病毒感染與輸血安全 北京佑安醫院 閔福援,2,肝炎病毒感染率（中國）,1,乙型肝炎危害的現狀,流 行 病 學 調 查： 1. 約70 % 肝硬化患者 HBsAg (+) ，82 % 有過乙肝感染史，僅有10-19 % 的病人與酒精性肝炎有關。 2. 80 % 肝癌與 HBV 有關（經病理檢查），慢性乙肝患者肝病是陰性人群的 40 倍。 3. 肝癌稱為 “癌中之王”，從患肝炎開始到肝癌發生中位時間約為 10 年左右。如經治療，生存率其：,2,中國丁型肝炎感染狀況,乙肝病毒合并丁肝病毒感染，80 % 患者轉成慢性肝炎,3,丙型肝炎危害的現狀,1-5%,死亡率,20-30%,丙肝肝硬化率,70%,丙肝慢性化率,4000萬人,中國丙肝抗體陽性患者,1. 丙肝流行率 3.2% 。 2. 丙肝有 6 個基因型，有 70 幾個亞型（中國 1b、2a 為主）。 3. HBV 和 HCV 重疊感染，發展成肝硬化和失代償期肝病，發生肝癌的 危險性明顯增加。,4,艾滋病自發現至今在全球肆虐，截止2003年底，估計已造成 6900萬人感染，其中2700萬人死亡。艾滋病在 1985年傳入我國， 截止 2003 年底，專家估計我國現存活的HIV感染者約 84 萬， 其中 AIDS病人8萬。疫情已覆蓋全國所有省、自治區、直轄市， 流行范圍廣，面臨艾滋病發病和死亡高峰期，我國的艾滋病已由吸毒、暗娼等高危人群開始向一般人群擴散。,艾滋病（AIDS）流行狀況,艾滋病診療指南2009.6,5,6,血清標志物與乙型肝炎病毒感染,7,包括 HBV 基因分型及 ccc DNA 檢測，耐藥變異位點測定,9,8,乙型肝炎病毒血清學檢測的臨床意義,10,（一）乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg） 解 析,9,11,10,0 3 6 9 12,水,平,Pres1,抗原,HBsAg,ALT,HBs,抗體,Pre S1,(,IgG,),HBeAg,HBc,(,IgM,),HBc,(,IgG,),HBe,抗體,月,HBV-DNA,急性乙肝患者血清病毒學標志物轉換曲線,免疫耐受期 免疫清除期 免疫控制期 免疫活動期,ALT,HBV DNA,HBeAg,Anti-HBe,慢性乙型肝炎的臨床過程,11,13,急性HBV 感染：轉變為慢性的風險與 原發感染時的年齡相關,12,14,急 性 肝 炎 患 者,13,EASL 指南 CHB 治療的目標,治療目標：是阻止疾病進展到肝硬化、失代償肝硬化、 終末期肝病、HCC 和死亡，改善生活和生存質量 治療終點：.理想的終點: sAg 消失 .滿意的終點: eAg 轉換 .次要的終點: eAg 未轉者與 eAg 者 用 NUCs 維持 DNA 測不出 或用 IFN 后 DNA 測不出 EASL Clinical PracticeGuidelines:Management of Chronic Hepatitis B 2009;,14,對于 HBeAg 陽性和 HBeAg 陰性的患者,理想的治療終點是實現 HBsAg 的消失( 伴隨或者不伴隨 Anti-HBs 的出現 ),背景：為什么需要 HBsAg 定量檢測?,EASL Clinical Practice Guidelines: Management of chronic hepatitis B, Journal of Hepatology 50 (2009),HBV DNA = 病毒學標志,HBsAg = 免疫學應答標志,15,HBsAg 定量檢測是：可做為肝臟cccDNA間接指標,16,HBsAg 定量：提示持久的治療應答,Piratvisuth T., Lau GKK., Marcellin P., Brunetto MR. (2010). 20th conference of the APASL, Beijing, China,17,19,18,派羅欣治療 24 周 HBsAg 定量的指導價值,32%,52%,16%,停藥1年后的 HBeAg轉換,24周HBsAg (IU/mL),20,000,1,500,1,500-20,000,19% (8/43),Lau et al. APASL 2009 Poster 083,在24周時 HBsAg 1500 IU/mL 的病人 ，51% 獲得治療后1年的 HBeAg 血清轉換，其中 20% 獲得 HBsAg 清除。,所有患者,19,21,20,22,SVRs (N=12),NRs (N=18),Relapsers (N=18),0.5,1,1.5,2,2.5,3,3.5,4,Treatment,FUP,BL,W12,W24,W48,W72,W96,0,Log HBsAg IU/ml,在治療之中 HBsAg 的降低可以鑒別復發和應答者,Moucari R et al. Hepatology 2009,21,HBV 感染的不同時期的 HBsAg 水平,IT: 免疫耐受,IC: 免疫控制,300,000,250,000,200,000,150,000,100,000,50,000,0,IU/ml,IT,IC,LR,ENH,Jaroszewicz, Cornberg et al., J Hepatol 2009; in press,22,HBsAg 定量的臨床應用價值,Pegasys Nucleosid Analoges Inactive chronic hepatitis B carriers (not under treatment),支持的程度,發表指南 同行評議 KOL 支持 有價值的數據,可用,部分可用,尚不可用,HBsAg 定量可以用于 Pegasys 治療的治療監控和判斷預后. HBsAg 定量 也許可以用于核苷類藥物的治療監控和判斷預后 . HBsAg 定量也許可以用于未經治療的非活動性慢性乙肝患者的監控.,23,結論： HBsAg 定量作為臨床監測指標的重要性專家共識,HBsAg 的消失以及最終的血清轉換是 CHB 患者可能達到的最佳 治療效果。 HBsAg 的顯著降低預示病人預后良好。 HBsAg 而不是HBV DNA是 Pegasys 治療預后的良好的指示指標 通過 HBsAg 定量檢測可以預測哪些患者最可能發生免疫應答， 并指導治療方案的制定,24,26,（二） 乙型肝炎病毒分子生物學診斷,25,HBV DNA 定量檢測 敏感度已達 5-10 c/ml 1個IU 相當于 5.4 基因組 拷貝數,HBV 基因 分型,HBV 耐藥 突變 檢測,病毒 前C區 和BCP 檢測,乙型肝炎分子生物學診斷技術,26,HBV DNA 定量測定 是目前評價 HBV 復制情況的金標準。 血清定量 HBV DNA水平與傳染性的強弱、疾病定性 和疾病發展、治療方案和療效判定密切相關。 3. 慢性肝炎抗病毒治療的 HBV 耐藥突變分子生物學 檢測。,27,基因型耐藥檢測常用方法,（1）基因型特異性引物 PCR 法； （2）限制性片段長度多態性分析法（RFLP）； （3）線性探針反向雜交法（INNO LIPA）； （4）基因序列測定法等。,28,乙型肝炎病毒基因分型,29,31,聚合酶基因突變 核苷類似藥物治療耐受 主要為拉米夫定產生耐藥性 以YMDD 基序的變異最重要,包膜基因的變異 前S 序列異質性最高 “a”抗原決定族 疫苗/HBIg治療,前C區和核心區基因的變異 造成 HBeAg 的表達的減少或終止 HBeAg 陰性但慢性HBV感染 HBe 低濃度，2 x replication ,X 基因變異 影響病毒的轉錄和復制,30,32,前C/ A83 位點突變是HBV 最常見變異,HBV 前C nt 83 的G A（A83）點突變，使 AA28 由色氨酸 （TGG）變異為終止密碼子（TAG）。 Pre C 區的基因突變是與 HBV 的感染 與 免疫以及 重癥乙型 肝炎密切相關的一類突變。 抗 HBe(+) 慢性乙型肝炎，大多數是前 C/A83 位點發生突變， 突變株不能分泌 HBeAg，但 HBV DNA 仍為(+)，患者演變成 肝硬化機率較高。應用干擾素治療后有較高復發率。 一些慢性 HBV 感染者常是 野生 和 變異毒株 的混合感染。 前 C/A83 變異者 有選擇優勢。可逃逸宿主的 免疫清除而使 感染持續。,31,33,HBsAg S-Gene 突變,疫苗逃逸突變株 T126S T131N M133L K141E D144E G145R 2. 診斷逃逸突變株 P120T/ A/Q D144A T131K G145R 3. 抗病毒耐藥突變株 L195M W196S M198L,195,196,198,32,34,乙肝病毒（HBV）感染時相及相關指標,* 由于基本核心啟動子區（BCP）或前C區變異引起的HBeAg低水平或無表達,33,（三）HBsAg 病原學特點及血液篩查的互補配對,表面抗原的病原學特點主要有 六 種人群,34,實驗室血液篩查 HBsAg 互補配對,1. HBsAg 篩查對象,非活動性 HBsAg 攜帶者,慢 性 HBV 攜帶者,部 分 變異株,HBsAg（+） 不合格血,HBsAg （-） HBV MP-NAT檢測,根據抗 HBsAg 病原學特點,35,2. HBV MP-NAT 篩查對象,急性肝炎 HBsAg 窗口期,隱匿性 慢性 乙型肝炎,HBV 變異株,單一 抗HBc,HBV MP-NAT(-) 合格血,HBV MP-NAT(+)再進行 HBV ID-NAT 血檢測， （+）為不合格血,36,HBsAg / HBV NAT 互補配對重點提示： 根據 HBV 病原學特點，HBsAg 與 HBV DNA的不一致性， 兩者不僅不能互相替代，其各自試劑的質量要求也是應該 很高的。 HBsAg 含量低或變異株等原因，HBV-DNA 含量也很低，造成 血液篩查雙漏檢是存在的，所以第一線 HBsAg 檢測至關重要， 選擇靈敏度檢測變異能力，精密度，以及穩定性優于 ELISA 方法的電化學發光法（Elecsys）測定，更能達到 HBsAg/HBV DNA 配對組的互為補充加強的目的。使篩查風險降得更低。,37,（四）抗 HCV 病原學特點及血液篩查的互補配對,A.,（1）HCV 感染的潛伏期平均 50 天左右血清 ALT 升高， 約 1/3 無任何癥狀。,（2）HCV 感染后 1-2 周內血液即可檢出 HCV-RNA；潛伏期后出現 臨床癥狀時僅 50-70% ，血清抗 HCV 陽性，3 個月后 約 90% 抗 HCV 陽性。,B. HCV感染后的病毒血癥可表現 3 種形式,注：后者在全部患者中占 3/4，提示病情持續進展，或已發展到慢性階段。,抗 HCV 的病原學特點,38,急性丙型肝炎患者血清病毒學 標志物的轉換曲線,慢性丙型肝炎患者血清病毒學 標志物的轉換曲線,39,抗 HCV 血液篩查互補配對,根據抗 HCV 病原學特點,彌補檢測一過性病毒血癥 （HCV-RNA 轉陰后）中 的抗HCV（+）者的血液,抗HCV（+） 不合格血,抗HCV （-） HCV MP-NAT 檢測,窗口期外抗 HCV（+）人群 包括臨床癥狀出現時和 3個 月后抗 HCV（+）者血液,彌補檢測間歇性病毒血癥 （HCV-RNA間歇性陽性） 的抗HCV（+）者的血液,1. 抗 HCV 血液篩查,40,2.HCV MP-NAT 篩查對象,窗口期 檢測,HCV 感染后，血液中 檢測不到抗 HCV （或者假陰性）， 但HCV RNA（+）,持續性 病毒血癥 HCV RNA 的檢測,間歇性 病毒血癥 HCV RNA 的檢測,HCV MP-NAT (+) 再進行 HCV ID-NAT血檢測， （+）為不合格血,HCV MP-NAT (-) 合格血,一過性 病毒血癥 HCV RNA 的檢測,41,抗 HCV / HCV NAT 互補配對重點提示,根據 HCV 病原學特點，抗 HCV 和 HCV RNA 之間的不一致性，要求 第一線抗 HCV 和第二線的 HCV RNA 不僅不能互相替代，其各自檢測 試劑的質量要求也是應該很高的。 抗 HCV 的 COI 值高低與 HCV RNA 陽性率相關性高。 HCV RNA 有漏檢 和假陽性問題。 抗HCV不同廠家試劑 COI (+)值不能完全客觀反映抗 HCV陽性狀況以及 出現假陽性結果這與試劑本身的C33CNS3、 C22(p)CORE、 C100NS4、 NS5等區域的檢出率有關，同時試劑的基因表達產物蛋白活性，純度 需要進一步提高。,42,（五）艾滋病分期,43,抗HIV病原學特點及血液篩查互補配對,窗口期。 高度變異是抗 HIV 檢測的難點。 少數晚期患者抗 HIV 亦可陰性。,HIV 自身的特點：,44,實驗室血液篩查抗 HIV 互補配對,根據抗 HIV 病原學特點,1. 抗 HIV 和 HIV1P24 抗原篩查對象,對抗原血癥和抗 HIV 合成受損的患者提高 識別率,抗 HIV 和 HIV 抗原 （+） 為不合格血,抗HIV 和HIV抗原 HIV MP-NAT檢測,兩者聯合檢測使窗口期 較單一抗 HIV 測定 縮短5-7天,測抗原使用重組RT抗原， 因其高度保守，可提高 檢出變異株的能力,（-）,45,2. HIV MP-NAT 篩查對象,少數抗 HIV （-） 的感染者,HIV MP-NAT （-） 合格血,檢測 HIV 血癥和 窗口期篩查,提高檢測 HIV 變異株的能力,HIV MP-NAT (+) 再進行 HIV ID-NAT 血檢測， （+）為不合格血,46,抗 HIV + HIV1P24 抗原 / HIV NAT 互補配對重點提示,根據HIV 病原學特點，抗體的窗口期是血液篩查的最 重要的問題，HIV RNA 和 HIV1P24 抗原測定是優勢項目。 HIV RNA 和應用重組 RT 抗原檢測抗 HCV 是加強檢測 變異株能力的優勢項目。,47,49,48,50,49,（六）診斷試劑檢測數據對比 （部分）,51,Elecsys HBsAg(電化學發光測定）與 ELISA 敏感度（窗口期）比較,與ELISA試劑窗口期相差平均40天。,50,52,國內外 HBsAg 診斷試劑靈敏度評估,國家參考品 adr 血清的檢測結果,51,53,ECL與ELISA相比較的 分析靈敏度,52,54,ECL與 ELISA 相比較的精密度,53,55,54,56,抗-HCV國家參考血清盤評估,55,56,檢測臨床樣本的特異性，未經選擇的門診病人、透析病人、孕婦，特異性 99.6%,檢測 HIV 抗原具有良好的特異性,57,58,60,1/2,59,61,2/2,Elecsys HBsAg s/co 0.9 為陽性。A和C HBsAg s/co 1.0為陽性。B HBsAg 0.05 IU/ml 為陽性,60,62,2019/4/12,62,對于突變株無法識別也是漏檢的原因之一,61,63,可靠性：高臨床靈敏度并且能可靠檢測 HBV 變異株,表3：HBsAg 檢測的臨床靈敏度。陽性樣本已采用中和試驗進行確認,62,64,不同方法對于變異的檢測能力,63,65,Elecsys（R）與酶標試劑的主要區別,64,66,謝,謝,在 HBV 血清學檢測策略中，增加抗-HBc 檢測項目的必要性,1、HBV血清學篩查策略： HBsAg 陰性的隱匿性 HBV 感染者的血清病毒一般保持低水平 的復制，HBV DNA 含量低于 104 IU/ml5，甚至低至 110 IU/ml 16。隱匿性肝炎一般分為抗 HBc（）和抗 HBc（）兩種類型， 在 NAT 和 HBsAg 基礎上加上抗 HBc 互補檢測是控制輸血后肝炎的 又一個較好選擇。,68,乙肝病毒（HBV）感染時相及相關指標,* 由于基本核心啟動子區（BCP）或前C區變異引起的HBeAg低水平或無表達,2、國內HBV病原特征： 我國屬于 HBV 感染高度流行地區，一般人群的乙型肝炎表面抗原（HBsAg）陽性率為 9.09%1 。2006 年，衛生部再次開展了全國人群乙型肝炎等有關疾病血清病原學調查，結果全國 159 歲人群中 HBsAg 攜帶率為 7.18%，據此推算，我國 HBsAg 攜帶者約 9300萬人。城市與農村人群攜帶率差異不顯著；西部地區人群攜帶率高于東部地區；1559 歲人群攜帶率最高，達8.57%2。由以上數據可以看出，在法定獻血人群（1855 歲）中，仍存在較高的 HBV 感染率。 我國每年仍有少數新發輸血后肝炎病例的報道，原因主要有以下4方面：于病毒感染 窗口期獻血、病毒變異、不典型的血清轉換（如隱匿性感染）及實驗室錯誤操作等。我國 每年報道的乙肝新發病例約為50萬3，其中由輸血傳播所致的比例尚待研究。 現有的血清標志物檢測技術難以對OBI（Occult HBV infection，隱匿性 HBV 感染） 或單一抗 HBc（）人群進行準確診斷，一般 OBI個體血清中 HBV DNA 水平低，對 NAT 提出了較高要求，給進一步提高輸血安全帶來了新的挑戰。國際輸血協會正在進行采用 NAT 或抗-HBc 檢測 OBI 的國際研究。這對于 HBV 感染率58.6% 的中國尤其重要。,3、 其他國家 HBV 血清學篩查策略： （1）日本模式：日本紅十字會（Japanese Red Cross，JRC）血液中心從 1989 年開始，已 經將 HBsAg、乙型肝炎核心抗原抗體（抗-HBc）以及乙型肝炎表面原抗體（抗-HBs）的檢測納入到血篩中。日本紅十字會在一項歷時4 年的研究中4，對15721份樣本進行了HBV ID （Individual donation）-NAT，確認了158 份 HBVID-NAT-only-陽性樣本，占ID-NAT 檢測樣品的1. 01%，其中 95 份為低滴度的 抗-HBc 陽性。這一結果顯示，在日本血篩系統下，重復獻血者 60%的ID-NAT-only-陽性樣本來自于隱匿性攜帶者。這些隱匿性攜帶者的病毒載量很低，78份樣本中有75 份低于100 個拷貝ml。這樣的濃度用混合樣本-NAT 系統是不能檢測出來的，需要發展和完善用于篩查的 ID-NAT 系統。研究顯示：低水平抗-HBc 造成輸血后肝炎比抗-HBc（）窗口期血液要低。但對高感染率的中國，抗-HB c的檢測要比歐美等國更需要。 （2）美國模式：1986 1987 年間，在血源篩查 HBV 感染中，開始引入抗-HBc的檢測作為補充。這十幾年來，美國一直采用 HBsAg 和抗-HBc 化學發光法聯合檢測作為血源篩查 HBV 感染陽性的標準，輸血傳播 HBV 的殘余風險在 1:488 000 1:205 0006。 （）世界胃腸組織臨床指南建議：乙型肝炎血液篩查 HBsAg 、抗和HBV DNA 三項,建議討論、論證： 歐美乙型肝炎低流行區，因“窗口期”OBI引發輸血后乙型肝炎是主要原因； 中國是乙型肝炎高流行區（感染率 58.6%、HBsAg攜帶率約 8%），抗-HBc（+） OBI和單一抗-HBc（+）人群數量多，是引發輸血后乙肝的主要原因之一。采用 NAT 可提高 OBI 的檢出率，但是