發育生物學研究技術1/48慣用發育生物學研究技術介紹顯微鏡技術(成像imaging);組織切片技術(經典解剖形態學morphology);生化分子生物學;原位雜交技術(insituhybridization);顯微注射;匯報基因技術;細胞標識技術;2/48顯微鏡技術目標：觀察胚胎個體分類：

光學(optical)顯微鏡:體視顯微鏡:組織分離用

熒光顯微鏡：3/48顯微鏡技術激光共聚焦顯微鏡(laserconfocal)：熒光標識，對胚胎或細胞中特定蛋白質或mRNA分布進行定性或定量研究；圖像采集效果很好；細胞或組織三維重塑(reconstructing)4/48組織切片技術目標：觀察胚胎內部組織學結構分類：石蠟組織切片：石蠟包埋，切片機切片冷凍切片：低溫包埋劑包埋，低溫切片機切片，對樣品中核酸保留很好，但切片質量差。5/48分子生物學技術目標：檢測目標基因或蛋白質在某一發育時期或特定組織中表示分類：Polymerasechainreaction(PCR):DNAamplificationReal-timequantitativePCR:RNA定量RT-PCR/Northernblotting:mRNA

expressionWesternblotting:protein

expression

免疫共沉淀

(Co-IP):protein-proteininteraction6/48NorthernBlottingAnalysis7/48SouthernBlottingAnalysis8/48Real-timePCR儀9/48原位雜交技術目標：檢測某一特定基因mRNA在某胚胎和組織中分布情況分類：放射性標識探針：放射自顯影非放射性標識探針：地高辛(DIG)-免疫組化

熒光素-熒光免疫組化(FISH)10/48原位探測基因表示

GeneexpressingguidingdevelopmentWhenandwhereparticulargenesareactiveIntactembryosorsectionsofembryosInsituhybrid:probes-radioactiveisotope,fluorescencetagoranenzymeDectection:autoradiography,fluorescencemicroscope,enzyme-substratereaction11/48原位探測基因表示12/48原位探測基因表示DistributionofmRNAforthegrowthfactorVg-1intheamphibianegg.Insituhybridizationwitharadioactiveprobe.(yellowsignals)13/48原位探測基因表示14/48利用原位雜交技術研究基因表示時空譜mRNA檢測15/48FISH探測基因表示16/48報道基因(reportergene)技術目標：用于開啟子/增強子分析研究。采取一些產物易于檢測基因(報道基因)與待研究表示調控序列串聯，經過轉基因技術導入胚胎體內，分析報道基因產物表示來研究目標片斷轉錄調整活性。慣用報道基因分類：

綠色熒光蛋白(GFP):分布用熒光顯微鏡觀察

lacZ基因:編碼β-半乳糖苷酶,用特異底物顯色研究其產物分布

熒光素酶(luciferase):慣用體外基因表示活性分析，近年開始體內研究17/48開啟子活性檢測法表示載體構建：18/48利用大分子間相互作用克隆新基因判定可與蛋白質結合DNA序列分離靶蛋白質，（可采取gel-shiftassay)克隆靶蛋白表示基因。利用DNA與蛋白質間相互作用19/48分離時空特異性表示基因方法利用蛋白質之間相互作用酵母雙雜交法20/48顯微注射及細胞標識技術目標：將外源DNA、RNA或標識物等導入早期胚胎細胞中，如利用細胞標識技術對胚胎早期卵裂球分化命運圖譜研究。在小鼠和果蠅中慣用于轉基因分析。細胞標識物分類：早期：活體染料如尼羅藍或中性紅，不能標識胚胎內部組織現在：細胞外-親脂性熒光染料如DiI/Dio，不適于組織切片細胞內-熒光標識葡聚糖和HRP，需顯微注射，經過熒光顯微鏡或組織化學方法進行定位。

示蹤基因：GFP和LacZ基因21/48染料細胞標識22/48熒光細胞標識23/48細胞移植24/48DNA/蛋白芯片目標：高通量篩選不一樣胚胎細胞或組織中基因/蛋白表示圖譜，取得不一樣時期或組織差異表示基因或蛋白。DNAchipProteinchip

microRNAchip分類：25/4826/48應用DNAmicroarrays研究基因表示Highoutputscreeninggenesexpresseddifferentlyindifferenttissuesoratdifferentstagesindevelopment27/48基因組時代：人類基因組計劃控制發育基因判定及其表示和功效檢測方法28/48后基因組時代＝功效基因組時代空間結構？胞內分布及靶位？影響器官？基因類型？底物？影響路徑？29/48發育遺傳學技術

發育生物學基本任務之一：研究基因在胚胎發育中作用正向遺傳學技術：大規模隨機誘變，產生發育異常突變個體，然后再尋找突變基因。

1.大規模誘變篩選;2.插入誘變篩選;

3.突變基因克隆;從自然或人工突變體中分離判定控制發育基因30/48從自然或人工突變體中分離判定控制發育基因自然群體中突變體；化學誘變劑處理，如亞硝基－乙脲－乙亞硝基脲(N-nitroso-N-ethylureaethylnitrosourea,ENU)；外源DNA插入法，如DNA注射、病毒感染、轉座子利用等；X－射線或r－射線照射取得突變體方法31/48自發突變

(spontaneousmutation)Recessivemutation(純合體狀態)/Dominant(雜合體狀態)

/semi-dominant32/48自發突變

(spontaneousemutation)semi-dominantmutation(半顯性突變)33/48斑馬魚上ENU化學突變研究成就(1996)從自然或人工突變體中分離判定控制發育基因化學誘變法34/48大規模誘變篩選經過射線或化學誘變劑處理父本個體，在其生殖系細胞中產生隨機突變，然后與wild-type母本個體雜交，F1個體中可能攜帶有基因突變。F1與野生型，F2(50%雜合突變體)群體內雜交，F3(25%)可出現純合突變個體，發育異常35/48DNA插入誘變法36/48反轉錄病毒插入引發突變判定DNA插入誘變法37/48大規模誘變篩選突變后表型改變：

致死性

功效喪失：最常見。突變后蛋白質比野生型活性差；某一蛋白質完全失活突變為無效突變(nullmutation)

功效取得：如一些受體突變后活化38/48插入誘變篩選利用轉座子(transposon)或病毒載體做誘變劑。果蠅中為P-因子，能夠隨即插入基因組中，并能夠在基因組中移動，包含特殊序列和轉座酶，后代生殖細胞中，轉座酶就會誘導P-因子在基因中隨即轉座造成基因突變。39/48突變基因克隆突變體取得后，克隆引發該突變基因

插入突變：利用P-因子序列作為探針，從突變體文庫中篩選出含P-因子克隆，從而確定其插入點及被阻斷基因。

化學誘變或射線突變：定位克隆(positionalcloning)—依據目標基因在染色體上位置進行基因分離。經過分析突變位點與已知分子標識連鎖關系來確定突變基因染色體位置。慣用分子標識包含單核苷酸多態性(SNPs)。40/48Positionalcloning:1)確定突變基因染色體定位2)獲取該片斷基因組序列：數據庫3)生物信息學確定該片段可能含有基因，結合其可能功效和該突變體表型，確定候選基因4)試驗驗證：功效異常，野生型rescue,RNAi41/48發育遺傳學技術反向遺傳學技術：經過功效喪失(lossoffunction)或功效取得(gainoffunction)試驗，研究胚胎個體所產生表型而分析目標基因功效。

基因修飾

1.基因敲除;2.條件基因敲除;

3.轉基因;42/48Constructingknockoutmice取得攜帶有特定基因突變個體技術，研究基因在發育中功效主要方法。1)構建用于基因重組突變基因結構2)重組基因導入胚胎干細胞(ES)3)注射ES入胚胎中以取得雜合性小鼠4)小鼠雜交取得純合體小鼠并進行表型分析。43/48Conditionalknockout僅使靶基因在特定組織或發育時期失活。Cre-lox

系統

1)Cre編碼一個重組酶，可識別并結合位點并切除位于兩個LoxP位點之間序列。2)兩個品系：靶基因兩側都加入LoxP位點;轉入由組織特異性開啟子控制cre基因3)小鼠雜交，cre基因會在特異性組織中表示，切除靶基因，使之失活。44/48Transgenictechnique1)將外源基因注射到受精卵細胞核中，缺點是無法控制外源基因插入情況，只能經過后代檢驗DNA。2)將外源基因轉化到ES中，同geneknockout3)小鼠雜交。45/48發育遺傳學技術反向遺傳學技術：

經過抑制性因子抑制目標基因功效