第2節基因工程的基本操作程序第3章基因工程學習目標核心素養闡明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的篩選與獲取、基因表達載體的構建、將目的基因導入受體細胞和目的基因的檢測與鑒定。1.科學思維：結合生產實例，舉例說出基因工程的基本操作程序。2．科學探究：針對人類生產和生活的某一需求，嘗試提出初步的基因工程構想，完成初步設計。一、基因工程的基本操作程序目的基因的篩選與獲取基因表達載體的構建將目的基因導入受體細胞目的基因的檢測與鑒定前提核心關鍵保證思考:獲得目的基因之后直接轉入受體嗎？不是游離的DNA片段進入受體細胞，一般會直接被分解，就算可以進行轉錄和翻譯成蛋白質，游離的DNA片段也無法隨著細胞分裂進行復制，導致子代細胞不再含有目的基因。(二)基因表達載體的構建（核心）1.操作目的：讓目的基因在受體細胞中穩定存在，并且遺傳給下一代，同時，使目的基因能夠表達和發揮作用。2.基因表達載體的構成啟動子目的基因限制酶切割位點復制原點標記基因終止子（若需要能完成自主復制，還應有復制原點）目的基因啟動子終止子標記基因（1）啟動子(二)基因表達載體的構建（核心）2.基因表達載體的構成啟動子目的基因限制酶切割位點復制原點標記基因終止子思考:表達載體為什么一定要有啟動子？

生物之間進行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動子才能有利于基因的表達；通過cDNA文庫獲得的目的基因沒有啟動子，只將編碼序列導入受體細胞無法轉錄。啟動子：位于基因首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識別和結合的部位，有了它才能驅動基因轉錄出mRNA。操縱基因結構基因

啟動子RNA聚合酶（1）啟動子(二)基因表達載體的構建（核心）2.基因表達載體的構成啟動子目的基因限制酶切割位點復制原點標記基因終止子①本質:一段有特殊序列結構的DNA片段②位置:位于基因的上游（首端），緊挨轉錄的起始位點。③特殊類型：誘導型啟動子。④誘導型啟動子的特點：當誘導物存在時，可以激活或抑制目的基因的表達

。（2）終止子(二)基因表達載體的構建（核心）2.基因表達載體的構成啟動子目的基因限制酶切割位點復制原點標記基因終止子①本質:一段有特殊序列結構的DNA片段。②位置:位于基因的下游。③功能：使轉錄在所需要的地方停下來。（3）標記基因①作用：是為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的重組DNA分子細胞篩選出來。②常見類型:抗生素抗性基因、熒光蛋白基因等。啟動子終止子起始密碼子終止密碼子本質位置功能補充：啟動子、終止子、起始密碼子、終止密碼子對比DNA片段DNA片段mRNA上三個相鄰的堿基mRNA上三個相鄰的堿基目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端RNA聚合酶識別和結合的部位，驅動基因轉錄出mRNA使轉錄在所需要的地方停下來翻譯的起始信號（編碼氨基酸）翻譯的結束信號（不編碼氨基酸）質粒啟動子限制酶切割位點終止子標記基因復制原點限制酶目的基因限制酶切割位點限制酶獲取目的基因連接酶重組DNA分子

載體（質粒）含有目的基因的DNA片段同種限制酶或能產生相同末端的限制酶切割帶有黏性末端（或平末端）的切口帶有相同黏性末端（或平末端）的目的基因片段DNA連接酶重組DNA分子（重組質粒）基因表達載體構建模式圖(二)基因表達載體的構建（核心）3.基因表達載體的構建過程思考：切割載體和切割含有目的基因的DNA片段的限制酶應符合什么條件？

為什么？應為同種限制酶或能產生相同末端的限制酶；產生相同的黏性末端或平末端，以便通過DNA連接酶連接；不一定，載體和目的基因都可能出現自身環化；三種：載體-載體、目的基因-目的基因、載體-目的基因用同一種限制酶切割質粒和含有目的基因的DNA，再用DNA連接酶處理后，一定會形成重組DNA分子嗎？用同一種限制酶切割質粒和含有目的基因的DNA，再用DNA連接酶處理后，可能有幾種產物（只考慮兩兩連接）？思考：用同一種限制酶切割質粒和含有目的基因的DNA，再用DNA連接酶處

理后，形成的“載體-目的基因”產物一定符合要求嗎？不一定，目的基因可能反向連接到質粒上。同時用兩種限制酶切割含目的基因的DNA片段和載體（使得目的基因的一端與載體一端的黏性末端相同，而目的基因的另一端與載體另一端的黏性末端相同）。這種方法針對性差，完全靠運氣，也無法確定哪些基因導入了受體細胞。如何避免上述問題？將生物的所有DNA直接導入受體細胞不是更簡便嗎？如果這么做，效果會怎樣？一、基因工程的基本操作程序目的基因的篩選與獲取基因表達載體的構建將目的基因導入受體細胞目的基因的檢測與鑒定前提核心關鍵保證

為何要把重組質粒導入受體細胞？

受體細胞可以分為那些類型？依據他們的結構與功能推測，導入方法相同嗎?

如何選擇受體細胞，才能讓轉基因猴全身體細胞都帶有目的基因？

培育抗蟲棉時也必須選用這種細胞嗎，為什么？(三)

將目的基因（重組質粒）導入受體細胞1.將目的基因導入植物細胞—花粉管通道法①用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；②在植物受粉后的一定時間內，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進入胚囊。受體細胞：受精卵地位：我國科學家獨創實例：將Bt基因導入棉花細胞“轉化”概念：目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩定和表達的過程。此處“轉化”與肺炎鏈球菌轉化實驗中的“轉化”含義相同，實質都是基因重組。農桿菌生活在土壤中的微生物，自然條件下可侵染雙子葉植物和裸子植物，而對大多數單子葉植物沒有侵染能力。農桿菌細胞內含有Ti質粒，當它侵染植物細胞后，能將Ti質粒上的T-DNA（可轉移的DNA）轉移到被侵染的細胞，并且將其整合到該細胞的染色體DNA上。(三)

將目的基因（重組質粒）導入受體細胞2.將目的基因導入植物細胞—農桿菌轉化法1.將新鮮的從葉片上取下的圓形小葉與農桿菌共培養，然后篩選轉化細胞，并再生成植株；2.將花序直接浸沒在含農桿菌的溶液中一段時間，然后培養植株并獲得種子，再進行篩選、鑒定。(三)

將目的基因（重組質粒）導入受體細胞2.將目的基因導入植物細胞—農桿菌轉化法農桿菌轉化法示意圖Ti質粒目的基因構建基因表達載體含目的基因的重組Ti質粒轉入農桿菌導入植物細胞目的基因插入染色體DNA中植物細胞表現出新性狀的植株植物組織培養農桿菌轉化法的實驗思路（過程）：將目的基因插入Ti質粒的T-DNA中，通過農桿菌的轉化作用，就可以使目的基因進入植物細胞，并整合到受體細胞的染色體DNA上，使目的基因能夠維持穩定和表達。農桿菌轉化法示意圖農桿菌轉化法的實驗思路（過程）：將目的基因插入Ti質粒的T-DNA中，通過農桿菌的轉化作用，就可以使目的基因進入植物細胞，并整合到受體細胞的染色體DNA上，使目的基因能夠維持穩定和表達。兩次拼接：第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質粒的T-DNA上；第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T-DNA拼接到受體細胞染色體的DNA上。農桿菌轉化法示意圖農桿菌轉化法的實驗思路（過程）：將目的基因插入Ti質粒的T-DNA中，通過農桿菌的轉化作用，就可以使目的基因進入植物細胞，并整合到受體細胞的染色體DNA上，使目的基因能夠維持穩定和表達。兩次導入：第一次導入是將含目的基因的Ti質粒重新導入農桿菌；第二次導入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA導入受體細胞（非人工操作）。

適用于單子葉植物

基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產生的動力，將包裹在金屬顆粒表面的表達載體DNA打入受體細胞中，使目的基因與其整合并表達的方法。(三)

將目的基因（重組質粒）導入受體細胞3.將目的基因導入到植物細胞中方法--基因槍法

由于不同轉基因產品所需要的目的基因不同，受體細胞又有植物、動物、微生物之分，因此基因表達載體的構建方法不是千篇一律的,將目的基因導入受體細胞的方法也不是完全相同的。(三)

將目的基因（重組質粒）導入受體細胞4.將目的基因導入動物細胞——顯微注射法利用顯微注射將目的基因注入動物受精卵中（因為受精卵容易表現出全能性），這個受精卵將發育成具有新性狀的動物。將目的基因導入動物受精卵最有效的方法。顯微注射將目的基因注射到動物受精卵中（1）受體細胞：常用原核生物作為受體細胞，其中以大腸桿菌最廣泛。

優點：繁殖快、單細胞、遺傳物質相對較少、易于培養。（2）Ca2+處理法（感受態細胞法）的一般過程Ca2+處理大腸桿菌使細胞處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態將重組的基因表達載體導入其中Ca2+的作用：增加細胞壁的通透性這種細胞稱為感受態細胞一般利用溫度變化導入(三)

將目的基因（重組質粒）導入受體細胞5.將目的基因導入微生物細胞——Ca2+處理法思考：當真核生物的基因以原核生物作為受體細胞時。

真核生物的基因有內含子，原核生物沒有真核生物所具有的切除內含子對應的RNA序列的機制，其初始轉錄產物中與內含子對應的RNA序列不能被切除，因此無法表達出該蛋白。使用cDNA作為目的基因或使用酵母菌等真核生物作為受體細胞。

原核生物缺少高爾基體和內質網等細胞器，無法對真核生物的蛋白質進行正確的加工。人工體外再加工或使用酵母菌等真核生物作為受體細胞若無法獲得該蛋白，原因可能是什么？若可以獲得該蛋白，但是蛋白質無活性，原因可能是？以上情況如何解決？以上情況如何解決？實例：利用轉基因大腸桿菌生產藥物

原核生物作為受體細胞產生的真核生物的蛋白質通常沒有生物活性，需要在體外進行再加工。一、基因工程的基本操作程序目的基因的篩選與獲取基因表達載體的構建將目的基因導入受體細胞目的基因的檢測與鑒定前提核心關鍵保證

目的基因進入受體細胞后，是否穩定維持和表達其遺傳特性，只有通過檢測與鑒定才能知道。生物大分子具有特異性

----分子水平的檢測特定基因控制特定性狀,如抗蟲、抗旱等

----性狀水平的檢測檢測—鑒定——3.檢測目的基因是否翻譯成蛋白質抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等2.檢測目的基因是否轉錄出了mRNA1.檢測受體細胞的染色體DNA上是否插入了目的基因(四)

目的基因的檢測與鑒定1.分子水平檢測目的基因DNA分子雜交檢測mRNA檢測表達的蛋白質分子雜交抗原—抗體雜交PCR反應PCR反應標記基因標記基因(四)

目的基因的檢測與鑒定(1)首先取出轉基因生物的基因組DNA；檢測目的基因:DNA分子雜交(2)將含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標記,以此做探針；(3)

使探針和轉基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明染色體已插入染色體DNA中。基因探針:簡稱探針，是一段帶有檢測標記（同位素、熒光分子或化學發光催化劑），且順序已知的，與目的基因互補核酸序列(DNA或RNA)。15N15N變性變性1.分子水平(四)

目的基因的檢測與鑒定檢測目的基因是否轉錄出了mRNA:DNA分子雜交

用上述探針和轉基因生物的mRNA雜交,若出現雜交帶,表明目的基因轉錄出了mRNA。1.分子水平(四)

目的基因的檢測與鑒定檢測表達的蛋白質:抗原—抗體雜交15N15N變性變性DNA分子雜交基因探針待測DNA單鏈DNA或RNA片斷，帶有某種標記，能與目標DNA或RNA的一條鏈發生堿基互補配對。

抗原—抗體雜交分子雜交（2）方法:RNA分子雜交（3）方法:抗原—抗體雜交鑒定——抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現中毒癥狀，說明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達。如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達。2.個體水平(四)

目的基因的檢測與鑒定若不能表達，要對抗蟲基因再進行修飾。補充思考：在抗原-抗體雜交中，目的蛋白是作為抗原還是抗體？抗原轉基因生物鑒定方法成功標志抗蟲植物抗病毒（菌）植物抗鹽植物抗除草劑植物獲取目的基因產物的轉基因生物飼喂害蟲（抗蟲接種實驗）害蟲死亡病毒（菌）感染（抗病接種實驗）未侵染上病斑鹽水澆灌正常生長噴灑除草劑正常生長提取細胞產物與天然產品進行功能活性比較功能、活性正常個體生物學水平的鑒定具體有哪些做法？1.質粒上的抗性基因在基因工程中的主要作用是(