第三章

基因工程【概念】基因工程是指按照人們的愿望，通過轉基因等技術，賦予生物新的遺傳特性，創造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產品。從技術操作層面看，由于基因工程是在DNA分子水平上進行設計和施工的，因此又叫作重組DNA技術。基因工程基因工程是指按照人們的愿望，通過轉基因等技術，賦予生物新的遺傳特性，創造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產品。從技術操作層面看，由于基因工程是在DNA分子水平上進行設計和施工的，因此又叫作重組DNA技術。基因（DNA）;分子水平;基因重組（廣義上）;創造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產品;定向改造生物性狀；克服遠緣雜交不親和障礙；操作對象結

果操作水平原

理意

義基因工程的理論基礎【資料】人的胰島素基因能通過拼接并在受體細胞大腸桿菌中表達出相同的蛋白質。【思考】1.大腸桿菌和人的遺傳物質是：

。2.不同生物的DNA分子可以拼接在一起，原因是：①DNA分子的基本組成單位都是

;②DNA分子的空間結構都是規則的

;③DNA分子的

方式相同;3.一種生物的基因可以在另一種生物細胞內表達，原因是：①

是控制生物性狀的基本單位;②遺傳信息的傳遞都遵循

;③生物界共用一套

;DNA四種脫氧核苷酸

雙螺旋結構

堿基互補配對基因中心法則遺傳密碼注：基因的長度一般在100個堿基對以上。A=TC≡G003.1重組DNA技術的基本工具本節聚焦：1.重組DNA技術所需的三種基本工具是什么？它們的作用分別是什么？2.基因工程載體需要具備什么條件?從社會中來從社會中來【資料】番木瓜容易受番木瓜環斑病毒的侵襲。當番木瓜被這種病毒感染后，產量會大大下降。科學家通過精心設計，用“分子工具”培育出了轉基因番木瓜，它可以抵御番木瓜環斑病毒。限制性內切核酸酶DNA連接酶載體工具分子手術刀:分子縫合針:分子運輸車:將DNA片段再連接起來將體外重組好的DNA分子導入受體細胞準確切割DNA分子【思考】DNA雙螺旋的直徑只有2nm,對如此微小的分子進行操作，是一項非常精細的工作，更需要專門的“分子工具”。那么，科學家究竟用到了哪些“分子工具”？這些“分子工具”各具有什么特征呢？“分子手術刀”：限制性內切核酸酶01簡稱：限制酶原核生物

來源種類功能主要從

中分離純化出來；它們能識別

的

，并且使每一條鏈中特定部位的

斷開。

種；數千雙鏈DNA分子特定核苷酸序列磷酸二酯鍵限制酶不是一種酶，而是一類酶。具有專一性“分子手術刀”：限制性內切核酸酶01限制酶BamHⅠHindⅢEcoRⅠTaqⅠ識別序列及切割位點GGATCCCCTAGGAAGCTTTTCGAAGAATTCCTTAAGTCGAAGCT識別序列大多數限制酶的識別序列由

個核苷酸組成，也有少數限制酶的識別序列由

個、

個或其他數量的核苷酸組成。648【思考】觀察以上限制酶識別的序列，有什么特點？△以上序列都可以找到一條中心軸線，中軸線兩側的雙鏈DNA上的堿基是

的，這就是回文序列。反向對稱重復排列注：限制酶特異性識別和切割的部位基本都具有回文序列：即在切割部位，一條鏈正向讀的堿基順序，與另一條鏈反向讀的順序完全一致。

EcoRⅠ限制酶-【思考】EcoRⅠ限制酶的:①識別序列：②切割位點：③切割部位：“分子手術刀”：限制性內切核酸酶01磷酸二酯鍵GAATTC在G與A之間切割注：連接堿基的氫鍵是分子間的相互作用力，可以自發斷裂，也可以自發形成。磷酸二酯鍵作用部位鳥嘌呤脫氧核苷酸腺嘌呤脫氧核苷酸“分子手術刀”：限制性內切核酸酶01切割結果【資料1】EcoRⅠ只能識別GAATTC序列，并在G和A之間切開。中心軸線黏性末端當限制酶在它識別序列的中心軸線兩側將DNA分子的兩條鏈分別切開時，產生的是黏性末端。（指切口伸出的核苷酸，它們之間正好互補配對）產生黏性末端“分子手術刀”：限制性內切核酸酶01切割結果【資料2】SmaⅠ只能識別CCCGGG序列，并在C和G之間切開。當限制酶在它識別序列的中心軸線處切開時，產生的是平末端。（指平整的切口）中心軸線平末端產生平末端“分子手術刀”：限制性內切核酸酶01切割結果產生黏性末端或平末端注：由于限制酶只能識別

，每切割一次，斷開

個磷酸二酯鍵，產生

個游離的磷酸基團，產生

個黏性末端(平末端)，消耗

分子水。雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列2222“分子手術刀”：限制性內切核酸酶01【資料3】某生物DNA片段：5’-TCCTAGAATTCTCGG……TATGAATTCCATAC-3’3’-AGGATCTTAAGAGCC……ATACTTAAGGTATG-5’目的基因100個堿基對↑要切兩個切口，產生四個黏性末端。若要想獲得某個特定性狀的基因(目的基因)必須要用限制酶切幾個切口？可產生幾個黏性末端？思考“分子手術刀”：限制性內切核酸酶01【資料3】某生物DNA片段：5’-TCCTAGAATTCTCGG……TATGAATTCCATAC-3’3’-AGGATCTTAAGAGCC……ATACTTAAGGTATG-5’目的基因100個堿基對↑已知：EcoRⅠ只能識別GAATTC序列，并在G和A之間切開。嘗試找到該生物DNA片段上EcoRⅠ的識別序列和切割位點。思考“分子手術刀”：限制性內切核酸酶01如果要將兩種來源不同的DNA進行重組，應該怎樣處理？思考G

AA

TT

CC

TT

AA

GG

AA

TT

CC

TT

AA

GG

C

TT

AA

AA

T

T

C

GGC

TT

A

A

AA

T

T

C

G用同種限制酶切割(EcoRⅠ)產生相同的黏性末端“分子手術刀”：限制性內切核酸酶01G

C

TT

AA

AA

T

T

C

GGCTTAA

AA

TT

C

G缺口怎么辦？思考作用將

連接起來，恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的

，形成重組DNA分子。分類“分子縫合針”：DNA連接酶02種類來源功能特性既能連接

，又能連接

；（但連接

的效率極低）既能連接

，又能連接

；（但連接

的效率較低）相同點恢復的都是

；大腸桿菌T4噬菌體E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶兩個DNA片段磷酸二酯鍵黏性末端平末端黏性末端平末端平末端平末端磷酸二酯鍵注：DNA連接酶沒有識別特異性；“分子縫合針”：DNA連接酶02DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？為什么？思考注：DNA聚合酶只能將單個核苷酸連接到已有的核苷酸鏈上，形成磷酸二酯鍵。“分子縫合針”：DNA連接酶02DNA連接酶DNA聚合酶相同點作用實質都能催化兩個脫氧核苷酸之間形成

；化學本質不同點模板作用對象作用結果用途都是蛋白質 不需要需要DNA的一條鏈作模板脫氧核苷酸鏈連接起來脫氧核苷酸從頭合成基因工程DNA復制游離的DNA片段磷酸二酯鍵游離的脫氧核苷酸基因工程的工具酶·判斷正誤P53(1)基因工程可以實現遺傳物質在不同物種間的轉移，人們可以定向選育

新品種()(2)限制性內切核酸酶均能特異性地識別6個核苷酸序列()(3)DNA連接酶能將兩堿基通過氫鍵連接起來()(4)限制酶和解旋酶的作用部位相同()√××限制酶作用于磷酸二酯鍵，解旋酶作用于氫鍵。也有少數限制酶的識別序列由4個、8個或其他數量的核苷酸組成。恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵。×1．如圖是幾種不同限制酶切割DNA分子后形成的部分片段。下列敘述正確的是()A．以上DNA片段是由4種限制酶切割后產生的B．②片段是在識別序列為

的限制酶作用下形成的C．①和④兩個片段在DNA聚合酶的作用下可形成重組DNA分子D．限制酶和DNA連接酶作用的部位都是磷酸二酯鍵基因工程的工具酶·落實思維方法P55D3種，①④是同一種限制酶切割形成的，×；識別GAATTC，×；CTTAAGDNA連接酶，×；2．DNA連接酶是基因工程的必需工具。下列有關DNA連接酶的敘述，錯誤的是()A．DNA連接酶可以將任意的兩個DNA片段連接成一個重組DNA分子B．DNA連接酶發揮作用時不需要識別特定的脫氧核苷酸序列C．DNA連接酶可以催化兩個脫氧核苷酸之間磷酸二酯鍵的形成D．有些DNA連接酶既能連接黏性末端，又能連接平末端基因工程的工具酶·落實思維方法P55ADNA連接酶可以連接平末端或互補配對的黏性末端，不是任意，×；素養提升【資料1】原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在長期的進化過程中形成了一套完善的防御機制，以防止外來病原物的侵害。限制酶就是細菌的一種防御性工具，當外源DNA侵入時，會利用限制酶將外源DNA切割掉，以保證自身的安全。限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？(書本P71)思考限制酶是原核生物的一種防御工具，用來切割侵入細胞的外源DNA，以保證自身安全。素養提升【資料2】通過長期的進化，細菌中含有某種限制酶的細胞，其DNA分子中不具備這種限制酶的識別切割序列，或者通過甲基化酶將甲基轉移到所識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。這樣，盡管細菌中含有某種限制酶也不會使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA的入侵。為什么限制酶不切割細菌本身的DNA分子？(書本P74)思考①含某種限制酶的細菌的DNA分子不具備這種限制酶的識別序列；②甲基化酶將甲基轉移到了限制酶所識別序列的堿基上，

使限制酶不能將其切開。（表觀遺傳學）“分子運輸車”：基因進入受體細胞的載體03作用將

送入受體細胞；種類種類用途不同點將外源基因導入大腸桿菌等受體細胞

不同，在

、

、

.以及可以插入

的

大小也有很大差別。將外源基因導入植物細胞將外源基因導入動物細胞噬菌體植物病毒動物病毒來源大小結構復制方式外源DNA片段質粒注：最常用的載體是質粒外源基因“分子運輸車”：基因進入受體細胞的載體03最常用的載體——質粒①化學本質：是一種

的、結構簡單、獨立于

或

之外，并具有

能力的

。②基因工程中使用質粒的特點：在基因工程操作中，真正被用作載體的質粒，都是天然質粒的基礎上進行過

的。真核細胞細胞核環狀雙鏈DNA分子原核細胞擬核DNA裸露人工改造自我復制“分子運輸車”：基因進入受體細胞的載體03最常用的載體——質粒常見的標記基因：①抗性基因②發光基因③產物具有顏色反應

的基因③作為載體所具備的條件及原因：a.具有一個至多個

切割位點，供外源DNA片段(基因)插入其中。b.能在受體細胞中進行

，或整合到受體DNA上，隨受體DNA

,使外源基因在受體細胞中穩定存在并復制，以擴增外源基因的數量。c.具有特殊的

，便于重組DNA分子的篩選。d.對受體細胞無

作用，避免受體細胞受到損傷。限制酶自我復制標記基因同步復制毒害“分子運輸車”：基因進入受體細胞的載體03最常用的載體——質粒質粒(載體)一定能成功導入受體細胞嗎？思考提示：

，因為質粒(載體)攜帶目的基因導入受體細胞的成功率

。因此還需要進一步

出成功導入質粒(載體)的受體細胞。不一定不高篩選“分子運輸車”：基因進入受體細胞的載體03最常用的載體——質粒如何篩選出含質粒(載體)的受體細胞？思考提示：質粒(載體)上的標記基因一般是

，而受體細胞本身

抵抗該抗生素的能力。用含有

的培養基培養受體細胞，能夠生存的是

。某種抗生素的抗性基因沒有該抗生素被導入了載體的受體細胞“分子運輸車”：基因進入受體細胞的載體03最常用的載體——質粒根據標記基因的作用，在含有某種抗生素的培養基中篩選存活的受體細胞一定是導入目的基因的受體細胞嗎？為什么？思考提示：

；原因：導入

的和導入

的受體細胞均能在該培養基中存活。不一定空載體含目的基因載體①空載體(含抗性基因的質粒)氨芐青霉素抗性基因②含目的基因載體(含抗性基因和目的基因的質粒)氨芐青霉素抗性基因目的基因“分子運輸車”：基因進入受體細胞的載體03最常用的載體——質粒如何提高篩選的準確性?思考提示：當質粒(載體)上有兩個標記基因時，可將目的基因插入其中一個標記基因中，也就是重組質粒上含有

標記基因，普通質粒上含有

標記基因。則

的受體細胞不具有標記基因控制的性狀，

的受體細胞具有兩個標記基因控制的性狀，

的受體細胞只具有一個標記基因控制的性狀。這樣可根據標記基因控制的性狀準確篩選出含有重組質粒的受體細胞。未導入導入導入一個兩個沒有導入質粒導入普通質粒導入重組質粒基因進入受體細胞的載體·判斷正誤P5503(1)作為載體的質粒通常采用抗生素合成基因作為篩選標記基因()(2)質粒是環狀雙鏈DNA分子，是基因工程常用的載體()(3)載體(如質粒)和細胞膜上的載體蛋白的成分相同()(4)DNA重組技術所需要的工具酶有限制酶、DNA連接酶和載體()×√×DNA重組技術所需要的工具酶有限制酶、DNA連接酶，載體不屬于工具酶。抗生素抗性基因。載體(如質粒)的成分是DNA，細胞膜上的載體的主要成分是蛋白質。×基因進入受體細胞的載體·落實思維方法P56033.質粒是基因工程中最常用的目的基因運載工具。

下列有關敘述正確的是()A．質粒是只存在于細菌細胞質中能自我復制的小型環狀雙鏈DNA分子B．在所有的質粒上總能找到一個或多個限制酶切割位點C．攜帶目的基因的重組質粒只有整合到受體細胞的染色體DNA上

才會隨后者的復制而復制D．質粒上的抗性基因常作為標記基因供重組DNA的篩選D質粒不只分布于原核生物中，在真核生物如酵母菌細胞內也有分布，×；并不是所有的質粒上都能找到限制酶的切割位點，×；可以在細胞內自我復制，或整合到受體細胞染色體DNA上后復制，×；基因進入受體細胞的載體·落實思維方法P56034．某細菌質粒上有標記基因如圖所示，通過標記基因可以推知外源基因(目的基因)是否轉入成功。外源基因插入的位置不同，細菌在培養基上的生長情況也不同，如圖所示是外源基因插入位置(插入點有a、b、c)示意圖。請根據表中提供的細菌生長情況，推測①②③三種重組后細菌的外源基因插入點，正確的一組是()插入點細菌在含氨芐青霉素的培養基上的生長狀況細菌在含四環素的培養基上的生長狀況①能生長能生長②能生長不能生長③不能生長能生長a×a×a√b×b√b×基因進入受體細胞的載體·落實思維方法P56034．正確的一組是()AA．①是c；

②是b；

③是aB．①是a和b；

②是a；

③是bC．①是a和b；

②是b；

③是aD．①是c；

②是a；

③是b重組DNA分子的模擬操作04重組DNA分子的模擬操作04同種限制酶切割目的基因（100bp↑）重組DNA分子的模擬操作04DNA連接酶連接目的基因（100bp↑）產生相同的黏性末端同種限制酶切割目的基因（100bp↑）重組DNA分子的模擬操作04①選目的基因兩端和載體都有的酶切位點；②所選酶切位點不能破壞目的基因以及標記基因；選擇酶切位點的原則是？思考重組DNA分子的模擬操作·拓展應用041.請寫出限制酶Spe

Ⅰ、Hind

Ⅲ、Xba

Ⅰ和Xho

Ⅰ切割形成的末端。SpeⅠHindⅢXbaⅠXhoⅠ注:不同限制酶切割

(填“可能”或“不可能”)產生相同的黏性末端。可能重組DNA分子的模擬操作·拓展應用042.限制酶

切割產生的DNA片段能與限制酶Spe

Ⅰ切割產生的DNA片段相連接，因為:

；3.連接完成后，該重組DNA分子的新連接處

.（填“能”或“不能”）再被所用的限制酶切割，因為:

.

。SpeⅠHindⅢXbaⅠXhoⅠXbaⅠXbaⅠ與SpeⅠ切割產生了相同的黏性末端不能所用的兩種限制酶均不能識別該重組DNA分子的新連接處的脫氧核苷酸序列重組DNA分子重組DNA分子的模擬操作·拓展應用04不同的限制酶切割可能產生相同的黏性末端，這在基因工程操作中有什么意義？思考【資料】識別DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割產生相同黏性末端的限制酶被稱為同尾酶。限制酶識別序列產生的黏性末端SpeⅠTCTAGACTAG-XbaⅠACTAGTCTAG-提示：同尾酶使構建載體時，切割位點的選擇范圍

。例如，我們選擇了用SpeⅠ限制酶切割載體，如果目的基因的中剛好含有TCTAGA序列中，那么用該限制酶切割含有目的基因的DNA片段時，目的基因就很可能被

；這時可以考慮用合適的同尾酶

(目的基因的核苷酸序列中沒有ACTAGT)來獲取目的基因。擴大切斷XbaⅠ練習與應用·書本P741.DNA連接酶是重組DNA技術常用的一種工具酶。下列相關敘述正確的是（

）A.能連接DNA分子雙鏈堿基對之間的氫鍵B.能將單個脫氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯鍵C.能連接用同種限制酶切開的兩條DNA片段，重新形成磷酸二酯鍵D.只能連接雙鏈DNA片段互補的黏性末端，不能連接雙鏈DNA片段的平末端2.在重組DNA技術中,將外源基因送入受體細胞的載體可以是（）A.大腸桿菌的質粒B.切割DNA分子的酶C.DNA片段的黏性末端D.用來識別特定基因的DNA探針CA歸納總結：幾種相關酶的比較名稱作用部位作用結果

酶磷酸二酯鍵切割DNA分子

酶磷酸二酯鍵將兩個DNA片段連接為一個DNA分子

酶磷酸二酯鍵將單個脫氧核苷酸依次連接到單鏈末端

酶磷酸二酯鍵將DNA片段水解為單個脫氧核苷酸

酶堿基對之間的氫鍵將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈，形成兩條長鏈限制DNA連接DNA聚合DNA(水解)解旋注：DNA聚合酶只能將單個核苷酸連接到已有的核苷酸鏈上，

形成磷酸二酯鍵。歸納總結：幾種相關酶的比較1.如圖表示DNA分子在不同酶的作用下所發生的變化，下列選項中，表示限制酶、DNA聚合酶、DNA連接酶、解旋酶作用圖解的正確順序是(

)A.①②③④

B.②①④③

C.①④②③

D.①④③②C限制酶DNA連接酶解旋酶DNA聚合酶歸納總結：幾種相關酶的比較2.據圖所示，有關酶功能的敘述不正確的是(

)A.限制性內切核酸酶可以切斷a處B.DNA聚合酶可以連接a處C.解旋酶可以使b處解開D.DNA連接酶可以連接c處D磷酸二酯鍵（磷酸與3’-C之間），√；磷酸二酯鍵（磷酸與3’-C之間），√；解旋酶將DNA雙鏈解開成單鏈，作用于氫鍵，√；磷酸二酯鍵（磷酸與3’-C之間），×；實驗：DNA的粗提取與鑒定05實驗思路DNA、RNA、蛋白質和脂質等在

方面存在差異，可以利用這些差異，選用適當的

對它們進行提取。物理和化學性質物理和化學方法1.提取DNA的原理：①

不溶于酒精，但

溶于酒精。②DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于

mol/LNaCl溶液。2.鑒定DNA的原理：在一定溫度下，DNA遇

試劑會呈現

。→可初步分離DNA和蛋白質；實驗原理DNA某些蛋白質2二苯胺藍色注：二苯胺有毒，需現配現用并用棕色瓶存放。實驗：DNA的粗提取與鑒定05擴展DNA在NaCl溶液中的溶解度具有顯著的濃度依賴性。①DNA在

mol/L的NaCl溶液中溶解度最小，此時DNA

（填“溶解”或“析出”）②DNA在

mol/L的NaCl溶液中溶解度最大，此時DNA

（填“溶解”或“析出”）0.14溶解析出2實驗：DNA的粗提取與鑒定05材料用具：材料

的生物組織，如新鮮洋蔥、香蕉、菠菜、菜花和豬肝等；DNA含量相對較高注意：①不能用哺乳動物的血液作為材料，原因:

。②以血液為實驗材料時，每100mL血液中需要加入3g

(抗凝劑)，原因:

。③利用動物細胞提取DNA破碎細胞的方法:

。成熟的紅細胞中無細胞核和線粒體，幾乎不含DNA檸檬酸鈉防止血液凝固直接吸水漲破(原因：動物細胞無細胞壁)實驗：DNA的粗提取與鑒定05①研磨液②體積分數為95%的酒精③2mol/L的NaCl溶液④二苯胺試劑⑤蒸餾水→保護DNA，破壞膜結構；→析出DNA；→溶解DNA；→鑒定DNA；材料用具：試劑材料用具：用具燒杯、量筒、玻璃棒、研缽、紗布、漏斗、試管、試管架、試管夾、酒精燈、陶土網、三腳架、火柴、刀片和天平等實驗：DNA的粗提取與鑒定05方法步驟①取材研磨研磨液破碎細胞，使核物質容易溶解在研磨液中；研磨的目的是什么？思考研磨液成分作用SDSEDTATris-HCl緩沖液使蛋白質變性抑制DNA酶活性穩定DNA稱取30g洋蔥，切碎，然后放入研缽中，倒入10mL

，充分研磨。注：不可以用濾紙代替，因為DNA會被吸附到濾紙上而大量損失。實驗：DNA的粗提取與鑒定05方法步驟方法一：在漏斗中墊上

，將洋蔥研磨液過濾到燒杯中，在

℃冰箱中放置幾分鐘后，再取

。紗布4②過濾或離心取上清液低溫放置幾分鐘的作用？思考①抑制核酸水解酶的活性，進而抑制DNA降解；②低溫有利于增加DNA分子的柔韌性，減少其斷裂；上清液實驗：DNA的粗提取與鑒定05方法步驟方法二：也可直接將研磨液倒入塑料離心管中，

r/min的轉速下離心5min，再取

放入燒杯中。②過濾或離心取上清液上清液中除DNA之外，可能含有哪些雜質？思考