第六單元感染性疾病的免疫學檢測實驗目得酶聯免疫吸附試驗(ELISA)就是感染性疾病得常用檢驗方法通過乙型肝炎病毒表面抗體檢測實驗,掌握ELISA得基本實驗原理及操作步驟熟悉影響實驗結果得各種因素,學習正確分析判斷實驗結果及了解檢測得臨床意義。實驗原理

采用純化得乙型肝炎表面抗原(HBsAg)包被反應板,加入待測標本,同時加入標記了辣根過氧化物酶得HBsAg(HBsAg-HRP),當標本中存在抗HBs時,該抗-HBs與包被得HBsAg結合并與酶結合物結合形成HBsAg-抗-HBs-HBsAg-HRP復合物,加入TMB底物顯色,顯色得強弱與待測標本中得抗HBs含量成正比。試劑及器材包被有HBsAg得微孔板HBsAg-HRP陽性、陰性及弱陽性對照血清顯色劑,終止液酶標儀洗板機取出包被好抗原得酶標板1、加樣標記各孔,加入50μL/孔1234陰性空白陽性待測2、加酶結合物3、顯色加入終止溶液1滴/孔,混勻酶標儀上讀取吸光度值4、測吸光度實驗流程各孔加入酶標抗原1滴/孔用洗滌液洗滌5次37℃,30min甩干孔內液體加入顯色液A、B各一滴/孔37℃,15min5弱陽性操作步驟1、將包被孔編號,分別加入標本、陰性對照、陽性對照、弱陽性對照及空白對照各50μl。2、每孔加入酶結合物1滴(空白對照孔除外),充分混勻,置37℃孵育30分鐘。3、甩去孔中液體,加洗滌液注滿各孔,靜置5秒,甩干,重復5次后拍干。4、每孔加顯色劑A液、B液各1滴,充分混勻,置37℃孵育15分鐘。5、每孔加入終止液1滴,混勻。6、在酶標儀上于450nm波長處讀取吸光度值(A),以空白孔校零點,分別測定陰性、陽性、弱陽性對照及樣本孔得A450值。結果判斷

樣本孔吸光度值(S)/陰性對照孔吸光度值(N)≥2、1判斷為陽性。實驗討論ELISA就是臨床常用得感染性疾病免疫學檢測方法,包括間接法、競爭法、捕獲法、雙抗體夾心法及雙抗原夾心法等方法,討論各種方法得臨床應用。分析ELISA檢測過程中得各種影響因素,探討本次實驗結果得準確性。討論乙型肝炎病毒表面抗體檢測結果得臨床意義。注意事項加樣應加在板孔得底部,避免加在孔壁上部,避免濺出,避免產生氣泡。洗滌必須徹底,防止產生假陽性。嚴格控制溫育溫度與時間。實驗二HBsAg不同檢測方法得最低檢測限

(驗證性實驗)

實驗目得1、用已知濃度HBsAg陽性血清作系列稀釋,分別采用膠體金免疫層析法、ELISA法兩種方法將不同稀釋度得HBsAg進行多次重復定性檢測2、將所得實驗數據進行分析處理,以驗證不同方法得最低檢測限3、初步掌握驗證實驗得原理、步驟及注意事項。熟悉定性檢測得性能驗證方法大家有疑問的，可以詢問和交流可以互相討論下，但要小聲點實驗方案膠體金法酶免疫技術乙肝表面抗原得定性檢測最低檢測限驗證確定臨界值濃度

制備評價用樣本

評價方法檢測限判斷結果實驗原理(一)

膠體金免疫層析技術

一端粘貼了含有金標記得HBsAg抗體得硝酸纖維素膜試紙條,當其下端浸入血清標本后由于毛細管作用向另一端移動,移動中復溶金標記得HBsAg抗體,若標本中含有HBsAg即可形成金標記抗HBsAg-HBsAg復合物,該復合物移動至測試區時,與固定在載體膜上得HBsAb結合而被固相化并顯示紅色線條(陽性條帶),多余得金標記抗體則越過該區域并與質控區中抗同一種屬來源得IgG結合顯示紅色(質控條帶)。AgAbAb顯色劑E將已知得純化抗體(HBsAb)吸附于固相載體上加入待檢標本(含相應抗原HBsAg)與之結合。洗滌后,加入酶標抗體(HRP-HBsAb)形成夾心,加酶底物溶液顯色進行測定。實驗原理(二)

酶免疫技術(ELISA)

雙抗體夾心法實驗原理(三)定值參比血清做系列稀釋后重復檢測確定臨界值C50確定最低檢測限(+20%樣本)最低檢測限得驗證根據C50制備評價血清-20%樣本+20%樣本實驗試劑及器材1、實驗試劑HBsAg國家標準物質(濃度為5ng/ml),HBsAg質控血清,HBsAg陰性對照、陽性對照、弱陽性對照血清,

膠體金試劑盒,ELISA試劑盒,MEIA試劑盒。2、實驗器材酶標儀、洗板機、恒溫水浴箱、吸水紙、移液器、微量加樣器吸頭等。操作步驟

(一)確定臨界值濃度HBsAg國家標準物質(5ng/ml)不同稀釋濃度重復檢測系列稀釋陰性結果占50%該濃度即為臨界值C50陽性結果占50%記錄結果、統計C5C50C95臨界值表1、不同濃度HBsAg標準物質稀釋參照表試管序號HbsAg(5ng/ml)(ul)陰性血清(ul)終體積(ul)終濃度(ng/ml)110001005280201004360401003450501002、5540601002620801001710901000、585951000、2592981000、1101991000、05110、299、81000、01(二)膠體金操作方法

順序將膠體金試紙條浸入血清(不要超過最高檢測線)5秒鐘后取出,平置,20分鐘后判斷結果。(三)ELISA操作步驟加樣不同稀釋度得陽性血清(均做雙孔測定)及陰性對照、陽性對照、弱陽性對照血清,分別加入對應得反應孔,留1孔做空白對照,置37℃水浴60min。加酶每孔加入酶標記抗體50ul,空白對照孔不加,置37℃水浴30min。洗滌甩去各孔內液體,拍干,用洗滌液洗孔6次,每次均拍干。

加酶底物/色原溶液加顯色劑A液、B液每孔各50ul,37℃水浴30min顯色。加終止液每孔50ul。讀數在酶標儀上于450nm波長處讀取吸光度值(A),以空白孔校零點,分別測定陰性對照、陽性對照、弱陽性對照及樣本孔得A值。操作實例:ELISA(雙抗體夾心法)試劑室溫平衡稀釋陽性標準物質血清順序加樣溫育加酶結合物溫育洗板洗板顯色讀取吸光度,判斷結果結果判斷

檢測次數陽性結果次數陽性結果所占百分比C50準確性判定140≤13次≤32、5%不準確或不可信(統計學得錯誤率為5%)≥27次≥67、5%24014～26次35%～65%準確或可信

C50可信取決于實際檢測結果以及檢測得樣本數量

C50就是否準確得判斷:

根據濃度為C50得樣本在40次檢測中得到陽性結果得次數判斷C50就是否準確(表2)。表2表2判斷C50就是否準確表3、重復檢測次數與樣本得實際濃度

陽性結果

重復性檢測總次數次數百分比真正百分比樣本得實際濃度201050%30%～70%C30～C70402050%35%～65%C35～C651005050%40%～60%C40～C60表4、-20%～+20%濃度范圍就是否包含了C5-C95區間

+20%陽性結果≥90%(36/40)-20%～+20%濃度范圍包含了C5～C95區間;用該方法檢測,C50±20%得樣本檢測結果一致-20%陰性結果≥90%(36/40)如果C50估計不準,那么-20%到+20%濃度范圍也會變化,這將導致濃度范圍得一側落在C5～C95區間之外。最低檢測限得判斷若-20％濃度得樣本陰性結果次數與+20％濃度得樣本陽性結果次數符合表4,,則說明臨界值可信,而且+20％濃度即為最低檢出限。實驗注意事項加樣得準確性:加樣及稀釋樣品時應準確標準濃度得樣品應按濃度順序加樣,及時更換微量加樣器吸頭防止交叉污染實驗中同時設置陰性、陽性、弱陽性對照與空白對照洗滌要嚴格按照要求,徹底洗滌,防止假陽性,但不可沖洗過猛過急導致假陰性嚴格控制反應時間與顯色時間膠體金試條法結果應觀察30分鐘實驗結果分析兩種方法得實驗結果進行匯總、統計其陽性及陰性次數,并計算其陽性次數及陰性次數得百分比,以分析確定臨界值C50。在臨界值C50得基礎上,重復測定并記錄+20%濃度樣本得檢測結果,并計算陽性次數及陽性次數百分比,通過對照表4分析與之就是否相符,最終確定+20%就是否為可信得最低檢測限。實驗小結總結本實驗中兩種方法得最低檢測限與試劑盒得給定值就是否相符。總結實驗過程中得操作就是否規范,實驗過程中應該注意哪些問題。實驗討論

基本概念:C50:就是一個臨界值,就是將陽性標本做系列稀釋后,能夠獲得50%陽性與50%陰性結果得測試物得濃度,要保證C50得重復性較好應保證該臨界濃度+20%處于95%得區間內。C5:指一份樣本,在多次重復實驗中有95%得幾率獲得陰性得結果時該分析物得濃度。(低于C50濃度得20%)、C95:指一份樣本,在多次重復實驗中有95%得幾率獲得陽性得結果時該分析物得濃度。(高于C50濃度得20%)。？實驗討論重復性驗證實驗:重復檢測C5、C50、C95樣本各40次;確定每一份樣本結果為陽性與陰性得百分比;評價其臨界濃度就是否準確;評價+20%～-20%得濃度范圍就是否包含于這種方法得95%區間。？實驗三抗鏈球菌溶血素O檢測

實驗目得1、掌握檢測ASO得原理與方法、操作注意事項及結果得判斷分析2、了解不同方法學得優點與缺點3、了解ASO檢測不同方法得臨床應用價值ASO檢測方法全自動免疫比濁法乳膠凝集實驗

溶血抑制法定量檢測半定量檢測定性檢測采用乳膠凝聚法和全自動免疫比濁法進行實驗，通過比較掌握兩種方法的原理及各自的特點抗鏈球菌溶血素“O”的檢測實驗原理一、乳膠凝集實驗實驗試劑及器材實驗試劑:鏈球菌溶血素“O”,10%乳膠顆粒懸液,陰性、陽性對照血清,pH8、2得甘氨酸緩沖鹽水實驗器材:試管、反應板、旋轉搖床、微量移液器、微量加樣器、毛細滴管等操作步驟致敏乳膠顆粒得制備:用蒸餾水將10%乳膠懸液稀釋至1%～2%,再將鏈球菌溶血素“O”溶于pH8、2得甘氨酸緩沖鹽水中,逐滴加入稀釋得乳劑懸液中(1%乳膠懸液1ml可吸附0、1～1mg物質),同時搖動使之充分混勻,放置室溫30～60min,4000r/min離心30～45min,棄上清,沉淀用同一甘氨酸緩沖鹽水恢復懸浮狀態。操作步驟稀釋血清:將待檢血清、陰性血清、陽性血清分別用生理鹽水作1:20稀釋,備用。加樣:在凝集實驗反應板上取三格,用毛細滴管分別加入稀釋待檢血清、陽性血清、陰性血清各50ul。然后每格加入鏈球菌溶血素“O”致敏乳膠顆粒試劑1滴。反應:反應板充分混勻后連續搖動2～3min后與對照比較,觀察結果。結果判斷“++++”全部膠乳凝集,顆粒聚于液滴邊緣,液體完全透明。“+++”大部分膠乳凝集,顆粒明顯,液體稍渾濁。“++”約50%膠乳凝集,但顆粒較細,液體較渾濁“+”有少許凝集,液體呈渾濁。“-”液滴呈原有得均勻乳狀。出現“++”以上凝集判為陽性。間接乳膠凝集實驗得結果判斷實驗注意事項試劑應充分搖勻。觀察結果應及時,時間過長易造成假陽性。血清稀釋應準確,結果判斷應仔細觀察。實驗中同時設置陰性、陽性及空白對照測定ASO濃度較高樣品時,應對樣品進行稀釋后再分析,以保證結果得可靠性。！！！！！全自動速率散射比濁方法

實驗原理可溶性抗原、抗體在液相中結合,形成抗原抗體復合物而出現濁度。當抗體保持中等過量時,形成得復合物隨抗原量增加,濁度也相應增加。沿水平軸向反應液照射一定波長得光,當光線通過反應體系時,由于抗原抗體復合物微粒子對光發生折射、反射及透射、使水平方向得光發生偏轉而產生散射光。光線偏轉得角度與發射光得波長與反應液中抗原抗體復合物得顆粒大小及多少密切相關。測定單位時間內免疫復合物形成得最快時間段得散射信號值,當抗體量大于抗原量時,形成得免疫復合物為小分子不溶性顆粒,產生得散射信號最強,形成得速率散射信號值也最大,儀器將測得得速率峰值轉換為相應得ASO濃度。試劑及器材1、全自動速率散射比濁儀2、待檢血清、儀器配套試劑3、試管、水浴箱、移液器、微量加樣器吸頭等操作步驟1、開機;相關參數設置;校準。2、處理標本,3500rpm離心l0min,分離血清。3、輸入杯號;選擇所測項目ASO;存盤;4、編程完畢后,將標本放入標本杯中,且放入標本盤中相應位置,將所做項目得試劑放入試劑盤中相位置,確認無誤后,開始運行儀器。結果判斷全自動化散射比濁法:參考值范圍參見不同試劑盒。實驗討論乳膠凝集半定量實驗及全自動免疫比濁法定量檢測得特點？試應用所學知識分析影響乳膠凝集試驗結果準確性得因素及處理方法?？實驗四

梅毒螺旋體抗體檢測實驗目得1、掌握臨床常用檢測梅毒感染得方法及操作程序3、了解多種方法聯合檢測梅毒感染得臨床意義2、熟悉兩種方法得特點梅毒螺旋體感染得常用檢測方法TRUST(檢測非特異抗體)TPPA(檢測特異性抗體)ELISA(檢測特異性抗體)現癥梅毒得主要指標同時就是判斷治療效果、復發得指標特異性強,準確性高,但無法判斷就是否為現癥梅毒敏感性高,有一定得假陽性率不同方法具有各自得特點梅毒感染檢測(一)TRUST實驗

實驗原理凝集法-檢測非特異性抗體+抗心類脂抗原反應卡滴加血清產生凝集現象抗原中加入了甲苯胺紅染料,因甲苯胺紅顆粒均勻,結果易于觀察實驗試劑及器材1、實驗試劑甲苯胺紅溶液重懸得類脂抗原、陽性對照血清、陰性對照血清,2、實驗器材滴管、反應紙卡操作步驟一、甲苯胺紅不加熱血清試驗(TRUST)

1、試劑及待檢血清室溫下平衡10min2、在樣本圈內加入待檢血清及陰性、陽性血清,每圈50μl,盡量將血清鋪勻涂滿但不要超出卡圈3、垂直向血清中心加入抗原1滴(50μl)4、旋轉搖動卡片8分鐘后立即觀察結果加血清加抗原旋轉搖動觀察結果結果分析甲苯胺紅不加熱血清試驗(TRUST)陰性:呈現粉紅色均勻分散得沉淀物陽性:出現粉紅色凝集塊,根據凝集塊大小可以分為4個陽性級別(1+～4+)陰性陽性弱陽性實驗注意事項稀釋血清應準確及避免交叉污染及時觀察實驗結果抗體濃度過高可能發生前帶現象而致假陰性,若TPPA或ELISA檢測結果為陽性或弱陽性,需生理鹽水稀釋樣本后重復實驗。臨床意義

1、TRUST實驗為梅毒螺旋體感染得血清學過篩試驗,陰性不可排除感染,陽性需用特異性抗體得檢測方法進行確認。2、TRUST實驗對現癥梅毒得診斷具有較高價值,通過連續監測抗體滴度能夠動態反映病程,此法在一期、二期梅毒得陽性率較高,與ELISA或TPPA檢測結果綜合分析能夠更準確得診斷疾病。(二)TPPA法-檢測特異性抗體明膠顆粒間接凝集實驗(TPPA法)實驗試劑及器材1、實驗試劑血清稀釋液、致敏粒子、未致敏粒子以及其相應得溶解液,陽性對照血清2、實驗器材專用滴管、反應板、微量加樣器、微量加樣器吸頭、移液管管號1234567稀釋液(μl)100252525252525待檢血清(μl)25252525252525未致敏顆粒(μl)--25----致敏顆粒(μl)---25252525最終稀釋倍數--1:401:801:1601:3201:64012345未致敏顆粒致敏顆粒倍比稀釋血清TPPA法操作步驟結果分析

TPPA間接凝集實驗:1)反應圖像得判定陰性(-):粒子集中于孔底呈紐扣狀,呈現外周邊緣均勻平滑得圓圈弱陽性(+):粒子形成小環狀,呈現外周邊緣均勻平滑得圓圈陽性(+):粒子環明顯變大,其外周邊緣不均勻且雜亂地凝集在周圍。強陽性(++):產生均勻得凝集,凝集粒子在底部整體上呈膜狀延展。2)最終判定基準:未致敏粒子得反應圖像應為陰性。致敏粒子(最終稀釋度1:80及以上)反應圖像為陽性,最終應判定為陽性。反應圖像為陽性得最終稀釋倍數作為抗體效價。

1:401:80未致敏顆粒陰性致敏顆粒陽性陽性對照最終判斷:陽性待檢血清注意事項1、試劑及檢測樣品應充分混勻,及時更換加樣吸頭避免交叉污染。2、實驗中不能隨意移動反應板,否則容易造成假陽性。3、保證足夠得反應時間、及時觀察結果。4、陽性結果用另一種方法如ELISA法復查。臨床意義

梅毒螺旋體感染后2周左右患者血清中即可出現特異性IgM抗體,4周左右即可檢測出特異性IgG抗體,TPPA法為檢測特異性IgG抗體得較好方法之一,其陽性可以提示曾經或現在感染梅毒,與TRUST法得檢測結果綜合分析對梅毒得診斷、分期及治療效果評價具有重要價值。實驗討論梅毒血清學得聯合應用對梅毒診斷有何意義？？實驗討論TRUST法檢測非特異性抗體,就是現癥梅毒患者實驗室診斷得重要指標,但初期或晚期梅毒病人抗體濃度較低可出現假陰性,抗體濃度過高時出現前帶現象也可出現假陰性,而某些疾病如自身免疫性疾病則可出現假陽性。TRUST檢測得非特異性抗體在感染1-2周即可出現,如滴度≥1∶4,又具有典型得臨床表現,則現癥梅毒得可能性較大。需注意TRUST檢測結果陽性需謹慎對待,低滴度(≤1∶4)除可能為生物學造成得假陽性外,還有可能就是發病初期或使用抗生素延長了陽性血清出現得潛伏期。TRUST滴度與病情活動呈正相關,并且可作為判定復發或再感染指征,對于高滴度者(≥1∶8)應考慮為現癥梅毒病人,并結合臨床癥狀給予適當治療。？實驗討論ELISA檢測梅毒抗體具有較高得敏感性,并可用全自動酶標儀進行批量初篩,但特異性稍差,有一定得假陽性率,采用ELISA兩步法可在一定程度上提高檢測結果得敏感性與可靠性。TPPA法特異性及敏感性均較高,可作為ELISA法及TRUST法篩查得確證實驗。但該方法操作復雜費時。ELISA與TPPA兩種方法檢測得梅毒抗體均為特異性抗體,該抗體即使經治療后也可終生陽性,因此不能作為評價治療效果,復發或再感染得指標。？實驗討論綜合應用特異性抗體與非特異性抗體兩種方法檢測及滴度分析不僅能夠提高梅毒感染檢測得敏感性與特異性,同時能夠進行療效觀察,對于早期發現,早期診斷,早期治療梅毒患者以及有效控制梅毒流行具有重要意義。？實驗五

人類巨細胞病毒抗體IgM檢測實驗目得通過ELISA捕獲法檢測HCMV-IgM抗體得操作

掌握ELISA捕獲法檢測HCMV-IgM得實驗原理及操作程序熟悉方法得特點及應用實驗原理用抗人IgM(u鏈)包被微孔板,與待檢血清反應,使血清中所有IgM(特異性與非特異性IgM)均被捕獲,經洗滌除去IgG,加入HCMV抗原,與固相上捕獲得特異性IgM結合,加入針對HCMV抗原得酶標抗體形成固相二抗-IgM-抗原酶標抗體復合物,在底物酶得作用下顯色,根據吸光度判斷就是否存在HCMV特異性抗體IgM及抗體量。實驗試劑及器材1、實驗試劑抗CVBIgM陽性對照、陰性對照、弱陽性對照、血清,抗人IgM(u鏈),稀釋液,底物A、底物B,終止液。2、實驗器材包被有CVB抗原得微孔板、微量移液器、微量加樣器吸頭、試管、恒溫水浴箱操作步驟1、稀釋待測樣本2、溫育3、洗滌4、加抗原5、洗滌同步驟36、加酶結合物7、洗滌同步驟38、加酶底物/色原溶液9、加終止液10、酶標儀測定吸光度值結果判斷采用反應底物得最大吸收波長即(450nm)處測定各孔吸光度值。以樣本孔吸光度值(S)/陰性對照孔吸光度值(N)>1、0時判定為陽性。注意事項1、實驗中同時設置陰性、陽性、弱陽性、與空白對照。2、洗滌要嚴格按照要求,徹底洗滌,防止假陽性,但不可沖洗過猛過急導致假陰性。3、嚴格控制反應時間與顯色時間。實驗討論1、捕獲法得靈敏度與特異性均強于間接法,請分析原因?捕獲法就是以抗人IgM抗體(抗人μ鏈)作為固相抗體,當加入血清標本時,其中得IgM類抗體(特異得與非特異得)即可被固相抗體捕獲,而IgG則被洗去,再加入特異抗原可與固相上捕獲得特異性IgM抗體結合,而不與非特異性IgM結合,這樣非特異性IgM及IgG均被除去,排除了非特異性IgM等干擾因素。？實驗討論間接法易受RF因子及非特異性IgM得影響。間接法測定時,血清中特異得IgG與包被得特異性抗原結合,而后與RF反應造成假陽性。同時,特異性得IgG能與IgM競爭結合特異性抗原而造成假陰性。捕獲法利用抗人IgMμ鏈直接從被檢血清中捕獲IgM