第3章

基因工程第2節

基因工程的基本操作程序

深度學習自主學習導入新課遷移應用1.為什么要構建基因表達載體？3.如何構建基因表達載體？閱讀教材P80，回答下列問題：2.基因表達載體一般由哪些部分組成？一

基因表達載體的構建二一

基因表達載體的構建二☆基因表達載體的構建是基因工程的核心工作。

1.目的基因表達載體的作用：①讓目的基因在受體細胞中穩定存在，并遺傳給下一代；②使目的基因能夠表達和發揮作用。深度學習自主學習導入新課遷移應用基因表達載體應該具備什么結構才能到達以上目的？Bt基因（目的基因）基因表達載體如果目的基因需要復制需要什么結構？復制原點如果目的基因需要表達需要什么條件？需要啟動子和終止子啟動子和終止子應該加在哪？啟動子

位于基因首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識別和結合的部位，有了它才能驅動基因轉錄出mRNA。一

基因表達載體的構建二2.組成深度學習自主學習導入新課遷移應用一

基因表達載體的構建二2.組成深度學習自主學習導入新課遷移應用啟動子的類型根據啟動子的轉錄模式，可分為：①組成型啟動子②組織特異性啟動子

③誘導型啟動子

如外源基因在整株植物中表達，產生大量異源蛋白質或代謝產物在植物體內積累，打破了植物原有的代謝平衡，有些產物對植物并非必需甚至有毒，因而阻礙了植物的正常生長，甚至導致死亡；一

基因表達載體的構建二2.組成深度學習自主學習導入新課遷移應用啟動子的類型根據啟動子的轉錄模式，可分為：①組成型啟動子②組織特異性啟動子

③誘導型啟動子

能夠調控基因的表達，使其基本恒定在一定程度上，從而使基因在不同部位或組織中的表達水平不存在明顯差異。這類啟動子一般來自管家基因，可連續不斷地啟動基因的表達。可能存在問題：一

基因表達載體的構建二2.組成深度學習自主學習導入新課遷移應用啟動子的類型根據啟動子的轉錄模式，可分為：①組成型啟動子

②組織特異性啟動子

③誘導型啟動子

其調控作用使得基因往往只在某些特定器官或組織中表達，且表現出發育調節的特性。

其啟動的外源基因在受體中僅在需要的部位特異表達，克服了組成型啟動子啟動的外源基因在受體植物中非特異、持續、高效表達所造成的浪費，增加了轉基因的效果。最大的優勢：P90一

基因表達載體的構建二2.組成深度學習自主學習導入新課遷移應用啟動子的類型根據啟動子的轉錄模式，可分為：①組成型啟動子②組織特異性啟動子

③誘導型啟動子

當誘導物存在時，可以激活或抑制目的基因的表達。P80如：光誘導表達基因啟動子、熱誘導表達基因啟動子、創傷誘導表達基因啟動子、真菌誘導表達基因啟動子和共生細菌誘導表達基因啟動子等。Bt基因（目的基因）基因表達載體如果目的基因需要復制需要什么結構？復制原點如果目的基因需要表達需要什么條件？需要啟動子和終止子啟動子和終止子應該加在哪？啟動子終止子

位于基因首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識別和結合的部位，有了它才能驅動基因轉錄出mRNA。一

基因表達載體的構建二2.組成深度學習自主學習導入新課遷移應用位于基因的下游；終止轉錄。Bt基因（目的基因）基因表達載體復制原點啟動子終止子

位于基因首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識別和結合的部位，有了它才能驅動基因轉錄出mRNA。一

基因表達載體的構建二2.組成深度學習自主學習導入新課遷移應用位于基因的下游；終止轉錄。基因表達載體還應具有什么結構？標記基因便于重組DNA分子的篩選和鑒定。Bt基因（目的基因）基因表達載體復制原點啟動子終止子

位于基因首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識別和結合的部位，有了它才能驅動基因轉錄出mRNA。一

基因表達載體的構建二2.組成深度學習自主學習導入新課遷移應用位于基因的下游；終止轉錄。標記基因便于重組DNA分子的篩選和鑒定。標記基因常見類型：抗生素抗性基因、熒光蛋白基因等。①

用一定的限制酶切割載體，使其出現一個切口。②用同種限制酶或能產生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。③將切下的Bt基因片段拼接到載體的切口處，再加入適量DNA連接酶，形成了一個重組DNA分子。載體基因表達載體3.構建過程深度學習自主學習導入新課遷移應用一

基因表達載體的構建二質粒EcoRⅠ酶切位點3.構建過程深度學習自主學習導入新課遷移應用一

基因表達載體的構建二Bt基因！EcoRⅠ酶切位點EcoRⅠ酶切位點（目的基因）Bt基因3.構建過程深度學習自主學習導入新課遷移應用一

基因表達載體的構建二（目的基因）Bt基因3.構建過程深度學習自主學習導入新課遷移應用一

基因表達載體的構建二Bt基因（目的基因）重組DNA分子3.構建過程深度學習自主學習導入新課遷移應用一

基因表達載體的構建二4.進一步探究：分析基因表達載體構建的目的和方法深度學習自主學習導入新課遷移應用一

基因表達載體的構建二（1）區分啟動子和終止子與起始密碼子和終止密碼子。（2）如何選擇合適的限制酶？有哪些原則？一

基因表達載體的構建二深度學習自主學習導入新課遷移應用（1）區分啟動子和終止子與起始密碼子和終止密碼子。名稱啟動子終止子起始密碼子終止密碼子化學成分位置作用DNA片段DNA片段mRNA上三個相鄰堿基mRNA上三個相鄰堿基目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRN尾端RNA聚合酶識別和結合的部位，驅動基因轉錄出mRNA決定轉錄的結束翻譯的起始信號決定翻譯過程的結束4.進一步探究：分析基因表達載體構建的目的和方法4.進一步探究：分析基因表達載體構建的目的和方法深度學習自主學習導入新課遷移應用一

基因表達載體的構建二①構建基因表達載體時，能否用SmaⅠ限制酶切割質粒？為什么？不能，因為SmaⅠ切割會破壞質粒的抗生素抗性基因。【例2】請結合下圖，回答問題：質粒上的抗性基因是標記基因，便于重組DNA分子的篩選，若被破壞，無法進一步篩選。4.進一步探究：分析基因表達載體構建的目的和方法深度學習自主學習導入新課遷移應用一

基因表達載體的構建二②使用EcoRⅠ處理質粒和外源DNA，構建出來的重組DNA只有一種嗎？【例2】請結合下圖，回答問題：目的基因一

基因表達載體的構建二深度學習自主學習導入新課遷移應用4.進一步探究：分析基因表達載體構建的目的和方法載體目的基因自連兩兩連接目的基因自連質粒自連目的基因與質粒連接正向連接反向連接11’22’122’1’22’1’1（自身環化）一

基因表達載體的構建二深度學習自主學習導入新課遷移應用4.進一步探究：分析基因表達載體構建的目的和方法載體目的基因自連兩兩連接目的基因自連質粒自連目的基因與質粒連接正向連接反向連接11’22’122’1’22’1’1（自身環化）一

基因表達載體的構建二深度學習自主學習導入新課遷移應用4.進一步探究：分析基因表達載體構建的目的和方法載體目的基因自連兩兩連接目的基因自連質粒自連目的基因與質粒連接目的基因與目的基因連接質粒與質粒連接正向連接反向連接11’22’122’1’22’1’1（自身環化）√×××××4.進一步探究：分析基因表達載體構建的目的和方法深度學習自主學習導入新課遷移應用一

基因表達載體的構建二②使用EcoRⅠ處理質粒和外源DNA，構建出來的重組DNA只有一種嗎？【例2】請結合下圖，回答問題：三種產物：目的基因與質粒連接質粒與質粒連接

目的基因與目的基因連接單酶切缺點:質粒重新環化；目的基因自身環化；質粒與目的基因反向連接。如何改進呢？

使用BamHⅠ和HindⅢ兩種限制酶同時處理質粒和外源DNA。雙酶切（只考慮兩兩結合）不能自身環化！4.進一步探究：分析基因表達載體構建的目的和方法深度學習自主學習導入新課遷移應用一

基因表達載體的構建二也不能反向連接！4.進一步探究：分析基因表達載體構建的目的和方法深度學習自主學習導入新課遷移應用一

基因表達載體的構建二③與只使用EcoRⅠ相比較，使用BamHⅠ和HindⅢ兩種限制酶同時處理質粒和外源DNA的優點是什么？【例2】請結合下圖，回答問題：Ⅰ.可以防止質粒、目的基因的自身環化連接；Ⅱ.還可以防止目的基因與載體的反向連接。（產生不同的粘性末端）4.進一步探究：分析基因表達載體構建的目的和方法深度學習自主學習導入新課遷移應用一

基因表達載體的構建二（2）限制酶的選擇原則①不破壞目的基因原則：如圖甲中可選擇PstⅠ，而不選擇SmaⅠ。②保留標記基因、啟動子、終止子、復制原點原則：

質粒作為載體必須具備標記基因，所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結構，如圖乙中不選擇SmaⅠ。若載體上有兩個及以上的標記基因，則可合理對其中一些標記基因進行酶切破壞，從而達到比1個標記基因更高的篩選成功率，防止只有1個標記基因時出現的“假陽性”(即未成功導入目的基因的載體也能正常表達標記基因，造成無效篩選)。4.進一步探究：分析基因表達載體構建的目的和方法深度學習自主學習導入新課遷移應用一

基因表達載體的構建二（2）限制酶的選擇原則(4)巧用“同尾酶”：同尾酶指來源不同，但能產生相同黏性末端的限制酶。當不適合選擇某種限制酶時，可用其同尾酶替換，以獲得相同的黏性末端。③善用“雙酶切”，注意方向性：其優點和作用是：①防止目的基因環化；

②避免目的基因與載體反向連接，即DNA連接酶連接后形成的重組DNA分子上，目的基因和載體啟動子的方向(或描述為“RNA聚合酶的移動方向”)必須是相同的，否則目的基因導入后無法正常轉錄、表達。如圖甲、乙也可選擇PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶。3.(2023·新課標，6)某同學擬用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA連接酶為工具，將目的基因(兩端含相應限制酶的識別序列和切割位點)和質粒進行切割、連接，以構建重組表達載體。限制酶的切割位點如圖所示。下列重組表達載體構建方案合理且效率最高的是（

）A.質粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli

DNA

連接酶連接B.質粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA

連接酶連接C.質粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA連

接酶連接D.質粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli

DNA連接酶連接質粒用酶3切割后得到的是平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能連接。C課堂練習遷移應用自主學習深度學習導入新課酶3切割后得到的是平末端，常用T4DNA連接酶連接。質粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，

用T4DNA連接酶連接后，還能保證目的基因在質粒上的連接方向，此方案最合理且高效。若用酶2和酶4切割質粒和目的基因，會破壞質粒上的抗生素抗性基因，連接形成的基因表達載體缺少標記基因，無法進行后續的篩選。4.(2023·湖北，4改編)用氨芐青霉素抗性基因(AmpR)、四環素抗性基因