吉林大學遠程教育本 科 生 畢 業 論 文 （ 設 計 ）中文題目 安絡小皮傘液體深層發酵條件優化的研究學 生 姓 路 園 園 專 業 藥 學 層 次 年 級 _1409 學 號 201409960544 指 導 教 師 張 新 茹 職 稱 講 師 _學 習 中 心 高 邑 奧 鵬 學 習 中 心 成 績 2016 年 9 月 18 日摘要安絡小皮傘菌是我國傳統的藥用真菌，不僅在藥用方面有很好的功效，在食用和保健方面有很高的價值，因此，對小皮傘菌液體深層發酵研究具有重要的意義和價值。 本實驗通過單因素實驗和正交試驗對小皮傘菌發酵條件進行優化。主要研究內容及結果如下：以提高安絡小皮傘菌生物量為目的，對小皮傘菌培養基及其發酵條件進行系統的優化。對 C 源和 N 源種類進行篩選，在此基礎上對其濃度進行優化，通過正交試驗對小皮傘菌培養基成分進行優化，最終確立了最優培養基為玉米粉：3 %、麩皮： 3 %、Mg SO4：0.1 %、KH 2PO4：0.3 %、VB 1：10 mg、水：1000 m L；通過對小皮傘菌液體發酵時間、溫度、轉速及其培養基的初始 p H、接種量、裝液量進行篩選，確立了最適發酵條件為:發酵時間：6 d、溫度：25 、轉速：150 r/min、初始 p H：5、接種量：9 %、裝液量：90 m L。 關鍵詞：安絡小皮傘菌，發酵條件，培養基，培養條件目錄摘要 .I ABSTRACT . III1 前言 . 11.1 安絡小皮傘的概述介紹 . 11.1.1 安絡小皮傘簡介 . 11.1.2 安絡小皮傘的形態特征 . 21.1.3 安絡小皮傘的生態習性5 . 31.1.4 安絡小皮的主要成分 . 41.2 安絡小皮傘液體深層發酵技術 . 41.3 安絡小皮傘的藥用價值 . 51.3.1 抗氧化作用 . 51.3.2 增強免疫的作用 . 51.3.3 抗腫瘤作用 . 51.3.4 鎮痛作用 . 61.4 立題的依據及意義 . 71.5 本研究的主要內容 . 81.5.1 安絡小皮傘發酵條件的優化 . 82 安絡小皮傘液體發酵條件的優化 . 92.1 材料和試劑 . 92.1.1 實驗菌種 . 92.1.2 實驗試劑 . 92.1.3 儀器設備 . 92.1.4 培養基 . 102.2 實驗方法 . 102.2.1 菌種復壯 . 102.2.2 菌種培養 . 102.2.3 生物量的檢測 . 102.2.4 培養基的優化 . 112.2.5 培養條件的優化 . 122.3 結果與分析 . 132.3.1 培養基優化單因素實驗結果 . 132.3.2 培養基優化正交試驗結果 . 142.3.3 發酵條件的優化結果 . 162.4 討論 . 203 結論與展望. 393.1 結論 . 39 3.2 展望. 40參考文獻. 43致謝 . 471 前言1.1 安絡小皮傘的概述介紹1.1.1 安絡小皮傘簡介安絡小皮傘學名為 Marasmius androsaceus 是一種生長于密林中的真菌，因為其有黑色，密生的針狀菌索，所以又稱其為鬼毛針，茶褐小皮傘等，屬于擔子菌綱、傘菌目(Agaricales)、白蘑科(Thicho Lomataceae)、小皮傘屬(Marasmius)1，如圖 1-1。安絡小皮傘始載于新華本草綱要 ，性溫，微苦，歸肝經。具有消炎、止痛的功能。主要分布于我國吉林、遼寧、湖南、湖北、廣東等省 2。我國民間早有用野生安絡小皮傘的根狀菌索來治療骨折疼痛、跌打損傷等。現在臨床和市場上用小皮傘菌制成的藥物有很多，主要的有“安絡痛” （其制劑分為膠囊和注射液兩種） 、 “安絡痛酊” 、 “安絡解痛片”等 3-4。小皮傘菌含有水溶性多糖等成分，具有一定的抗氧化作用，其內含有的皮傘堿具有鎮痛鎮靜作用，此外，安絡小皮傘中含有多種氨基酸，具有很高的營養價值和保健價值，經研究其主要表現在能促進神經組織和纖維結締組織的炎癥消失，改善局部的血流循環和組織營養狀況，恢復神經功能 5。隨著安絡小皮傘菌液體發酵技術的應用和對安絡小皮傘菌營養價值和藥理作用的研究，安絡小皮傘菌的大量生產和深入探究安絡小皮傘菌所具有的更多藥理特性，使其在藥品制劑、功能食品、保健品等方面得到廣泛的開發與應用，具有良好的市場和經濟價值。圖 1-1 野生安絡小皮傘菌1.1.2 安絡小皮傘的形態特征 安絡小皮傘子實體小群生或散生，長在基物上或根狀菌索上。其菌蓋呈半球狀，直徑約為 0.5cm2cm，菌蓋的上面有溝條，其中間部位呈臍狀。安絡小皮傘的膜質中間厚邊緣薄，堅韌而光滑，但是比較干燥，它的顏色為紅褐色或茶褐色，從中間到兩邊顏色逐漸變淺。菌褶比較稀疏，有長有短，顏色為白色，直生至離生。菌柄中生 3-5cm，長在基物上的柄長，長在菌索上的柄短，粗 1 毫米或稍粗，細針狀，黑褐色或稍淺，平滑，彎曲，中空軟骨質。菌索特別發達，脆骨質，呈黑褐色至黑色，頂部色淺為淡黃色，光滑無毛，直徑0.5mm1mm，如果環境和溫度比較適合，菌索可達 150cm 以上，形狀非常像細鐵絲或馬鬃毛，有的分支有的不分枝。孢子無色無臭味，呈長方橢圓形，光滑，6m9m3m4.5 m 6。（1）菌絲安絡小皮傘的菌絲為白色，呈絲狀，顯微鏡下觀察為無色，有內含物，有橫隔，有分枝，寬 2.5-3m，斜面培養比深層培養的菌絲可以觀察到更多鎖狀聯合。在斜面培養和平板培養時，菌絲容易出現老化現象，菌苔從白色變成棕褐色，最后變成黑色。（2）菌球搖瓶液體發酵培養時，接種后，菌絲萌發伸長和分枝，然后縱橫交錯，相互纏繞而形成菌球。剛開始形成的菌球，菌絲交織疏松， “毛刺”比較長，隨著培養時間的增加，菌絲和菌球纏繞的越來越緊密， “毛刺”變短，形成球形或者近球形，直徑大多在 3-5mm，也有小至 1mm 大至 14mm 的，菌球的大小受接種量、培養基成分和搖床轉速影響很大，接種量大菌球大且少，液體培養基中沉淀或粉狀物質太多，菌球的數量會多小，搖床轉速越快，菌球多而且小，若轉速太快則形成不定型的菌絲體，不能形成菌球。菌球有空心和實心兩種，表明具有短絨毛或放射狀的“毛刺” 7。1.1.3 安絡小皮傘的生態習性小皮傘菌生長于深山密林，陰涼潮濕，近水，酸性土上面的枯枝、腐木、落葉、竹林枯木或竹枝上，產生根狀菌索的時間為每年的 5 月10 月（林下溫度約為 1528） ，產生子實體以 6 月8 月較多，溫度以 2226為佳。子實體和跟狀菌索的形成和生長發育皆需要很高的濕度，特別是空氣濕度需要飽和或接近飽和，往往是在下雨時或剛下雨后形成，并在此條件下繼續生長發育。空氣濕度太低，子實體和根狀菌索不能形成，已形成的也會停止生長，當空氣濕度飽和時，又會恢復生長或菌索會產生分枝。如果長期處在低濕度空氣條件下，小皮傘菌生長受阻，容易污染霉菌。空氣條件差的情況下，子實體和菌索也易被雜菌污染。在完全黑暗的地方，菌絲體可以生長，但不能形成子實體和菌索。當菌索和子實體形成以后，長期黑暗，其生長也會受到抑制，斷續的光照，生長不受影響。子實體形成適宜的光照強度為 10-20 萬 lx 即可以滿足。 小皮傘菌是一種腐生菌，但其根狀菌索在生長過程中如果遇到合適的活體植物，便會在植物上長出白色的菌絲，生長一段時間后會變成褐色，菌索會攀援植物的莖、枝或葉向上生長。若纏繞活植物的菌索較多，會引起植物的病變或死亡。 小皮傘菌生長時如果某種原因致使其根狀菌索斷裂，它可以在斷裂處從新長出白色菌絲一段時間后，菌絲由白色變成褐色，長出新的菌索，繼續生長。菌索與菌索相遇可以彼此相連長出菌絲。采收期 6-10 月為宜，由于皮傘菌易吸濕發霉，所以樣品采集后烘干保存備用。 1.1.4 安絡小皮的主要成分安絡小皮傘中含有多種成分 8，有多糖、氨基酸、腺苷、甘露醇、膽甾醇醋酸酯、伴半萜內酯、有機酸、異香豆素、三十碳酸、2,3,5,6-四氯-1,4- 二甲氧基苯、B 谷甾醇棕櫚酸酯、 5,8-過氧麥角甾醇、B 谷甾醇、麥角甾醇、總生物堿等。有鎮痛作用的成分為三十碳酸、2,3,5,6- 四氯-1,4- 二甲氧基苯、伴半萜內酯和麥角甾醇。 1.2 安絡小皮傘液體深層發酵技術液體深層發酵技術屬于現代生物技術之一，該項技術的權威是美國弗吉尼亞大學生物工程專家 Elmer L、Gaden Jr，其在 20 世紀 40 年代設計出生物反應器用來培養微生物系統。液體發酵技術是指在生化反應器中，模擬菌株在自然界中的生活環境，將其生長所必需的糖類、氮元素化合物、無機鹽和微量元素等營養物質溶解在水中配制成菌株培養所需的培養基，滅菌后進行接種，控制適宜的溫度、轉速、通氧等外界條件對菌進行大量培養繁殖的過程。第一次應用該項技術的是美國的 H. Humfeld，對蘑菇進行液體發酵并得到蘑菇菌絲體。 J. Szuecs 首次將發酵罐用于液體發酵技術，1958 年培養出羊肚菌。國內對液體深層發酵較早的報道是 1960 年上海植物生理研究所陳美聿等人對香菇的液體發酵培養。林忠平等人在 1973 年對靈芝進行深層發酵的研究。80 年代后，隨著此項技術的發展，國內外對液體深層發酵技術紛紛展開了研究與探討 9。安絡小皮傘是我國傳統的藥用真菌，其液體深層發酵技術發展的比較早，已有成型的培養方案，但是應用于大規模生產的研究比較少。最早成功大規模生產安絡小皮傘菌的研究是廣州微生物所與廣州第一制藥廠聯合研制安絡痛。發酵培養基的配方為：葡萄糖 3 %，玉米漿 0.5 %，酵母膏 0.2 %，Mg SO4 0.05 %，KH 2PO4 0.1 %，消沫油 0.1 %，p H 6.5。培養條件為：接種量 1.5 %-2 %，溫度 24-26 。通氣培養時間 4-5 d，通氣量每分鐘 1：1-1 ：1.5(v/v)；罐壓0.3-0.5 kg/cm2。制作安絡痛，此條件下培養得到的安絡小皮傘可滿足需求。李雪梅在安絡小皮傘菌液體發酵過程中還原糖與菌絲體干重、p H 值及產量的關系的研究中得到了在發酵過程中，隨著總糖的消耗，還原糖的含量逐漸降低，且與 p H 值的變化呈正相關，與菌絲體干重及產量的增加呈負相關，為安絡小皮傘發酵的生產提供了重要的理論依據 10。1.3 安絡小皮傘的藥用價值1.3.1 抗氧化作用王曦 11等人用醇沉法對安絡小皮傘菌絲體粗多糖進行分級沉淀，其分級產物對OH 和O 2-都有很強的清除作用。分級產物對羥基自由基的清除能力隨著乙醇加入倍數的增大而增強，當加入 4 倍體積乙醇時，對其清除率可達到 49.72 %此時產物濃度為 0.4 mg/m L，說明安絡小皮傘多糖對OH 有很強的清除作用。不同乙醇體積的分級產物對O 2-清除能力不同，當乙醇等量與溶液體積時，得到產物對O 2-的清除率最大可達 42.22 %。梁啟