抗病性以及植物防御反應都具有重要意義。1病原菌Pseudomonassyringaepv.tomatoPseudomonassyringae是農業上重要的植物病原細菌，根據其宿主特異性，該菌可分為50多個致病變種Pst是其中的一個致病變種，該菌菌體短桿狀，直或稍彎，單細胞，大小為(0.11)m(1.54)m，革蘭氏陰性，在含蔗糖的培養基上能產生綠色熒光，超過41不能生長。該菌株能夠侵染番茄和擬南芥。Pseudomonassyringaepv.tomatoDC3000是Pseudomonassyringaepv.tomato的模式種，2003年C.R.Buell等報道了它的全基因組序列，這是丁香假單胞菌屬中第一個被完全測序的菌株，此工作的完成為研究Pst的致病機理奠定了基礎。Pst存在2個小種：0號小種和1號小種，2個小種的區別在于它們對抗病番茄具有不同的毒力。在抗病番茄上接種Pst的0號小種，植物會產生HR反應；而在抗病番茄上接種1號小種，Pst大量增殖，引起感病反應。如果將O號小種或1號小種接種于不表達Pro的感病番茄植株上，它們都會引起番茄的感病反應。2無毒基因簡介植物機體內存在防御機制，當植物受到病原菌侵襲時，能夠檢測到病原菌，從而延遲或抑制疾病的發生。植物的防御反應包括兩種：一種是基礎防御反應，包括細胞壁的加厚，防御相關蛋白的表達等；另一種是依賴于抗性蛋白的HR反應，是指在抗病植物中存在抗病基因(R)，其表達的抗病蛋白(R蛋白)能夠識別病原菌型分泌系統(typesecretionsystem，TTSS)的效應因子，與之互作，從而激活植物防御反應系統，引起過敏性壞死反應(HR)，過敏性壞死反應的主要表現就是引起侵染位點的局部快速的程序性壞死反應(programedcelldeath，PCD)，從而抑制侵染位點病原菌的生長和擴展。病原菌必須克服植物防御反應，從中獲得營養得以增殖，才能夠使植物發病。很多革蘭氏陰性菌侵襲植物都需要TTSS，病原菌通過TTSS將效應蛋白注入植物體內，這些蛋白進入寄主細胞后，可以通過修飾或改變寄主的關鍵蛋白來促使植物發病。目前已鑒定了50多種可以進入寄主細胞的病原菌效應蛋白，這些效應蛋白進入寄主細胞后，修飾或改變寄主的關鍵蛋白以改變植物的生理狀態，抑制植物防御反應，從而提高病原菌的生存適合度，最終導致其大量增殖，致使植物發病。TTSS中編碼型泌出通道的hrp(HRandpathogenicity)和hrc(HRandconserved)基因、編碼效應蛋白的avr(avirulence)和hop(Hrpdependentoutprotein，依賴hrp的泌出蛋白)基因，均決定著植物病原細菌在寄主和非寄主植物上的反應。無毒基因是病原菌的遺傳因子，其編碼產物能夠激發病原物與寄主特異性互作。病原物無毒基因與植物抗病基因產物之間相互作用導致產生的基因對基因抗性是植物抗病性的重要形式。無毒基因(avr)被認為是一類兩性效應因子(bifunctionaleffector)，在決定病原細菌的無毒性和致病性兩方面均起作用：在含互補抗病基因植物中表現無毒效應，而在不含互補抗病基因植物中顯示毒性效應。雖然大部分無毒蛋白的功能至今還不清楚，但已探清一些無毒蛋白的氨基酸序列和已知蛋白序列同源，如avrBs3、pthA以及avrb6都具有NLS(nuclearlocalizationsignal)序列，將含有放射性標記的基因嵌入到NLS區，能定位到細胞核中。這就表明，定位于細胞核對于發揮無毒基因功能是必要的。Pst存在2種無毒基因：無毒基因avrPto和avrPtoB。這2種無毒基因均已克隆并獲得全序列，1992年從Pst的O號小種中克隆到無毒基因avrP-to，2002年又克隆到了無毒基因avrPtoB。avrPto和avrPtoB序列一致性很低，分別編碼具有18ku和59ku的蛋白質。關于它們的功能，2005年N.C.Lin等構建了DC3000avrPto、avrPtoB以及avrPtoavrPtoB突變體，分別接種于感病番茄上，發現野生型DC3000引起的癥狀較單突變體的癥狀嚴重，單突變體的癥狀又較雙突變體嚴重，而菌群數量沒有差別。由此可見，avrPto和avrPtoB是Pseudomonassyringaepv.tomatoDC3000上僅有的無毒基因。AvrPtoPto和AvrPtoBPto符合Flor“基因對基因”學說。AvrPto和AvrPtoB通過TTSS進入到植物體中，在缺失Pto的感病番茄中，它們是毒性因子，能夠促進細菌的生長；在表達Pto的抗病番茄中，它們作為無毒因子，能夠引起宿主的HR反應。Pto存在于抗病番茄中，編碼一個絲氨酸一蘇氨酸(Ser-Thr)的蛋白激酶，它能特異性的識別avrPto或avrPtoB編碼的無毒蛋白，激活植物防御反應系統，從而引發植物的抗病反應。3無毒基因avrPto31avrPto基因結構特點無毒基因avrPto存在于PstO號小種中，于1992年首次分離。無毒基因avrPto編碼一個由164個氨基酸組成的18ku親水性蛋白質，其N末端具有十四烷基結構域和棕櫚酸鹽結構域，這兩個結構域能將蛋白定位并穩定于植物細胞膜上。缺失N末端十四烷基結構域的AvrPto突變體G2A，不能將AvrPto定位于植物細胞膜上，也不能與Pto互作，從而不能引起基于Pto介導的抗病反應。因此，推測無毒蛋白AvrPto在Pst的細胞質中合成，通過TTSS進入到植物細胞中，在植物細胞膜上與Pto識別、互作、引起植物的抗病反應。AvrPto和其他無毒蛋白一樣，在GenBank和EMBL中沒有發現它的同源序列。avrPto啟動子上游具有hrp基因簇，該基因簇位于-42至-34區域，能夠調節avrPto的表達，缺失突變-34區域能引起avrPtomRNA表達量急劇下降，因此該位點可能是轉錄因子的識別位點。-37至-31的核苷酸序列TGGAACC，除了存在于avrPto的上游以外，也存在于其他很多無毒基因的上游，例如，avrPph3、avrB、avrC、avrD、avrRpt2以及hrpAB、hrpF、hrpS。但是，還沒有直接的試驗結果證明該位點是轉錄因子的結合位點。分析AvrPtoPto互作的晶體結構，發現AvrPtoPro的互作依賴于AvrPto的一端的螺旋束和GINP結構域(Gly-Ile-Asn-Pro)，它們分別能夠與Pro蛋白激酶的P-1環和P+1環結合。32avrPto的無毒功能avrPto在表達Pto的抗病番茄上具有無毒功能，在缺失Pto的感病番茄上具有毒性功能。將Pst1號小種接種于表達Pto的抗病番茄中，引起寄主的HR反應；將avrPto采用農桿菌的方法轉化到表達Pto的Nicotianatabacum和N.benthamiaria的葉片中，能夠引起煙草的HR反應。說明AvrPto是一個能夠單獨起作用無毒因子，番茄Pto基因家族的成員能夠直接或間接地識別它，引起抗病反應。1996年Tang等通過酵母雙雜交系統分析AvrPto和Pto是否能直接互作，結果表明，AvrPto能與Pto發生高度特異性互作，而與Pto基因家族的其他成員不能互作。迄今為止，通過純化的蛋白還不能證明AvrPto和Pto能否在體外互作，因此還不能證明是否有其他宿主蛋白參與互作。后續的研究發現要激活植物抗性，除了需要AvrPto和Pto外，還需要富含亮氨酸重復(leucine-richrepeat，LRR)的Prf蛋白、Fbox蛋白SGTl以及HSP90。為了研究AvrPtoPto互作機制，Shan等構建了AvrPto的多個突變體，發現AvrPto的164個氨基酸并不都是與Pto互作所必需的。Lin等構建重組AvrPto蛋白，即第19個氨基酸包含十四烷基化結構域和十六酰基化結構域和部分AvrPto蛋白(29133)組成融合蛋白，通過農桿菌方法轉化到表達Pro基因的抗性番茄中，發現仍然能夠引起HR反應；去掉N末端的30個氨基酸以及C末端的40個氨基酸也不影響AvrPto與Pto在酵母雙雜交系統中的互作，說明AvrPto的N末端和C末端并不是AvrPtoPto互作所必需的；點突變AvrPto蛋白164個氨基酸中的60個不影響其與Pto的互作。一直以來，人們認為AvrPto與Pro互作激活了Pto的激酶活性，然而，最近研究AvrPtoPto復合體的晶體結構發現，AvrPtoPto互作并沒有改變Pto激酶活性，而是激活了Prf的活性。在缺失AvrPto時，Pto激酶上的-1與P+1環能夠抑制Prf活性，從而抑制其介導的抗性反應；一旦AvrPto與Pto互作，Pro激酶上的1和P+1就會和AvrPto上的螺旋束以及GINP結構域(Gly-IleAsn-Pro)互作，從而改變了Pto與Prf原有的互作方式，激活Prf，引起Prf介導的抗病反應。研究還發現AvrPto有2個顯著的結構域，其中由S94、I96和G99所編碼AvrPto的結構域對于識別Pto蛋白中N145、P146、S147和S153編碼的結構域很重要，它們可能參與AvrPtoPto互作。33avrPto的其他功能AvrPto除了能夠和Pto互作，引發Pto介導的抗病反應之外，還能夠抑制番茄上非寄主病原菌引起的HR反應。Pseudomonassyringaepv.tomatoTl是N.benthamiana的非寄主病原菌，它能夠在Nbentharniana上引起HR反應。然而在此植株上如果同時接種Pseudomonassyringaepv.tomatoT1和P.s.pv.tomatoDC3000時，這種壞死反應就會被延遲；對AvrPto的突變體研究發現，AvrPto的某些結構域對于抑制PCD是必須的，如G2A，P146L以及N末端的12個氨基酸。因此，抑制宿主PCD反應是成功侵染宿主植物的策略之一。4無毒基因avrPtoBavrPtoB廣泛存在于植物病原細菌各菌屬中，包括假單胞菌屬(Pseudornonas)、黃單胞菌屬(Xanthornonas)、雷爾氏菌屬(Ralstonia)和歐文氏菌屬(Erwinia)。無毒蛋白AvrPtoB一方面在感病植株中能夠增加細菌的毒性，抑制番茄免疫反應及PCD，促進細菌的生長；另一方面在抗病植物中，AvrPtoB通過型分泌系統進入植物細胞，與抗性蛋白Pto互作，引發HR反應。41avrPtoB的發現avrPtoB是偶然發現的，在研究avrPto時，將avrPto的缺失突變菌株接種于表達Pto的抗病番茄中，結果發現仍然存在HR反應。這就表明在丁香假單胞菌中可能存在第2個無毒基因，它和avrPto一樣，能夠與Pto互作，引起抗性反應。為了分離出該基因，Kim等利用酵母雙雜交系統，以Pto蛋白為誘餌，在P.s.pv.tomatoDC3000的文庫中篩選和Pto互作的基因，進而找到了avrPtoB。進一步研究證明AvrPto和AvrPtoB都是引起Pto介導的植物抗病的效應因子。42avrPtoB的結構特點avrPtoB編碼一個59ku的蛋白質，該蛋白是一個組成性的蛋白質，可以分為N末端和C末端兩部分，Abranmovitch等構建了僅包括N端1308個氨基酸序列的AvrPtoBC末端缺失突變體，發現該突變體能夠在酵母雙雜交系統中與Pto互作，并能引起N.bentharniana的HR反應。由此可見，AvrPtoB的N端是其與Pto互作所必需的。AvrPtoB的C端(308533)具有CDS(celldeathsuppressor)的活性，能夠抑制寄主植物的PCD反應。同時其還具有的GINP結構域，雖然對于AvrPtoBPto的互作沒有影響，但會影響Pto引起的HR反應。Kim等構建GINP位點突變體發現，AvrPtoBC末端的44個氨基酸對于抑制細胞程序性壞死反應是必須的，當突變該44個氨基酸，AvrPtoB突變體就會引起，N.bentharniana上的程序性壞死反應，這種PCD反應的獲得表明AvrPtoB的CDS活性能夠