第九節 基因工程在發酵工程中的應用,以天然產物為基礎發展藥物的方法,獲得新型結構和生物活 性的抗生素變得越來越難,一. 自然分離,合成步驟繁多、合成產率低下,二. 化學合成,以微生物作為“細胞工廠”，通過對代謝途徑的遺傳控制，生物合成所需要的新型藥物。,基因工程改造傳統制藥工業 體現在四個方面,1、抗生素生產：分離抗生素合成酶基因，提高產量、得到雜合抗生素； 2、氨基酸生產：基因克隆的工程菌、細胞融合育種； 3、維生素生產：構建制造維生素C的基因工程菌； 4、疫苗生產：把抗原克隆到 E. coli中大量生產疫苗。,直接從自然界分離得到的菌株為野生型菌株。,菌種選育,突變、體內重組、 體外重組（基因工程）,一、基因工程在抗生素生產中的應用,往往低產甚至不產所需的產物，只有經過進一步的人工改造才能真正用于工業生產,微生物基因工程育種,這是一種自覺的、能像工程一樣事先設計和控制的育種技術，可以完成超遠緣雜交，是最新最有前途的育種方法。,獲得特定的目標基因,載體 (質粒或病毒),目標基因片段,質粒DNA片段,內切酶切割,細胞外重組,重組DNA,重組DNA進入受體細胞并擴增、表達,具有目標基因表達功能的重組體,利用遺傳標記篩選,轉化(質粒)、轉導或轉染(病毒),（一） 抗生素生物合成基因的特點及其克隆的策略和方法,1、抗生素生物合成基因群成員的結構特點,在已知的微生物所產生的抗生素中，約23由放線菌產生，而其中的80來源于鏈霉菌；鏈霉菌屬中的鏈霉菌，有約500個種。,2002年5月，Bentley S.D.等在英國 Nature 報道了鏈霉菌的模式種天藍色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor) A3 (2)菌株的基因組全序列研究結果：基因組全序 8,667,507 bp，GC含量72.12%，7825個基因，55個假基因，基因平均長度991 bp，編碼密度88.9%。, 鏈霉菌抗生素生物合成基因群成員的DNA組成 GC含量高達70以上； 三聯體密碼子中的第三個堿基的GC比例極高。, 抗生素生物合成基因成簇存在： 參與每種抗生素生物合成的基因約1030個;阿克拉霉素 每一種抗生素生物合成相關基因在染色體組中前后排列成基因簇(gene cluster)，包括抗生素的生物合成基因、耐藥基因、轉運基因和調節基因，而耐藥、轉運與調節基因三者大多與抗生素生物合成基因緊密連鎖并存在一種協同調節機制。 抗性基因還參與了抗生素的生物合成與調控，以確保抗生素耐藥性的及時表達，從而免受自身抗生素的傷害。研究還發現，產抗菌株的抗性水平與該菌株自身的抗菌素產量水平呈正相關。,阿克拉霉素Aclacinomycin,目前用于治療急性白血病(Leukemia)與淋巴瘤(Lymphomas)有良好療效的阿克拉霉素（Aclacinomycin），它是由Streptomyces galilaeus 合成的聚酮類化合物，其合成酶的生物合成涉及13個基因，緊密成簇排列。返回, 少數抗生素的生物合成基因簇存在于游離狀態的質粒上 如天藍色鏈霉菌 3 (2)菌株中的次甲霉素A（Methylenomycin A）的生物合成基因位于SCP1質粒上。,抗生素生物合成基因群成員的結構特點 鏈霉菌抗生素生物合成基因群成員的DNA組成： GC含量高達70以上、三聯體密碼子中的第三個堿基的GC比例極高； 抗生素生物合成基因成簇存在：參與每種抗生素生物合成的基因約1030個； 少數抗生素的生物合成基因簇存在于游離狀態的質粒上。,7個利用質粒和噬菌體載體來克隆抗生素生物合成基因簇的方法，利用這些策略已經克隆了不同類型抗生素的生物合成基因。這7個方法是： 在標準宿主系統中克隆檢測單基因產物 阻斷變株法 突變克隆法 直接克隆法 克隆抗生素抗性基因法 寡核苷酸探針法 同源基因雜交法,2、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法, 在標準宿主系統中克隆檢測單基因產物 “鳥槍法”克隆基因：能夠檢測到單酶基因的產物。,對氨基苯甲酸合成酶(PABA)基因(pab)是灰色鏈霉菌的殺念珠菌素生物合成酶基因簇的一個成員； 以pab (野生型)灰色鏈霉菌菌株為供體，提取總DNA、BamH切割、與質粒 pIJ41重組、轉化pab (PABA營養缺陷型)菌株，選擇pab (PABA營養原養型)菌株； 過量表達PABA的灰色鏈霉菌具有磺胺抗性，以其為供體、鳥槍法轉化變青鏈霉菌66，在轉化子中篩選PABA原養型或磺胺抗性菌株； 二者篩選出來的陽性轉化子都攜帶一個45 kb的BamH片段，意味著pab基因與磺胺抗性基因可能是同一個基因。,鳥槍法克隆目的基因的基本戰略,隨機克隆供體細胞的全基因組DNA片段，然后通過快速有效的篩選程序從眾多克隆中分離出含有目的基因的目的重組子，進而獲得目的基因。 鳥槍法適用于原核細菌目的基因的克隆分離。,2、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法,阻斷變株法 檢測一系列有關某種抗生素生物合成的阻斷變異株之間的遺傳互補關系，確定被克隆的DNA片段的性質。,放線紫紅素(actinorhodin)是由天藍鏈霉菌合成的多酮肽抗菌素,大約通過16個步驟合成； 對76個阻斷突變體(act -)進行互補測驗研究， Rudd和Hopwood將它們分成7個組，每組代表在不同的生物合成步驟發生損傷。 Act和act 不能與其它突變株互補，說明這兩個突變發生在放線紫紅素生物合成的最早期的步驟中；,2、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法,阻斷變株法 檢測一系列有關某種抗生素生物合成的阻斷變異株之間的遺傳互補關系，確定被克隆的DNA片段的性質。,用pIJ922質粒從act + 菌株中克隆了一個 BamH25 bp片段，可以與除act 外的其它阻斷株互補； 用基因克隆的方法，將act+菌株中相當大的DNA片段(1530 kb)克隆到載體pJJ922上，組建成重組質粒pJJ2303，它能互補所有7組act -突變株，并能使不產生任何一類多酮肽抗菌素的小小鏈霉菌合成放線紫紅素。這個片段顯然是放線紫紅素生物合成全部基因組成的基因簇。,放線紫紅素阻斷突變株之間的互補測驗,前體,中間產物2,中間產物14,中間產物15,中間產物1,放線紫紅素,act,act,act ,act ,act,act,無中間產物 2,act ,act ,act ,act ,act ,act ,無15,無紫紅素,2、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法, 突變克隆法 如果生物合成基因簇DNA的酶切片段通過同源重組插入誘發基因簇相關合成步驟的阻斷突變，這個酶切片段一定含有這個合成步驟的相關基因。,小小鏈霉菌(S. parvullus) 菌株ATCC12434的質粒SCP1 (含次甲霉素A生物合成基因簇)的DNA的Pst 片段插入到 C31KC400 (attP )中，形成質粒SCP1的gDNA文庫； 轉染變青鏈霉菌66( S. lividans )，把噬菌斑影印到變青鏈霉菌(SCP1+)的菌膜上，用C31KC400的紫霉素抗性選擇溶源菌； 從溶源菌中選擇次甲霉素生物合成阻斷突變株，分析表明這些阻斷突變株都含有來自C31KC400的PstDNA片段; 突變分析結果：SCP1上至少有17 kb DNA參與次甲霉素生物合成，其中兩個轉錄單位分別至少有兩個次甲霉素生物合成基因簇成員；,【突變克隆法原理圖解】,片段克隆到噬菌體或整合性質粒中，以同源性重組方式插入相應的基因中。,無阻斷?,阻斷,2、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法, 直接克隆法 抗生素生物合成基因成簇存在，總長度30 kb，成套克隆基因簇是可能的。,頭霉素C (Cephamycin C )是牲畜鏈霉菌表達的-內酰胺類抗生素； Panlabs公司將牲畜鏈霉菌總DNA的2040 kb的Bgl 部分消化片段克隆到質粒 pIJ943中，轉化變青鏈霉菌1326； 以不產黑色素、有硫鏈絲菌素(Thiostrepton)抗性(ts r 為pIJ943的選擇標記)確定轉化子；, 直接克隆法 抗生素生物合成基因成簇存在，總長度30 kb，成套克隆基因簇是可能的。,在固體培養基上用Comamonas terrigena (土生叢毛單胞菌)直接篩選抗菌活性(頭霉素C表達)； 從30,000多個轉化子中得到一個有抗菌活性的轉化子PF15-1，多項分析表明：抗菌活性來自頭霉素C； 把PF15-1中的29.3 kb片段插入質粒pIF900，轉化變青鏈霉菌1326，轉化子同樣產生了頭霉素C：29.3 kb含有頭霉素C生物合成基因簇。,2、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法, 抗生素抗性基因克隆法 抗性基因常常是抗生素生物合成基因簇的成員，可以做為一個標記基因用于克隆基因簇。,抗生素抗性基因可能是抗生素合成基因簇的一部分。在吸水鏈霉菌 (SHydroscopicus)中，與雙丙氨磷(bialaphos)合成基因緊密連鎖的抗性基因bar 所編碼的產物與bialaphos生物合成途徑第10步所需的乙酸基轉移酶相同，bar 可能是bialaphos生物合成途徑的一部分。 在非抗生素產生菌中，抗生素耐藥基因的表達主要是為了應對環境的抗生素壓力，可以存在于質粒上。,2、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法, 抗生素抗性基因克隆法 抗性基因常常是抗生素生物合成基因簇的成員，可以做為一個標記基因用于克隆基因簇。,紅霉素是紅色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)產生的抗生素； 用Mbo處理紅色糖多孢菌NRRLC2338菌株DNA，與穿梭往復粘粒pKC462a重組，轉導E. coli SF8； 以含有ery r的質粒pIJ43為探針，與轉導子原位雜交； 分析表明：陽性轉導子的pKC462a中攜帶35 kb的插入片段； 用這個片段轉化變青鏈霉菌，轉化子產紅霉素。,2、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法, 寡核苷酸探針法 鏈霉菌編碼抗生素生物合成基因ORF順序的密碼子的第3位堿基多達90為G或C，是探針設計的根據。,泰樂星(tylosin)是由弗氏鏈霉菌(Streptomyces fradiae)產生的一種大環內酯類抗生素，臨床上主要作為治療雞慢性呼吸道感染和雞霍亂等常見病，對由病毒引起的豬氣喘和豬肺炎有特效。,Eli Lilly公司首先根據催化泰樂星生物合成的最后一個步驟的 大環菌素-O-甲基轉移酶 (Macrocin-0-methyltransferase)氨基端35個氨基酸順序，按照密碼子偏愛原則合成了44 bp的寡核苷酸探針； 用Charon4構建弗氏鏈霉菌的gDNA文庫，與探針逐一雜交，10個重疊克隆共涉及27 kb DNA； 與用粘粒pKC462a構建的弗氏鏈霉菌的gDNA文庫雜交，有4個重疊克隆共包含58 kb片段，其中包括前面的27 kb片段； 進一步分析表明，58 kb DNA中編碼Tylosin生物合成全部基因。,2、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法, 寡核苷酸探針法 鏈霉菌編碼抗生素生物合成基因ORF順序的密碼子的第3位堿基多達90為G或C，是探針設計的根據。,2、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法, 同源基因雜交法 以已克隆的抗生素生物合成基因片段順序為探針，探察同源性基因。,-內酰胺類：分子結構中含有-內酰胺，包括青霉素類和頭孢菌素類。 氨基糖甙類：由氨基己糖的衍生物組成，包括鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、新霉素、小諾霉素等。 四環類：都具有四個縮合苯環，包括四環素、土霉素、金霉素及強力霉素等。 氯霉素類：含二氯乙酰胺，包括氯霉素、甲砜霉素等。 大環內脂類：由一個或多個單糖組成并與碳鏈一起形成一個巨大的芳香內酯環化合物，有紅霉素、麥迪霉素等。,化學結構類似的抗生素，其生物合成途徑和每個合成環節的酶也相似，編碼酶的基因之間存在同源性； 用放線紫紅素的act和act 做探針，與24種產氨基糖苷類抗生素的鏈霉菌DNA雜交，可產生特異性雜交帶； 用act為探針，成功地克隆了榴菌素(granaticin)和殺螨菌素(milbemycin)的生物合成基因簇； 利用紅霉素的eryA1基因克隆了苦霉素(picromycin)生物合成相關基因； 利用碳霉素(carbomycin)的car E 基因克隆了麥迪霉素的4-羥基苯酰基轉移酶基因；,2、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法, 同源基因雜交法 以已克隆的抗生素生物合成基因片段順序為探針，探察同源性基因。,抗生素生物合成是由初級代謝產物經過一系列酶催化產生的次級代謝產物，其形成是一個復雜的，多因素的調節過程，抗生素的生物合成基因簇構成了對抗生素產生的最低水平的調節和控制。 放線紫紅素 紅霉素 青霉素 鏈霉素,（二） 幾種典型的抗生素生物合成基因簇的結構,（三） 提高抗生素的產量,1、將產生菌基因隨機克隆到原菌株直接篩選高產菌株,所有參與生物合成過程的基因都是克隆的候選者； 主要的候選基因是限速基因和生物合成調節基因； 這些基因向原菌株的克隆是隨機的； 克隆后的篩選是這項措施的關鍵；,（三） 提高抗生素的產量,2、增加參與生物合成中的限速階段基因的拷貝數,反饋抑制(feedback inhibition)是生物合成限速反應的實質，一般是終產物對合成反應某個環節發揮作用的酶活力的抑制，這個環節就是“限速瓶頸”，被抑制的酶就是“限速酶”。 增加酶基因的拷貝數以提高限速酶的的濃度是增產的基本措施； 天藍鏈霉菌十一烷基靈紅菌素的生物合成最后一步的0-甲基轉移酶、泰樂星生物合成的最后一步的0-甲基轉移酶，增加這個酶基因的拷貝數可以提高終產物的產量。 異青霉素合成酶(Isopenicillin N Synthetase, IPNS)的基因與酰基轉移酶基因緊密連鎖，可能是青霉菌(Penicillium sp.)青霉素生物合成的限速酶； 青霉素N做為頭孢菌素C的中間產物，它的積累使頭孢菌素C產量下降。說明擴環酶基因cefEF屬于限速酶 ；,（三） 提高抗生素的產量,3、發揮調節基因的作用,抗生素生物合成基因簇中存在調節基因，以精細調節整個基因簇成員的表達強度； 增加正調控基因拷貝數可以增加抗生素的產量； 降低負調控基因的活性也可以提高抗生素的產量； 天藍色鏈霉菌(S. colicolor)的放線紫紅素(actinorhodin)生物合成基因簇成員act 的四個ORFs都是調控基因，對act 、act 和其它基因起正調控作用；增加act 的劑量可以使放線紫紅素產量提高20-40%。,act (編碼聚酮合成酶 ketosynthase, KS和鏈長決定子 chain length determining, CLF) ；act (編碼酮基還原酶 ketoreductase, KR),（三） 提高抗生素的產量,4、增加抗性基因的拷貝數,有些抗性基因本身就是抗生素生物合成基因簇成員，甚至做為一個合成環節參與抗生素的生物合成； 抗性基因先于生物合成基因表達，即在建立抗性后，抗生素生物合成基因才能表達、合成抗生素； 抗性基因表達的強度和體現的抗性水平與抗生素合成水平呈現平行關系：如果提高抗性水平就可以提高抗生素合成水平； 氨基糖苷類抗生素抗性基因aacA(編碼6-N-氨基糖苷乙酰轉移酶)，增加這個的拷貝數可以提高新霉素和卡那霉素的生物合成量；,1、將產生菌基因隨機克隆到原菌株直接篩選高產菌株 2、增加參與生物合成種限速階段基因的拷貝數 3、發揮調節基因的作用 4、增加抗性基因的拷貝數,提高抗生素的產量的主要措施,（四）改善抗生素組分,許多抗生素產生菌可以產生多組分抗生素，由于這些組分的化學結構和性質非常相似，而其生物活性卻相差很大，這給有效組分的發酵、提取和精制帶來很大不便。 應用基因工程方法可以定向地改造抗生素產生菌，獲得只產生有效組分的菌種。 用阿維菌素B2a生產伊維菌素，產同時產生8個組分，4個主要組分A1a、A2a、B1a、B2a和4個次要組分A1b、A2b、B1b、B2b。A與B組分的區別在于C-5的羥化基因上是否連有甲基，這是由5-O-甲基轉移酶基因（aveD）決定。 選育只產生阿維菌素B2a組分的菌種是非常有意義的。為此，至少要引入3個突變。,（五）改進抗生素生產工藝,傳統方法往往只能改變最適操作條件、降低細胞生物速率或密度來提高供氧水平。 利用重組DNA技術克隆血紅蛋白基因到抗生素產生菌中，在細胞中表達血紅蛋白，可望從提高細胞自身代高功能入手解決溶氧供求矛盾，提高氧的利用率，具有良好的應用前景。 將絲狀細胞透明顫菌的血紅蛋白基因克隆到放線菌中，可促進有氧代謝、菌體生長和抗生素的合成。 這一血紅蛋白含有兩個亞基和146個氨基酸殘基，相對分子質量為1.56105。,生物合成途徑中某個酶基因的突變 在生物合成途徑中引入一個酶基因 利用底物特異性不強的酶催化形成新產物,（六）產生雜合抗生素,有針對性地對某些基因進行操作，如替換、阻斷、重組等均有可能改變其生物合成途徑而產生新的代謝旁路，形成新的化合物。 組合生物合成的基本過程是將不同來源的基因組合，在異源宿主細胞中進行基因表達，將宿主細胞產生的化合物分離提純，對化合物的結構進行解析，推測生物合成規律。 組合生物合成的特點,（七）組合生物合成,二、基因工程在氨基酸和維生素生產中的應用 在氨基酸生產中的應用,以 E. coli 為主的基因工程技術的應用：充分利用氨基酸合成操縱子的調控成分，如弱化子(attenuator)缺失、阻遏物基因突變、解除反饋抑制(限