ICS67.050CCSX10團體標準T/CIFST020—2024食品用菌種檢驗鼠李糖乳酪桿菌檢驗PMA-qpcR法ExaminationofmicrobialfoodcultureDetectionofLacticaseibacillusrhamnosusPMAqpcRmethod2024-04-01發布2024-04-01實施中國食品科學技術學會發布T/CIFST020—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分:標準化文件的結構和起草規則》的規則起草。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發布機構不承擔識別專利的責任。本文件由中國食品科學技術學會提出并歸口。本文件起草單位:中國食品發酵工業研究院有限公司、國家食品安全風險評估中心、湯臣倍健股份有限公司、山西大學、發酵行業生產力促進中心、丹尼斯克(中國)有限公司、內蒙古伊利實業集團股份有限公司、內蒙古蒙牛乳業(集團)股份有限公司、光明乳業股份有限公司、北京科拓恒通生物技術股份有限公司、微康益生菌(蘇州)股份有限公司。1T/CIFST020—2024食品用菌種檢驗鼠李糖乳酪桿菌檢驗PMA-qPCR法1范圍本文件規定了食品中鼠李糖乳酪桿菌(Lacticaseibacillusrhamnosus)的PMA-qPCR檢驗方法。本文件適用于食品原料和固體飲料中鼠李糖乳酪桿菌的活菌定量檢驗。2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中,注日期的引用文件,僅該日期對應的版本適用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB4789.35—2023食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法GB/T27403—2008實驗室質量控制規范食品分子生物學檢測3術語、定義和縮略語3.1術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1.1實時熒光定量PCRquantitativereal-timepolymerasechainreaction在聚合酶鏈式反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程,對未知模板DNA進行定量分析的方法。3.1.2Ct值cyclethresholdvalue實時熒光定量PCR反應中每個反應管內的熒光信號達到設定閾值時所經歷的循環數。3.2縮略語下列縮略語適用于本文件。CFU:菌落形成單位(colonyformingunits)DNA:脫氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)LED:發光二極管(lightemittingdiode)OD:光密度(opticaldensity)PCR:聚合酶鏈式反應(polymerasechainreaction)PMA:疊氮溴化丙錠(propidiummonoazide)qPCR:實時熒光定量PCR(quantitativereal-timepolymerasechainreaction)ROX:一種熒光染料(carboxy-X-rhodmine)2T/CIFST020—20244原理PMA是一種能與DNA結合的光反應染料,可透過受損細胞膜與菌體DNA發生共價交聯,從而抑制受損菌體DNA的qPCR擴增。樣品經PMA染料處理、DNA提取后,采用鼠李糖乳酪桿菌特異性引物進行qPCR擴增。細胞膜結構完整的活菌菌體DNA在qPCR擴增反應中能夠產生熒光信號。當擴增產物的熒光信號達到設定閾值時,可被實時檢測并生成Ct值,將Ct值代入標準曲線方程中,計算獲得樣品中鼠李糖乳酪桿菌的活菌數量。5儀器設備5.1實時熒光定量PCR儀。5.2高速臺式冷凍離心機:0~20000r/min。5.3酶標儀。5.4恒溫培養箱:36℃±1℃。5.5生物安全柜或超凈工作臺。5.6冰箱:2℃~5℃、-30℃~-20℃。5.7渦旋振蕩儀。5.8LED光解儀:最大功率60W,頻率50Hz~60Hz,LED輸出波長465nm~475nm。5.9珠式樣品研磨器:速度0.8m/s~8m/s。5.10拍打式均質器。5.11高壓滅菌鍋。5.12天平:精度0.01g。5.13微量可調移液器及配套吸頭:0.5μL~10μL、10μL~100μL、100μL~1000μL。6試劑或材料除特別說明外,僅使用分析純或生化試劑,實驗用水應符合GB/T6682中一級水。6.1無菌均質袋。6.2無菌離心管:1.5mL。6.3無菌玻璃珠:粒徑0.1mm。6.4無菌研磨管:2mL。6.5熒光定量PCR8連排管或96孔板。6.696孔細胞培養板。6.7MRS(ManRogosaSharpe)瓊脂培養基:見GB4789.35—2023附錄A中A.2。6.8PMA溶液:濃度20mmol/L。6.9無菌超純水或無菌雙蒸水。6.100.85%無菌生理鹽水:見GB4789.35—2023附錄A中A.8。6.11實時熒光定量PCR混合試劑。6.12ROX參比染料(50×)。子DNA。6.13陽性對照:鼠李糖乳酪桿菌CICC6224T(=ATCC7469T)菌株子DNA。3T/CIFST020—20247檢測步驟7.1樣品制備及前處理7.1.1按照GB4789.35—2023中6.1規定的方法將待檢測樣品制備成1∶10的樣品勻液。7.1.2采用微量移液器,以無菌操作吸取7.1.1制備的1∶10樣品勻液200μL注入96孔細胞培養板中,利用酶標儀測定樣品OD620值。將1∶10樣品勻液稀釋至OD620值為0.3~0.5時,總菌體數量約為108CFU/mL。7.1.3吸取108CFU/mL樣品勻液500μL,注于1.5mL無菌離心管中。7.2樣品PMA處理7.2.1在避光條件下,以無菌操作吸取PMA溶液1.25μL,注于7.1.3的離心管中,顛倒混勻至少10次,制成PMA終濃度為50μmol/L的樣品溶液。7.2.2將樣品溶液置于暗處,室溫孵育5min,每隔1min顛倒混勻一次。7.2.3將樣品溶液置于LED光解儀內,曝光照射15min,曝光結束后于室溫下12000r/min離心15min,棄上清液。7.3樣品DNA提取7.3.1吸取無菌超純水200μL,注于7.2.3的離心管中,反復吹吸使之混勻。7.3.2吸取7.3.1中的全部菌液,注于裝有0.25g無菌玻璃珠的2mL無菌研磨管中。7.3.3將無菌研磨管置于珠式樣品研磨器中,以6m/s破碎速度破碎12s。于室溫下12000r/min離心15min,獲得DNA粗提液。取50μL上清液,注于1.5mL無菌離心管中貯存備用。或采用具有相同效果的基因組DNA提取方法進行DNA提取。7.4實時熒光定量PCR擴增7.4.1實時熒光定量PCR反應體系實時熒光定量PCR反應體系總體積為25μL,其中含:實時熒光定量PCR混合試劑(2×)12.5μL、上下游引物(10μmol/L)各1μL、ROX參比染料0.5μL、DNA模板5μL、無菌超純水5μL。每個反應體系應設置至少3個平行反應。實時熒光定量PCR檢測特異性引物序列分別為:上游引物Lrh-F:5'-TGCTTGCATCTTGATTTAATTTTG-3',下游引物Lrh-R:5'-GGTTCTTGGATYTATGCG-GTATTAG-3',目標基因產物約為122bp。注:反應體系中各試劑的量根據具體情況或不同的反應總體積作適當調整。7.4.2實時熒光定量PCR反應程序實時熒光定量PCR反應程序為:95℃/30s;95℃/10s,55℃/32s(收集熒光信號),72℃/25s,進行40個循環。注:反應程序根據不同型號實時熒光PCR儀和所選PCR擴增體系不同作適當調整。7.4.3實驗對照實驗設立以下對照。子DNA。陽性對照:鼠李糖乳酪桿菌CICC6224T(=ATCC7469T)菌株DNA或擴增片段的陽性克子DNA。陰性對照:非鼠李糖乳酪桿菌DNA。空白對照:無菌超純水。4T/CIFST020—20247.5標準曲線7.5.1通用要求制備標準曲線時需設置至少5個濃度點,且設置的最低濃度點宜盡量接近該擴增目標的定量下限。標準曲線上的每個濃度應設置至少3個平行反應。7.5.2標準曲線的制備桿菌接種于MRS瓊脂培養基中,于36℃±1℃培養48h±2h,獲得純培養物。7.5.2.1將鼠李糖乳酪桿菌CICC桿菌接種于MRS瓊脂培養基中,于36℃±1℃培養48h±2h,獲得純培養物。7.5.2.2用無菌接種環挑取適量菌體于無菌生理鹽水中,充分振蕩混勻。7.5.2.3參考7.1.2,用無菌生理鹽水將7.5.2.2中菌液稀釋至菌體濃度為108CFU/mL。根據GB4789.35—2023中乳桿菌的培養方法,檢測活菌總數(CFU/mL)。7.5.2.4按7.2處理7.5.2.3制備的樣品,按7.3提取樣品基因組DNA,并對DNA溶液進行10倍梯度稀釋。7.5.2.5利用建立的qPCR反應體系和擴增程序,測定每個稀釋度DNA對應的Ct值,根據樣品活菌總數對數值(lgCFU/mL)和擴增Ct值的線性關系繪制標準曲線。標準曲線即以活菌總數的對數值為橫坐標,以Ct值為縱坐標作圖,獲得標準曲線方程。8結果分析與計算8.1質量控制下述指標有一項不符合者,需重新進行實時熒光定量PCR擴增。空白對照:Ct值>30;陰性對照:Ct值>30;陽性對照:Ct值<30。被檢測樣品Ct值應在標準曲線測定范圍內,如不在標準曲線測定范圍內,則需對樣品DNA濃度進行適當調整后重新進行檢測。8.2結果計算當