水產品中河豚毒素的快速檢測膠體金免疫層析法

1范圍

本文件規定了水產品中河豚毒素的膠體金免疫層析快速檢測方法。

本文件適用于河豚魚、織紋螺、蝦等水產品中的河豚毒素成分的快速篩查。

2規范性引用文件

下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期

的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括

所有的修改單）適用于本文件。

GB5009.206—2016《食品安全國家標準水產品中河豚毒素的測定》

GB/T6682實驗室用水規格和試驗方法

3術語和定義

下列術語和定義適用于本文件。

3.1

檢測線testline

即T線，用于判斷是否檢測到了特定抗原或抗體。

3.2

質控線controlline

即C線，用于驗證試劑的有效性。

4原理

本方法采用競爭抑制免疫層析原理。樣品中河豚毒素經提取后與膠體金標記的河豚毒

素特異性抗體結合，抑制抗體和檢測卡中檢測線（T線）上河豚毒素抗原的結合，從而導致

檢測線顏色深淺的變化。通過檢測線與質控線（C線）顏色深淺比較，對樣品中河豚毒素進

行定性判定。

5試劑與材料

除非另有說明，本標準所用試劑均為分析純，實驗用水為GB/T6682規定的二級水。

5.1試劑

5.1.1乙酸（CH3COOH）。

5.1.2對甲苯磺酸（TsOH）。

5.2試劑配制

1

5.2.1樣品提取液：稱取3g對甲苯磺酸粉末（5.1.2），加水充分溶解后，定容至100mL，

混合均勻。

5.2.2乙酸-水溶液（1+99）：量取1mL乙酸（5.1.1），加水定容至100mL，混合均勻。

5.2.3磷酸鹽緩沖液：稱取8gNaCl、0.2gKCl、1.44g無水Na2HPO4和0.24g無水KH2PO4,

溶于800mL水中，最后加水定容至1000mL。

5.3標準物質

表1標準物質信息

中文名稱英文名稱CAS登錄號分子式相對分子質量

河豚毒素Tetrodotoxin4368-28-9C11H17O8N3319

注：經國家認證并授予標準物質證書的標準物質。

5.4標準溶液配制

5.4.1河豚毒素標準儲備液（1mg/mL）：精密稱取河豚毒素10.0mg，精確至0.1mg，用

乙酸-水溶液（5.2.2）溶解，轉移至10mL容量瓶，再用乙酸水溶液（5.2.2）定容至刻度，

配制成濃度為1mg/mL的標準儲備液。?20℃避光保存，有效期1年。

5.4.2河豚毒素標準中間液（50μg/mL）：移取河豚毒素標準儲備液（5.3.1）500μL置于

10mL容量瓶中，用磷酸鹽緩沖液（5.2.3）稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為50μg/mL的

標準中間液。?20℃避光保存，有效期3個月。

5.4.3河豚毒素標準工作液（1μg/mL）：移取河豚毒素標準中間液（5.3.2）200μL置于10

mL容量瓶中，用磷酸鹽緩沖液（5.2.3）稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為1μg/mL的標準

工作液。?20℃避光保存，有效期3個月。

注：為避免毒素的危害,應戴手套進行操作。移液器吸頭等用過的器材、廢棄的提取液

等應在氫氧化鈉溶液(1mol/L)中浸泡1h以上,以使毒素分解。

5.5空白試樣

經參比方法（GB5009.206—2016）檢測不含河豚毒素的水產品。

5.6材料

河豚毒素膠體金免疫層析試劑盒：一般包含膠體金試紙條、金標微孔及配套試劑。

儲存條件：室溫、密封、避光、通風干燥保存，保質期12個月。

6儀器與設備

6.1天平：感量為0.1mg和0.01g。

6.2組織攪碎機。

6.3渦旋混合器。

6.4振蕩器。

6.5移液器：200μL，1000μL，5mL。

6.6離心機：轉速≥4000r/min。

6.7膠體金讀數儀（可選）

2

7分析步驟

7.1試樣制備

河豚去皮去內臟，將肌肉部分用水清洗魚體表面的污物,濾紙吸干魚體表面的水分后用

剪刀將魚體分解成肌肉、肝臟、皮膚和性腺(精巢或卵巢)等部分,各部分組織分別用水洗去

血污,濾紙吸干表面的水分后將各組織剪碎,充分均質；去除織紋螺體表面的泥漿及污物，打

開螺殼，將其內容物剪碎，充分均質；蝦去頭和殼后進行取樣，充分均質。裝入清潔容器內,

并標明標記。

7.2試樣提取

稱取2g（精確到0.1g）勻漿試樣于15mL離心管中，加入2mL磷酸鹽緩沖液（5.2.3），

充分渦旋振蕩，4000r/min離心2min。取200μL上清液于5mL離心管中，加入400μL磷酸鹽

緩沖液（5.2.3），渦旋混合30s，作為待測液。

7.3試樣測定

取100μL樣品待測液加入金標微孔中，充分混勻后室溫孵育3min，隨后將微孔內的所

有溶液吸出，加到試紙條的樣品墊上，反應5min后觀察結果。

注：測定步驟建議按照試劑盒說明書。若無金標微孔，可直接取100μL待測液滴加至試

紙條樣品孔上。

7.4質量控制

7.4.1每批樣品應同時進行空白試驗和質控試驗。

7.4.1.1空白試驗

準確吸取液體或稱取固體空白試樣，按照7.1、7.2和7.3步驟與試樣同法操作。

7.4.1.2質控試驗

準確稱取空白試樣2g（精確到0.1g）于15mL離心管中，加入20μL標準工作液（5.4.3），

使河豚毒素標準物質濃度為10μg/kg，按照7.1、7.2和7.3步驟與試樣同法操作。

7.4.2空白試驗測定結果應為陰性，加標質控試驗測定結果應為陽性。

8性能指標

8.1性能指標計算方法按照附錄A執行。

8.2檢出限：10μg/kg

8.3靈敏度：≥99%。

8.4假陰性率：≤1%。

8.5假陽性率：≤3%。

8.6特異性；≥97%。

9結果判定

3

通過對比C線和T線的顏色深淺進行結果判定，目視判定示意圖見圖1或2。結果判定也

可根據產品說明書進行。

9.1無效：C線不顯色，表明不正確操作或試紙條/檢測卡無效。

9.2陰性結果：C線顯色，T線顏色比C線顏色深或T線顏色與C線顏色相當，均表示樣

品中不含待測組分或含量低于方法檢測限，判為陰性。

9.3陽性結果：C線線顯色，T線顏色比C線顏色明顯淺或T線不顯色，均表示樣品中待

測組分含量高于方法檢測限，判為陽性。

注：T線為檢測線，C線為質控線。

圖1試紙條目視判定示意圖

注：T線為檢測線，C線為質控線。

圖2檢測卡目視判定示意圖

10確證

當檢測結果為陽性時，采用GB5009.206—2016《食品安全國家標準水產品中河豚毒素

的測定》中第三法液相色譜-熒光檢測法進行確證。

11其他

4

本方法所述試劑、試劑盒信息及操作步驟是為給方法使用者提供方便，在使用本方法時

不做限定。方法使用者在使用替代試劑、試劑盒或操作步驟前，須對其進行考察，應滿足本

方法規定的各項性能指標。

A

A

附錄A

（規范性）

快速檢測方法性能指標計算表

快速檢測方法性能指標計算方法見表A.1。

表A.1性能指標計算方法

檢測結果b

樣品情況"總數

陽性陰性

陽性N11N12N1.=N11+N12

陰性N21N22N2.=N21+N22

總數N.1=N11+N12N.2=N21+N22N=N1.+N2.或N.1+N.2

X2=(|N12-N21|-1)2/(N12+N21)，

顯著性差異(X2)

自由度（df)=1

靈敏度（p+，％)p+=N11/N1.

假陰性率（pf-，%)pf-=N12/N1.=100-靈敏度

假陽性率（pf+，%)pf+=N21/N2.=100-特異性

相對準確度，%c（N11+N22)/(N1.+N2.)

a由參比方法檢驗得到的結果或者樣品中實際的公議值結果；

b由待確認方法檢驗得到的結果。靈敏度的計算使用確認后的結果。

N任何特定單元的結果數，第一個下標指行，第二個下標指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示

所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N12表示第一行，第二列。

C為方法的檢測結果相對準確性的結果，與一致性分析和濃度檢測趨勢情況綜合評價。

5

ICS67.080.10

CCSB50

TGAIA

廣東省分析測試協會團體標準

T/GAIAxxx—xxxx

水產品中河豚毒素的快速檢測膠體金免疫

層析法

Rapiddetectionoftetrodotoxininaquaticproducts-Colloidalgold

immunochromatographicassay

(征求意見稿)

xxxx-xx-xx發布xxxx-xx-xx實施

發布

廣東省分析測試協會

水產品中河豚毒素的快速檢測膠體金免疫層析法

1范圍

本文件規定了水產品中河豚毒素的膠體金免疫層析快速檢測方法。

本文件適用于河豚魚、織紋螺、蝦等水產品中的河豚毒素成分的快速篩查。

2規范性引用文件

下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期

的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括

所有的修改單）適用于本文件。

GB5009.206—2016《食品安全國家標準水產品中河豚毒素的測定》

GB/T6682實驗室用水規格和試驗方法

3術語和定義

下列術語和定義適用于本文件。

3.1

檢測線testline

即T線，用于判斷是否檢測到了特定抗原或抗體。

3.2

質控線controlline

即C線，用于驗證試劑的有效性。

4原理

本方法采用競爭抑制免疫層析原理。樣品中河豚毒素經提取后與膠體金標記的河豚毒

素特異性抗體結合，抑制抗體和檢測卡中檢測線（T線）上河豚毒素抗原的結合，從而導致

檢測線顏色深淺的變化。通過檢測線與質控線（C線）顏色深淺比較，對樣品中河豚毒素進

行定性判定。

5試劑與材料

除非另有說明，本標準所用試劑均為分析純，實驗用水為GB/T6682規定的二級水。

5.1試劑

5.1.1乙酸（CH3COOH）。

5.1.2對甲苯磺酸（TsOH）。

5.2試劑配制

1

5.2.1樣品提取液：稱取3g對甲苯磺酸粉末（5.1.2），加水充分溶解后，定容至100mL，

混合均勻。

5.2.2乙酸-水溶液（1+99）：量取1mL乙酸（5.1.1），加水定容至100mL，混合均勻。

5.2.3磷酸鹽緩沖液：稱取8gNaCl、0.2gKCl、1.44g無水Na2HPO4和0.24g無水KH2PO4,

溶于800mL水中，最后加水定容至1000mL。

5.3標準物質

表1標準物質信息

中文名稱英文名稱CAS登錄號分子式相對分子質量

河豚毒素Tetrodotoxin4368-28-9C11H17O8N3319

注：經國家認證并授予標準物質證書的標準物質。

5.4標準溶液配制

5.4.1河豚毒素標準儲備液（1mg/mL）：精密稱取河豚毒素10.0mg，精確至0.1mg，用

乙酸-水溶液（5.2.2）溶解，轉移至10mL容量瓶，再用乙酸水溶液（5.2.2）定容至刻度