團體標準Part4：parasitologicalr中國動物園協會發布I 1 1 1 1 1 2 2 2 2 3 5 5 5 7 8 9 本文件起草單位：北京動物園管理處、杭州動物園（杭州少年兒童公園杭州西湖風景名勝區動物參考了GB/T18448.1、GB/T18448.5、GB/T18441動物園獸醫化驗室常規檢測操作指南第4部分：寄生蟲常規檢測本文件適用于動物園、野生動物飼養場等機構開展動物寄生蟲常規檢SN/T3592實驗室化學藥品和樣品廢棄物處T/CAZG018動物園動物樣本采集和保存操作CJJ/T240和T/CAZG016.1中生蟲和其他寄生蟲進行的形態學鑒別、蟲卵計數注：其他寄生蟲指寄生在動物尿路、鼻腔、氣管、眼部、耳道等其他部位的寄生蟲，含寄生在肺臟、肝臟、膽管、4.1準確性24.2.2化學品安全防護按GB18218規定辨別危險化學品危險源。檢5.1通則5.1.1寄生蟲常規檢測包括多個檢測項目的多種檢測方法，每種方法需要的器材、試劑和標本不盡相5.1.2一份標本可以用于多個檢測項目。增加標本采集、檢測次數可有效提高寄生蟲檢出率。有些不5.2器材和試劑5.2.1器材）：普通低速離心機及離心管。常用器皿：三角燒瓶、錐形量杯、量筒、容量瓶、試劑瓶、燒杯、玻皿、研缽等。）：30載玻片、蓋玻片、推玻片(可將邊緣光滑載玻片一端的兩個角分別用鑷4計數器（加法計數器）、計時器。5放大鏡。5.2.2試劑），飽和鹽水：沸水中加入氯化鈉，不斷攪動至不再溶解，放置至室溫后有結晶析出時的溶液。％～瑞氏-姬姆薩染色液：防止進水，密封保存；配套試劑為磷酸鹽緩沖液。香柏油：密封陰涼避光保存；作為體表寄0無水甲醇：陰涼、通風處密封保1二甲苯：陰涼、通風處密封保存，遠離火源、熱源。5.3標本可多至50g；動物服驅蟲藥后檢查有無寄生蟲e）標本記錄清楚，包括動物種類、動物個體單位編號、呼名或識別號、性別、標本編號、采集g）不能立即檢測的標本，密封后保貯于2℃~8℃,避免卵的孵化。若標本需保存時間較長，血液寄生蟲常規檢測所用標本為被檢動物血液或臟器組織，準備時注意4b)若不能在采血時制作血涂片，則用保存的抗凝血皮膚螨類檢測所用標本是被檢動物皮屑、被毛和毛囊等，準備標本時注意以下事項。層皮屑，若有膿瘡則擠破膿瘡取其內容物；若采集部位毛長，宜先將毛剪短至1cm左右，采），c)對于難以通過揉壓蓋玻片散開的硬結痂標本，不宜用香柏油作透明介質，而是用2.5mol/L氫提高檢出率，并可使活蟲能夠維持較長時間的活力；不能立即檢測的標本，宜在2℃~8℃保蚤、虱、蜱等體形較大的體表寄生蟲檢測標本：可用肉眼直接察看動物的皮膚、被毛等部位被咬部位，待蜱麻醉后取下，以防將蜱的頭部留在皮引起皮下組織結節的寄生蟲檢測標本：包括用手指壓迫結節擠壓出的血液、注射器穿刺抽取引起皮下囊腫的寄生蟲檢測標本：包括動物患部皮膚破潰或囊腫破裂后流出的液體、用注射寄生于動物尿路、鼻腔、氣管、眼部、a)尿液標本：用1000mL大燒杯c)標本宜新鮮、無污染、2h內完成檢測；不能立即檢測的標本可在2℃~8℃保存1d；標本記寄生在肺臟、肝臟、膽管、胰臟等部位但蟲卵或蟲體可以在糞便中檢出的寄生蟲，檢測標本56.1.1與寄生蟲常規檢測方法有關達到確診目的，必要時可借助其他非常規檢測方法進行寄生蟲鑒別6.1.3標本送檢人員填寫檢驗申請單，其格式見T/CAZG016.1。檢測人員宜及時完成檢測，正確分析判定，檢測結束后填寫檢驗報告單，其格式見T/CAZG016.1。6.1.4實驗室對檢測數據進行記錄，留存圖直接涂片法用于檢測蠕蟲卵及其幼蟲、球蟲卵囊、結腸小袋纖毛蟲滋養體及其包囊、阿米巴e)結果報告：宜用陰性（-）和陽性（+）表示檢測結果，寫明所用方法，陽性結果時寫明檢出寄生蟲或卵的種類，可用每個視野中發現的目標數量表示感染的嚴重程度，亦可用其他形式描述感染情況。特殊標本的處理：對一些野生動物糞便標本的處理方法宜適當改進，如大熊貓糞便常以大塊飽和鹽水漂浮法適用于檢測線蟲卵、絳蟲卵和球蟲卵囊，按以下步驟進a)用鑷子從標本不同部位取一定量的糞便放入大試管或燒杯；糞便量與飽和鹽水的比例宜為6c)靜置20min，用載玻片接觸液面，然后垂直向上提起，迅速翻轉，加蓋玻片；亦可先用蓋玻幾次，直到上層液澄清為止，最后棄上層液，c)1500r/min離心3min～5min，然后棄上層液，沉渣再加水、攪拌、離心，重復沉淀3離心沉淀法將蟲卵沉下去，取沉渣涂片鏡檢，以獲得斯陶爾氏法（Stoll′s斯陶爾氏法適用于大部分蟲卵、卵囊的計數，按以下步驟進7研缽，加入約10mL氫氧化鈉溶液進行研磨、攪拌，同時避免研杵與研缽之間磨擦破壞蟲卵，待糞便麥克馬斯特氏法（McMaster′s麥克馬斯特氏法適用于可被飽和鹽水漂浮的各種蟲卵、卵囊的計數，按以下步驟進d)顯微鏡計數：不同蟲卵分別計數，計數兩個f)結果報告：可用陰性（-）和陽性（+）表示，陽性結果時寫明檢出寄生蟲的種類，亦可用其他形式描述感染情況。水各1滴，置于載玻片上混勻，加蓋玻片鏡檢。為提高檢出率，可制作厚血膜涂片，即滴28暗一些，便于觀察活動的蟲體。結果報告可用陰性（-沿推玻片觸端散成一條均勻的粗線后，使推玻片與載玻片夾角保持在30o~45o,均勻地推向載外傷時的出血，取一小滴即可制作涂血片。宜連續制作血涂片2張以上備用。亦可制作厚血膜涂片，按照6.3.1a）涂厚血膜，風干，浸入水中，血膜成乳白色時取出，再干燥備b)組織印片制作：某些寄生蟲（如禽類血液體，再觸及載玻片，制成印片，手持載玻片在空氣中揮動，使組織薄膜迅速干燥。c)固定：在血涂片或組織印片上滴加無水甲醇數滴，固定1min～3min，待甲醇完全揮發、干燥。d)染色：按每1.5mL磷酸鹽緩沖液（或蒸餾水）中，加入5滴～10滴瑞氏-姬姆薩染色液，配成應用液，蓋滿血涂片或組織印片。染色10min～20min；用清水沖去染色液，沖洗時避免傾斜載玻片，將載玻片平放，用流水緩緩沖洗掉染料沉淀物。沖洗后晾干。可通過預染試驗確定緩沖液和染色液的比例以及染色時長。e)鏡檢：通過觀察寄生蟲的形態結構和染色特征進行識別；用顯微鏡觀察時，先從低倍鏡開始觀察，接著滴加香柏油1滴，用油鏡查找寄生蟲，觀察細微特征。必要時可進行寄生蟲計數：根據寄生蟲的多少，選擇有代表性的視野若干個，計數視野內寄生蟲、紅細胞、白細胞或被感染細胞的數量，避免重復或遺漏，計算平均每個視野中的寄生蟲數，或者計算寄生蟲與某種血細胞之間的比例，如計算被血孢子蟲感染的紅細胞與正常紅細胞之間的比例。鏡檢后擦試油鏡頭。若有必要，可將血涂片或組織印片用二甲苯和擦鏡紙擦拭干凈后保存。f)結果報告：宜用陰性（-）和陽性（+）表示；陽性結果時寫明檢出寄生蟲的種類，可用每個視野中的寄生蟲數或寄生蟲與細胞之間的比例表示感染的嚴重程度，亦可用其他方式描述感染情況。9c)在低倍鏡下觀察，當視野透明時查找蟲體或蟲卵，若發現并d)換高倍鏡觀察蟲體或蟲卵的細微結構，必要時測量大小，并拍照或錄e)結果報告：宜用陰性（-）和陽性（+）表示檢測結果，陽性結果時寫明檢出寄生蟲的種類，可用每個視野中的寄生蟲數表示感染的嚴重程度。氫氧化鈉溶液的透明效果比香柏油差，主要用于硬結痂等需要軟化的引起皮下組織結節和囊腫寄生蟲的皮膚上的小孔內擠出幼蟲，用肉眼觀察或意動物易感染部位，如耳根、頸后、眼周、背可用梳子梳理動物被毛，以便觀察。找到的寄生蟲可收集起來，必要時用顯微鏡觀察細微——尿路寄生蟲檢測：將尿液倒入錐形量杯中靜置30min，傾去上層尿液，保留下層有沉淀物的行離心沉淀，傾去上層尿液，吸取沉淀物置于載玻片上，加檢測原理A.1消化道寄生蟲檢測原理A.1.1直接涂片法：動物糞便中的蠕蟲卵及其幼蟲、球蟲卵囊、結腸小袋纖毛蟲滋養體及其包囊、阿米巴滋養體以及活動的鞭毛蟲等，可用糞便涂片，在顯微鏡下直蟲體細胞質呈淡黃色，核較透明，蟲體內含有的肝糖呈暗褐色，可A.1.3飽和鹽水漂浮法：動物糞便中的線蟲卵、絳蟲卵和球蟲卵囊等比重小于飽和鹽水的寄生蟲病原體，可用飽和鹽水漂浮，將較多糞便中的病原體集中漂浮于液面，以提高A.1.5蟲卵計數：按照一定比例，將糞便跟配制好的溶液充分混勻成混懸液，在顯微鏡下計數一定體積混懸液中的蟲卵總數，再經換算求出每克糞便中的蟲卵數A.1.6蟲體檢查：體形較大的消化道寄生蟲，如蛔蟲、蟯蟲、絳蟲節片等蟲體可直接用肉眼觀察