基于SeqFD技術的物種鑒定技術規范2024-09-12發布2024-10-01實施I Ⅱ 1范圍 1 13術語和定義 14縮略語 15技術原理 16試劑或材料 26.1DNA提取試劑盒 26.2采樣 26.3PCR試劑 2 27儀器設備 2 38.1操作要求 38.2實驗條件 3 3 38.5SeqFD測序文庫構建 3 3 3 4 4 49結果分析 49.1結果計算 49.2結果判定 4附錄A(規范性)DNA提取和文庫構建實驗步驟 5A.1實驗步驟 5附錄B(資料性)引物序列 6附錄C(資料性)PCR擴增體系 8附錄D(資料性)PCR擴增程序 9 本文件按照GB/T1.1-2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定本文件由深圳市生命科技產學研資聯盟提出并歸口。本文件起草單位：海南大學三亞南繁研究院、深圳華大生命科學研究院、深圳華大智造科技股份有限公司、海南省種業實驗室、海南大學三亞研究院、武漢華大生命科學研究、三亞海古紀生物科技有限公司、深圳市生命科技產學研資聯盟。本文件主要起草人：夏志強、李小強、周紅梅、李啟沅、吳靜靜、華聰、鄒枚伶、魏曉鋒、游麗金王偉文、李濤、余樂俊、夏勉、黃河飛、孫建波、何沛欣、王博、王逸叢、謝偉、武慶超、駱順、李陶本文件的發布機構提請注意，聲明符合本文件時，可能涉及到條款8.4和條款8.5中SeqFD技術和文庫構建相關的專利的使用。本文件的發布機構對于該專利的真實性、有效性和范圍無任何立場。該專利特有人已向本文件的發布機構承諾，他愿意同任何申請人在合理且無歧視的條款和條件下，就專利授權許可進行談判。該專利持有人的聲明已在本文件的發布機構備案。相關信息可以通過以下聯專利持有人姓名：夏志強、鄒枚伶、王文泉。地址：海南省三亞市崖州區海南大學三亞南繁研究院。請注意除上述專利外，本文件的某些內容仍可能涉及專利。本文件的發布機構不承擔識別專利的責1基于SeqFD技術的物種鑒定技術規范本文件規定了基于SeqFD測序技術物種鑒定的原理、試劑或材料、儀器設備、實驗步驟、結果分析.本文件適用于與農業相關的植物和動物樣本，如水稻、木薯、甘蔗、馬鈴薯、豬和牛等物種鑒定。下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款.其中，注日期的引用文件僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T37874核酸提取純化方法評價通則GB/T38551植物品種鑒定MNP標記法GB/T38570植物轉基因成分測定目標序列測序法GB/T42751—2023信息技術生物特征識別高通量測序基因分型系統規范GB/T42751—2023界定的以及下列術語和定義適用于本文件。能夠一次并行對大量核酸分子進行平行序列測定的技術，通常一次測序反應能產生不低于100M堿基對的測序數據。指在DNA序列中，某一位置上可以是多種可能的堿基之一，用于設計能夠結合多個相似序列的引物。這種設計增加了引物的通用性，使其能夠識別含有序列變異的多個目標。SeqFD是一種極致簡化、全基因組覆蓋、高通量的DNA測序文庫制備和基因分型方法。下列縮略語適用于本文件.BLAST:局部相似性基本查詢工具(BasicLocalAlignmentSearchTool)DNA:脫氧核糖核酸(DeoxyriboNucleicAcid)NCBI:美國國立生物技術信息中心(NationalCenterForBiotechnologyInformation)PCR:聚合酶鏈式反應(PolymeraseChainReaction)RNA:核糖核酸(RibonucleicAcid)設計含有簡并堿基的引物，構建樣本基因組測序文庫，利用多重聚合酶鏈式反應(PCR)進行文庫擴增和高通量測序，分析測序數據，獲得比對結果和鑒定結論。2通過使用含有簡并堿基的引物，構建樣本基因組測序文庫，進行高通量測序。引物的核心部分由4個穩定不變的堿基構成。另外，為了增加引物的靈活性和適應性，設計中還包括了3個可變化的堿基 (NWNNYN的組合),形成了所謂的彈性序列。這種設計使得引物能夠適應并結合到基因組中的多種不同序列，從而增加了測序的廣度和深度。這些堿基構成的引物能夠結合基因組的內含子、編碼序列、NT數據庫中的序列進行快速比對，找出潛在的匹配區域，然后計算這些區域的相似性得分，返回評分最高的匹配序列。統計匹配序列歸屬的物種，并通過本文件的6試劑或材料6.2采樣6.3PCR試劑6.4引物6.4.2引物和樣本對應關系宜根據樣本數量和實驗批次數選擇。若只進行1批測序，則物種來源不同的待測樣本份數不得大于96份，每份樣本對應不同的引物編號；若選擇多批測序，則物種來源不同的本進行至少3次技術重復。——高通量測序儀(測序300nt~700nt長度片段);——離心機(TGL-20M,轉速2000r/min);38.1.1樣品準備、DNA提取、PCR擴增應按照條款6.1、6.2和6.3要求準備材料且規范化儀器操作。8.2.2實驗過程中應戴好口罩、穿戴實驗服、橡膠手套，謹防吸入口鼻同時也避免外源DNA的污染。8.3.2樣本宜為植物較為幼嫩且新鮮的葉、根、莖等器官或組織，可為果實或種子；或是新鮮的動物文庫構建主要包括DNA濃度均一化、96孔板加樣、離心、PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳等5個步驟測序數據分析環境的搭建主要分為兩部分：在NCBI下載BLAST工具和安裝，下載NT庫后使用注1:NCBI網址為/blast/db/.注2:BLAST工具下載的網站為https//blast,版本號：2.13.0.注3:NT庫下載地址為/blast/db/FASTAnt.gz注：fastp軟件版本號為0.20.應根據要求進行測序數據質量控制，要求具體見表1.類別30%～50%之間重復率°4表1測序數據質量要求(續)類別Q30值是指測序數據中堿基錯誤率在千分之一以下的比GC含量是指測序數據中G和C堿基的比例。重復率是是指測序數據中重復的堿基對的比例。8.9BLAST比對5DNA提取和文庫構建實驗步驟A.1實驗步驟A.1.1.2實驗過程中使用到的PCR板等儀器應滅菌后再使用。A.1.2實驗條件A.1.2.1實驗室保持干凈整潔，避免污染A.1.2.2實驗過程中戴好口罩、穿戴實驗服、橡膠手套，謹防吸入口鼻同時也避免外源DNA的污染。A.1.3取樣A.1.3.2取材后立即液氮速凍，保存于液氮或超低溫冰箱中。A.1.3.3若為-80℃冰箱保存的樣品，研磨前應避免樣品化凍變軟，研磨過程中也保持低溫。A.1.4DNA提取DNA提取主要包括細胞裂解、細胞沉淀、洗滌、純水/TE溶液純化收集等4個步驟。DNA提取應a)將純化收集后的樣品DNA進行濃度均一化，濃度建議控制在100ng/μL左右；b)將DNA、引物(引物序列見附錄B)、混合液加入96孔板中(擴增體系見附錄C),實驗操作過程需全程在低溫環境(0℃~20℃)下進行；c)加樣結束后對96孔板放進行離心，將離心后的樣品放入PCR儀中進行擴增(擴增程序見附錄d)對擴增后的PCR產物進行凝膠電泳檢測，電壓50V,時間設置40min;將300bp~700bp的時間保存應在-20℃保存。6(資料性)引物序列引物序列見表B.1。表B.1引物序列序號引物(從5′端到3′端；Forward-Reverse)1TAGCTCGACACTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACG2TAGCTCTGGAATCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACG3TAGCTCGAACAACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACG4TAGCTCGGCATGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACG5TAGCTCCCGCTACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACG6TAGCTCGACATACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACG7TAGCTCCGACAGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACG8TAGCTCTGGTGACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACG9TAGCTCTTAGCGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCAGGTGCCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCAAAGACCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTCTTCACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCCGAAGGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCAGCTCCCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTGGTAGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGGTCGTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGTTAACCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGCCACACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGGTTTACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTTTCCGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCACTTCGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGCGTTTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCAGGATTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGCAATGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGAGCGACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCCACCCTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCCAGATTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTTCCATCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCCCAGCTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCAACCGCCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCATGGTACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGAGATCCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCCACCAACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTGATCGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTCCCAGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTTTGAGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCCGGGTACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGTCTAACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCAATCTGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTACGTTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTGAACTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTCACTCCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTAAGTCCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGATGACCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACG7表B.1引物序列(續)序號引物(從5'端到3′端；Forward-Reverse)TAGCTCTCGTTCCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCAACCTTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCACAATCCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGTACAGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGGCTTCCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCAGCATACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTGACGTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCCACCTGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTTGCCACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCATTACGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGAGTGTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCAAACGGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTATCGACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCCTGCTCCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCAGGTATCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGGAGTACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTACAGGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCAGCTTTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCCATCCACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCCTACCGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGCATTCCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCACTCCCCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCCCCGTACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCAGCCTCCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTCTACCCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCACACCTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCCTCAACCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCCAGAGGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGGATCCCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGGTAGGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTCAGTTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCCTAGATCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGAACTTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGCTGGTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCAGAATGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCAGCAGGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGTGGGTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCAGTCATCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTCCGCACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCATCATCCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGGGTCACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCACCTTACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTAAACGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCAAGGGTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTTTCGTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCCAGTCCCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCATATCCCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGTCTCCCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTCACATCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCCCGTATCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTAGGTACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCAGACTTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACG8(資料性)參加PCR反應的物質脫氧核苷三磷酸(dNTP)引物條形碼(0.01mol/L)9PCR擴增程序表D.1PCR擴增程序時間15延伸延伸延伸1/[1]Margulies,M,Egholm,M,Altman,W.etal.Genopicolitrereactors.Nature