Chapter10

沉析

Precipitation

本章應掌握的問題1、什么是沉析？2、沉析法純化蛋白質的優點有哪些？3、沉析的一般操作步驟是什么？4、何謂鹽析？其原理是什么？5、鹽析操作時常用的鹽是什么？6、影響鹽析的主要因素有哪些？7、有機溶劑沉析法的原理是什么？8、影響有機溶劑沉析的主要因素有哪些？9、等電點沉析的工作原理是什么？10、其它常用的沉析方法有哪些？沉析法概念（Precipitation）利用沉析劑使需提取的生化物質或雜質在溶液中的溶解度降低而形成無定形固體沉淀的過程。操作步驟1加入沉析劑2沉析物沉化3離心或過濾，收集沉析物沉淀與結晶的區別相同點本質過程都屬于新相析出，以物理變化為主，也有極少的有化學反應的沉淀或結晶。不同點結晶析出的分子或離子具有有規則的排列形式沉淀析出的分子或離子呈無規則的紊亂排列形式沉析器結晶器沉析的特點操作簡單、經濟、濃縮倍數高，但針對復雜體系而言，純度不高、選擇性不強分類鹽析、有機溶劑沉析、等電點沉析等沉淀的本質一個溶質與溶劑之間關系的交變過程，通過加試劑，改變溶劑和溶質的能量平衡來降低其溶解度。沉淀法適用范圍（參考圖15.1）主要用于蛋白質、核酸等沉淀，蛋白質或核酸在溶液中濃度較高或終產物要求的純度不高的情況。通過多步沉淀可達99%的純度。IgG蛋白質的結構蛋白質的結構一級結構二級結構三級結構蛋白質的溶解特性三級結構蛋白質的溶解特性圖16.2蛋白質分子表面的憎水區域和荷電區域表16.1根據疏水性與化學性質對氨基酸的分類表親水和疏水區域的分布和程度決定蛋白質在水相環境中的溶解度1.帶電荷的和極性的氨基酸親水性最強，疏水性最小2.小分子蛋白質比在化學上類似的大分子蛋白溶解性高3.蛋白質通過改變其結構如疏水基團暴露出來改變不溶解性蛋白質的溶解特性表16.2影響蛋白質溶解度的參數蛋白質本身的性質極性/非極性殘基分布溶劑可利用度溶劑化沉淀平衡蛋白質膠體溶液的穩定性蛋白質膠體溶液的穩定性遵循DEVL理論：

蛋白質膠粒間的范德華力（吸引力）和膠粒與液體界面存在的靜電斥力平衡為基礎蛋白質的沉淀方法1，加入中性鹽2，將PH值調到IP3，加入可溶性有機溶劑4，加入非離子型親水性聚合物5，加入聚電解質絮凝6，加入多價金屬離子生物大分子在水溶液中的存狀態：（1）兩性電解質，由于靜電力的作用，分子間相互排斥，形成穩定的分散系----膠體蛋白（2）蛋白質周圍形成水化膜，保護了蛋白質粒子，避免了相互碰撞鹽析原理1.鹽析(Saltinducedprecipitation)

概念：在高濃度的中性鹽存在下，蛋白質（酶）等生物大分子物質在水溶液中的溶解度降低，產生沉淀的過程。鹽析法原理溶液中高濃度的中性鹽離子有很強的水化能力，會奪取蛋白質分子的水化層，使蛋白質膠粒脫水，又會中和蛋白質所帶電荷，使顆粒間的斥力失去，分子布朗運動的相互碰撞。發生凝集而沉淀析出。不同的蛋白質在同一濃度鹽溶液中的溶解度不同，可利用不同濃度的鹽溶液使每個蛋白質成分分別析出，通常稱為蛋白質的鹽析。

鹽析過程中性鹽加入蛋白質分散體系時可能出現的兩種情況（1）“鹽溶”現象—低鹽濃度下，蛋白質溶解度增大。在提取液中加入中性鹽，可以促使生化物質轉入有機相從而提高萃取率（2）“鹽析”現象—高鹽濃度下，蛋白質周圍的水化膜被破壞，分子之間有相斥力減小，與范德華力失去平衡，蛋白質溶解度隨之下降。中性鹽的親水性大，使蛋白質脫去水化膜，疏水區暴露，由于疏水區的相互作用導致沉淀；離子強度對鹽析過程的影響Cohn經驗公式S—蛋白質溶解度，mol/L；I—離子強度c:離子濃度；Z：離子化合價β，Ks—常數離子完全解離的稀溶液中，上公式才能完全解析。β和Ks的物理意義β—鹽濃度為0時，蛋白質溶解度的對數值。與蛋白質種類、溫度、pH值有關，與鹽無關；Ks—鹽析常數，與蛋白質和無機鹽的種類有關，與溫度、pH值無關。Ks鹽析法：在一定pH和溫度下，改變體系離子強度進行鹽析的方法，稱為Ks；β鹽析法：在一定離子強度下，改變pH和溫度進行鹽析,稱為β分級鹽析法；其中，Ks鹽析法由于蛋白質對離子強度的變化非常敏感，易產生共沉淀現象，因此常用于提取液的前處理。

β鹽析法由于溶質溶解度變化緩慢，且變化幅度小，因此分辨率更高，常用于初步的純化。鹽析用鹽的選擇在相同離子強度下，鹽的種類對蛋白質溶解度的影響有一定差異，一般的規律為：半徑小的高價離子的鹽析作用較強，半徑大的低價離子作用較弱 （Ks）磷酸鉀>硫酸鈉>硫酸銨>檸檬酸鈉>硫酸鎂影響鹽析的因素

（1）pH值：影響蛋白質表面凈電荷的數量，通常調整體系pH值，使其在pI附近；（2）鹽析溫度：大多數情況下，高鹽濃度下，溫度升高，其溶解度反而下降；（3）溶質種類的影響：Ks和β值（4）溶質濃度的影響：蛋白質濃度大，鹽的用量小，但共沉作用明顯，分辨率低；（5）蛋白質濃度小，鹽的用量大，分辨率高；常用的鹽析用鹽#硫酸銨：溶解度大（767g/L）硫酸鈉磷酸鹽檸檬酸鹽

選用鹽析用鹽的幾點考慮：

（1）鹽析作用要強 （2）鹽析用鹽需有較大的溶解度 （3）鹽析用鹽必須是惰性的 （4）來源豐富、經濟注意事項溫度：抗體對溫度比較敏感，長時間暴露在室溫可以使抗體失活，因此提取免疫球蛋白最好在2-4℃條件下進行。

等電點：蛋白質在等電點時的溶解度最低，兔IgG的等電點為pI8.0，操作時應該避開使用等電點附近的緩沖溶液。

蛋白質的濃度：蛋白質的濃度過高時，會出現欲分離的蛋白與其它蛋白質一起共沉的現象。因此蛋白質濃度應在2.5-3%為宜。濃度過高時應用PBS稀釋。鹽析用鹽的用量選擇飽和度（Saturation）的概念：以硫酸銨為例：250C時，硫酸銨的飽和溶解度是767g/L定義為100%飽和度2.有機溶劑沉淀概念在含有溶質的水溶液中加入一定量親水的有機溶劑，降低溶質的溶解度，使其沉淀析出（丙酮、甲醇、乙腈等）。原理：（1）降低了溶質的介電常數，使溶質之間的靜電引力增加，從而出現聚集現象，導致沉淀。lgS=K/?2+lgS0（2）由于有機溶劑的水合作用，降低了自由水的濃度，降低了親水溶質表面水化層的厚度，降低了親水性，導致脫水凝聚。常用的有機溶劑沉析劑乙醇：沉析作用強，揮發性適中，無毒常用于蛋白質、核酸、多糖等生物大分子的沉析；丙酮：沉析作用更強，用量省，但毒性大，應用范圍不廣；特點：介電常數小，60%乙醇的介電常數是48

丙酮的介電常數是22

容易獲取溶劑選擇（1）介電常數要小（2）致變性作用要小（甲醇）（3）毒性要小、揮發性適中（4）水溶性要好有機溶劑沉析的特點

（1）分辨率高；（2）溶劑容易分離，并可回收使用；（3）產品潔凈；（4）容易使蛋白質等生物大分子失活；應注意在低溫下操作；（5）成本高，環境污染影響有機溶劑沉析的主要因素

（1）溫度：低溫有利于防止溶質變性；有利于提高收率（溶解度下降）；（2）攪拌速度：散熱（3）溶液pH值：原則是避免目標蛋白與雜質帶有相反的電荷，防止共沉現象。（pI）影響有機溶劑沉析的主要因素（4）離子強度：離子強度低有利于沉析，0.01-0.05mol/L（5）樣品濃度：0.5-2%

稀：溶劑用量大，回收率低，但共沉淀作用小 濃：節省溶劑用量，共沉作用強，分辨率低（6）金屬離子的助沉析作用：Zn2+、Ca2+3.等電點沉淀法1、概念：調節體系pH值，使兩性電解質的溶解度下降，析出的操作稱為等電點沉淀。2、原理：蛋白質是兩性電解質，當溶液pH值處于等電點時，分子表面凈電荷為0，雙電層和水化膜結構被破壞，由于分子間引力，形成蛋白質聚集體，進而產生沉淀。等電點沉淀法3、特點：

由于在等電點附近，溶質仍然有一定的溶解度，等電點沉淀法往往不能獲得高的回收率，因此等電點沉淀法通常與鹽析、有機溶劑沉淀法聯合使用

等電點沉淀法注意事項（1）由于無機離子的影響，蛋白質的等電點通常會發生“漂移”，陽-高，陰-低（2）溶質的穩定性（3）鹽析效應其它沉淀法水溶性非離子型聚合物沉淀劑PEG（聚乙二醇）、NPEO（壬苯乙烯化氧）、葡聚糖、右旋糖苷硫酸酯常用的此類沉淀劑是PEG，相對分子量一般為6000；成鹽類復合物沉析劑金屬復合鹽：與生物分子的酸性基團作用，Cu2＋、Ag＋、Zn2＋有機酸復合鹽：與生物分子的堿性基團作用無機復合鹽：磷鎢酸鹽、磷鉬酸鹽離子型表面活性劑CTAB（十六烷基三甲基季銨鹽溴化物）、十二烷基磺酸鈉（SDS）其它沉淀法離子型多聚物沉析劑核酸（多聚陰離子）、魚精蛋白（多聚陽離子）氨基酸類沉析劑選擇性沉淀劑。如組氨酸－氯化汞，精氨酸－苯甲醛，亮氨酸－鄰二甲基苯磺酸等分離核酸用沉析劑酚、氯仿、