·大會交流·ZnPP對種植性乳腺癌血管生成影響試驗研究謝建楊淵劉勝春400016重慶,重慶醫科大學隸屬第一醫院普外科【摘要】目探討鋅原卟啉（ZnPP）對種植性乳腺癌VEGF和血管生成影響。方法應用種植性乳腺癌模型,經過ZnPP和鈷原卟啉（CoPP）處理,檢測乳腺癌組織中血紅素氧合酶1(HO-1)酶活性,免疫組化、Westernblot蛋白印跡雜交檢測癌組織中HO-1、VEGF蛋白表示,RT-PCR檢測VEGFmRNA,CD34染色腫瘤微血管內皮細胞并對其進行定量分析。結果ZnPP組腫瘤直徑（7±1.06mm,n=7,）顯著小于其它各組(t=3.5334,P<0.001);CoPP組（13±2.82mm,n=13,）大于空白對照組（10±1.63mm,n=8）(t=3.6564,P<0.002)。CoPP組VEGFmRNA(0.3046±0.0102)顯著高于空白對照(0.1524±0.0046)及ZnPP組(0.1216±0.0043)（t=8.8491,P<0.001）。ZnPP處理組HO-1及VEGF蛋白印跡雜交結果低于CoPP組和空白對照組（t=4.698,P<0.005）（t=5.5428,P<0.005）。ZnPP處理組MEA為224.81±79.4266顯著低于CoPP組448.79±138.46(t=5.3426,P<0.05)。結論ZnPP可能經過抑制HO-1蛋白表示來降低VEGF表示,降低腫瘤血管生成,并可能由此降低了腫瘤細胞增殖生長。【關鍵詞】血紅素氧合酶-1;乳腺腫瘤;血管內皮細胞生長因子;血管生成ExperimentstudyofEffectofZincProtoporphyrinonangiogenesisinplantedbreastcarcinomaXIEJian,YANGYuan,LIUSheng-chun.DepartmentofGeneralSurgery,TheFirstAffiliatedHospital,ChongqingUniversityofMedicalScience,Chongqing400016,China【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheeffectofZincProtoporphyrin(ZnPP)onVEGFandangiogenesisinplantedbreastcarcinoma.MethodsTheplantedbreastcarcinomawastreatedwithZnPPandCobaltProtoporphyrin(CoPP),theHaemoxygenase-1(HO-1)proteinandenzymeactivityincarcinomatissuewereassessedbywesternblotandsoon.AtthesametimeVEGFwereexaminedbyRT-PCR,westernblotandmicrovesselendothelialcellwerestainedbyimmunohistochemsterywithCD34.MicrovesselEndothelialArea(MEA)wereestated.ResultsThediameteroftumorinZnPPgroupwassignificantlysmallerthanthatinothergroups(t=3.5334,P<0.001)andthatinCoPPgroupwasbiggest(t=3.6564,P<0.002)。TheVEGFmRNAintumorofZnPPgroup(0.1216±0.0043)werelowerthanthoseinothergroups,andwhichinCoPPgroupwerehighest(0.3046±0.0102)（t=8.8491,P<0.001）.TheMEAinZnPPgroup(224.81±79.4266)werelowerthanthoseinCoPPgroup(448.79±138.46）(t=5.3426,p<0.05).ConclusionsZnPPislikelytoinhibitHO-1proteinexpressiontodecreaseexpressionofVEGFmRNAandVEGFprotein,consequentlydecreasetheangiogenesisintheplantedbreastcarcinoma.【Keywords】Haemoxygenase-1;Breastcarcinoma;VEGF;Angiogenesis血紅素氧合酶-1(haemoxygenase-1,HO-1),又稱熱休克蛋白32(heatshockprotein32,HSP32)是降解血紅素為膽綠素、CO和Fe2+起始酶和限速酶。多年研究發覺HO-1對應激反應細胞保護起關鍵作用,本組試驗擬經過ZnPP抑制HO-1在種植性乳腺癌細胞中表示探討ZnPP對種植性乳腺癌血管生成影響。材料和方法1驗對象:SHZ-88鼠源性乳腺癌細胞（由本院普外科試驗室提供）培養在含10%新鮮胎牛血清RMPI1640培養液中,分別加入50u/ml青霉素及50mg/ml鏈霉素,預先37℃、5%CO2和100%相對濕度環境中培養,2試劑:ZnPP=9\*ROMANIXZinc(Zn)protoporphyrin(PP)美國Sigma-Aldrich企業產品。配制:將ZnPP溶于0.1MNaOH,pH7.4,終濃度為1mg/ml。CoPP=9\*ROMANIXCobaltprotoporohyrin(CoPP)美國Sigma企業產品,由ProfessorSongWeihong(TheUniversityofBritishColumbia)惠贈。配制方法同ZnPP。3細胞培養及處理:SHZ-88鼠源性乳腺癌細胞培養細胞進入對數生長久。后更換分別含有2uMCoPP和ZnPP細胞培養液繼續培養48小時,對細胞進行HO-1原位免疫組化檢測。4試驗動物分組:產后7天SD乳鼠18只,前胸壁常規消毒后皮下注射SHZ-88細胞懸液0.2ml/只（106/ml）。隨母鼠喂養并自由攝水攝食。兩周后隨即分為三組:A組,空白對照組:不給予任何處理原因。B組,ZnPP組:按1.5mg/Kg/D體重經腹腔注射ZnPP。C組,CoPP組:按5mg/Kg/D體重經腹腔注射CoPP。一周后處死幼鼠并立刻切取腫瘤組織,將其一分為二,分別置-80℃5HE及免疫組化檢測:常規HE染色,免疫組化所用兔抗鼠HO-1、VEGF、CD34均購自武漢博士德企業采取SABC法染色,試驗中設置陽性及陰性對照。血管計數CD34染色以血管內皮細胞染為棕黃色為陽性,采取真彩色圖像分析儀(MD20型、德國LEICA)進行CIAS定量分析:在25.6×10倍鏡下選擇3著色密度最高區域對染色面積進行定量測定(除外血管腔≥8個紅細胞或管壁可見平滑肌者),并求出微血管內皮細胞面積MEA.6RT-PCR檢測VEGFmRNA表示經典總RNA提取試劑盒（上海生工,SK1351）提取總RNA,按試劑盒操作說明合成第一條鏈。紫外分光光度計測定RNA濃度,瓊脂糖電泳證實RNA完整性。VEGF引物序列為:正義引物5'-TCGCIQCCTCCGAAACCATGA-3',反義引物5'-CCTGGTGAGAGATCTGGTTC-3',產物cDNA262bp;β-actin正義引物5-GTAAAGACCACTTTGCCAACA-3’反義引物3’-CACCATCATCCTTCAGGGAG-5’,產物長度214bp。PCR反應條件:預變性94℃2min,95℃變性1min,55℃退火40s,72℃延伸1min,共35個循環,最終72℃延伸5min。產物在質量濃度為1%6HO-1酶活性測定:取100mg腫瘤組織按1:4加入0.1molKH2PO4,冰上勻漿,4℃下12,000×g離心20min后在將上清液在4℃下12,000×g離心60min。20μl上清,50mmHemin,2mmG-6-P,G-6-P脫氫酶,0.25μl0.8mMNADPH,1.8ml0.1mlKH2PO4,標準肝組織勻漿上清液20μl,37℃避光反應60min后冰上終止反應。以不含NADPH樣品作空白對照,464nm、530nm7HO-1、VEGF蛋白印跡雜交:4℃下在勻漿器中用0.5ml蛋白提取液提取0.1g腫瘤組織總蛋白,紫外分光光度計測定并調整總蛋白濃度為0.5mg/ml,10%SDS電泳（電泳電壓9V/cm,進入分離膠后增加為15V/cm）,電泳4小時后電轉到硝酸纖維膜上（電流0.65mA/cm,時間15小時）。5%脫脂奶粉PBST封閉1小時,加兔抗鼠HO-1、VEGF多克隆抗體（1:200）過夜,羊抗兔二抗HRP（1:1000,SantaCruz,北京中山生物試劑企業分裝）1小時,利用ECL試劑盒（SC-2048,SantaCruz）化學發光法顯色,膠片暴光3’-5’8統計學處理:試驗結果中計量資料采取均數±標準差(D)表示,利用SPSS軟件進行分析,組間比較采取t檢驗,以p<0.05為差異有顯著性。結果1HO-1在體外細胞中表示:HO-1蛋白關鍵表示在腫瘤細胞胞漿及胞膜（見圖1）,其表示強度能夠看出經過CoPP誘導出了HO-1在腫瘤細胞內表示。2動物模型及腫瘤巨體檢驗:全部幼鼠都有腫瘤形成,共生成腫瘤28個,ZnPP組腫瘤直徑（7±1.06mm,n=7,）顯著低于其它各組(t=3.5334,P<0.001);CoPP組（13±2.82mm,n=13,）大于空白對照組（10±1.63mm,n=8）(t=3.6564,P<0.002)。3HE和免疫組化檢測結果:HE染色檢驗經病理檢驗證實全部標本均為乳腺癌組織。HO-1蛋白關鍵表示在腫瘤細胞胞漿及胞膜（見圖2a）。VEGF在腫瘤細胞漿及細胞核中都有表示(圖2b),CD34關鍵散在表示在腫瘤間質內血管內皮細胞胞獎內(圖2c)。CD34圖象分析結果顯示:空白對照組MEA為293.90±137.24（140.62~518.69）,與ZnPP處理組MEA為224.81±79.4266（65.5388~323.73）沒有顯著差異（p>0.05）,而CoPP組顯著高于前兩組448.79±138.46（164.66~698.16）(p<0.05)4VEGFmRNART-PCR檢測結果:各試驗組腫瘤組織都有VEGFmRNA表示見圖3。CoPP組VEGFmRNA與β-actinRT-PCR結果OD比值(0.3046±0.0102)顯著高于空白對照(0.1524±0.0046)及ZnPP組(0.1216±0.0043)（t=8.8491,P<0.001）。５HO-1、VEGF蛋白印跡雜交結果:HO-1蛋白印跡雜交結果見ZnPP處理組細胞HO-1表示最弱,光密度比值顯著低于CoPP組和空白對照組（t=4.698,P<0.005）。一樣VEGF與HO-1結果相同（t=5.5428,P<0.005）。表1各組腫瘤組織HO-1,VEGF蛋白印跡雜交(積分光密度)結果()分組樣本HO-1VEGF空白對照635.48±8.1425.58±3.54ZnPP組620.98±6.6019.67±6.69CoPP組655.64±10.1039.32±7.436HO-1酶活性測定:HO-1酶活性測定結果空白對照組1.435±0.2326nmol膽紅素/mg蛋白質/1h,低于CoPP組1.765±0.2828nmol膽紅素/mg蛋白質/1h（t=3.7937,P<0.002）,但高于ZnPP組1.105±0.1114nmol膽紅素/mg蛋白質/1h（t=3.816P<0.005）。討論Yanagawa等[1]報道單原因分析HO-1低表示與頭頸部腫瘤未分化程度和淋巴結轉移顯著相關（P=0.04,P=0.01）。Caballero等[2]用免疫組化檢測DAB誘導肝臟癌前病變及腫瘤組織,發覺HO-1在癌前病變及早期腫瘤表示較少,在肝細胞性肝癌中HO-1表示與腫瘤分化程度成反相關,認為降低HO-1與腫瘤癌變過程相關。Fang等[3]用聚乙烯-乙二酯-糖結合ZnPP[poly(ethyleneglycol)-conjugatedZnPP,PEG-ZnPP]在體內試驗有阻止HO-1活性及抗腫瘤作用;體外試驗結果發覺PEG-ZnPP誘發了氧化應激并造成SW480人結腸癌細胞凋亡。同時該作者報道ZnPP可提升腫瘤細胞對喜樹堿、阿霉素等化療藥品反應[4].BerberatPO等[5]在胰腺腫瘤細胞試驗中分別評定HO-1對化療、放療影響,發覺用SiRNA技術降低HO-1表示能顯著增加胰腺腫瘤細胞對吉西她賓和放射診療敏感性,認為特異性抑制HO-1表示可能是胰腺腫瘤一個新診療選擇,并可能是化療、放療效果增敏劑。我們曾經報道經過ZnPP降低腫瘤組織內HO-1mRNA、HO-1蛋白及HO-1酶活性,并發覺降低HO-1表示以后腫瘤細胞STAT-3和抗凋亡基因Bcl-XL蛋白表示降低,而增加了凋亡蛋白酶CAS-3表示,并可能由此增加了腫瘤細胞凋亡發生,抑制了腫瘤生長[6]。對于HO-1對腫瘤血管生成影響,現在為止研究報道不多,SunamuraM[7]等發覺盡管增加體外細胞HO-1表示沒有顯示出對細胞增殖發展改變,在胰腺腫瘤裸鼠模型體內研究中發覺,增加HO-1表示使腫瘤細胞增殖加緊,同時腫瘤血管生成顯著增加,并增加了腫瘤轉移事件發生。認為HO-1經過增加血管內皮細胞生存而刺激腫瘤血管生成。本試驗中,我們用CoPP處理SHZ-88鼠源性乳腺癌細胞后,發覺細胞中HO-1表示有增加。說明在體外試驗中能夠增加細胞HO-1表示。我們在該細胞種植形成乳腺癌體內模型中,發覺HO-1mRNA水平,蛋白表示水平以及HO-1酶活性水平都顯示能夠用CoPP和ZnPP增加或抑制HO-1表示水平和酶活性。同我們曾經報道結果一致,ZnPP組腫瘤直徑（7±1.06mm,n=7,）顯著低于其它各組(t=3.5334,P<0.001);CoPP組（13±2.82mm,n=13,）大于空白對照組（10±1.63mm,n=8）(t=3.6564,P<0.002)。為了解HO-1對腫瘤血管生成有沒有影響,我們檢測了腫瘤組織中VEGF表示,同時用CD34標識腫瘤組織內微小血管,并對微血管內皮細胞面積（MEA）其進行半定量分析,結果發覺CoPP組VEGF蛋白表示水平（39.32±7.43）顯著高于其它兩組,而ZnPP組最低（19.67±6.69）。而且在微血管內皮細胞CD34染色,MEA定量檢測得到一樣結論,CoPP組MEA448.79±138.46（164.66~698.16）顯著高于其它兩組,而ZnPP處理組224.81±79.4266（65.5388~323.73）最低(p<0.05)。說明HO-1可能經過增加血管生成因子VEGF表示,促進了腫瘤新生血管形成,從而加緊了腫瘤生長。該結論對深入研究經過抑制HO-1在腫瘤組織內表示以抑制腫瘤內血管生成,從而達成抑制腫瘤生長診療目提供了可能,但其作用機理尚不甚清楚,還有待深入深入研究。參考文件[1]YanagawaT,OmuraK,HaradaH,etal.Hemeoxygenase-1expressionpredictscervicallymphnodemetastasisoftonguesquamouscellcarcinomas[J].OralOncol,,40:21-27.[2]CaballeroF,MeissR,GimenezA,etal.Immunohistochemicalanalysisofhemeoxygenase-1inpreneoplasticandneoplasticlesionsduringchemicalhepatocarcinogenesis[J].IntJExpPathol,,85:213-222.[3]FangJ,SawaT,AkaikeT,etal.Invivoantitumoractivityofpegylatedzincprotoporphyrin:targetedinhibitionofhemeoxygenaseinsolidtumor[J].CancerRes,,63:3567-3574.

[4]FangJ,SawaT,AkaikeT,etal.Enhancementofchemotherapeuticresponseoftumorcellsbyahemeoxygenaseinhibitor,pegylatedzincprotoporphyrin[J].IntJCancer,,109:1-8.[5]Berberat