水體中抗生素原位采樣分析技術規程—薄膜擴散梯度（DGT）法TechnicalRegulationsforInSituS—DiffusiveGradientsinThinFilms(DIT/LNEMA019—2024前言 II 12規范性引用文件 3術語和定義 4方法原理 5材料及試劑 6儀器和設備 48水體中抗生素的測定步驟 9結果計算 10精密度和準確度 8T/LNEMA019—2024本標準按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定起草。請注意本標準的某些內容可能涉及專利。本文件的發布機構不承擔識別專利的責任。本標準由遼寧省大連水文局提出。本標準由遼寧省環境監測協會歸口。本標準起草單位：遼寧省大連水文局、大連理工大學、大連市生態環境事務服務中心、大連計量檢驗檢測研究院有限公司、遼寧省生態環境事務服務中心、遼寧省水資源管理和生態環保產業集團、遼寧省生態環境廳、遼寧省生態環境保護科技中心、遼寧省生態環境監測中心、遼寧省撫順水文局、遼寧省遼陽生態環境監測中心、蘇州科技大學等。本標準主要起草人：孫大明、譚峰、趙輝、王主華、王丹陽、馬芮、王陽、李崇、劉首正、原暉、邸俊強、夏春龍、唐賀、趙璐璐、白玉花、汪琛棋、屈興勝、柴浩、徐明晗、郭一冰、趙云、董淑玲、楊瑞豐、武暕、張子伯、趙德君。1T/LNEMA019—2024水體中抗生素原位采樣分析技術規程—薄膜擴散梯度（DGT）法本標準規定了水體中抗生素含量的薄膜梯度擴散（DGT）法測定流程。本標準適用于地表水、地下水、海水、工業廢水和生活污水中的氟喹諾酮類、磺胺增效劑甲氧芐基嘧啶以及磺胺類抗生素的原位采樣分析。2規范性引用文件本標準引用下列文件或其中的條款。凡是注明日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本標準。凡是未注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本標準。HJ495-2009水質采樣方案設計技術規定HJ494-2009水質采樣技術指導GB/T14581-1993水質湖泊和水庫采樣技術指導GB3838-2002地表水環境質量標準GB5084-2021農田灌溉水質標準GB8978-1996污水綜合排放標準GB5749-2022生活飲用水衛生標準、GB3097-1997海水水質標準HY/T147.1-2013海洋監測技術規程第1部分：海水DB22/T2838-2017生活飲用水及水源水中10中抗生素的檢驗方法超高效液相色譜-質譜/質譜法DB21/T3286-2020水質5種磺胺類抗生素的測定固相萃取高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜法DB32/T3771-2020漁業養殖用水中喹諾酮類抗生素測定液相色譜-串聯質譜法DB37/T3738-2019水質磺胺類、喹諾酮類和大環內酯類抗生素的測定固相萃取/液相色譜-三重四極桿質譜法DB65/T3951-2016水質多種藥物殘留量的測定液相色譜串聯譜法3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1抗生素antibiotics本標準中的抗生素主要指氟喹諾酮類抗生素、磺胺類抗生素以及磺胺增效劑甲氧芐基嘧啶等有機污染物。3.2原位測定insitumeasurement指在不擾動樣本原有狀態的前提下，獲得關于其化學、物理、生物性質的數據，保證待測物質的形態和濃度不發生變化。3.3薄膜擴散梯度diffusivegradientinthinfilms一種新型被動采樣技術，標準的DGT裝置由結合相，擴散相，濾膜以及固定這三層膜結構的塑料外套組成。利用具有一定厚度的擴散相凝膠將能夠與目標物發生不可逆結合的結合相和待測環境隔開，2T/LNEMA019—2024待測物擴散通過擴散相凝膠后被結合相吸附。在材料的有效吸附容量內，目標物的富集量與富集時間有關，從而可以通過測定結合相上目標物的質量確定外界環境中待測目標物的濃度。3.4DGT結合相DGTbindinggelDGT結合相是指DGT方法中用于吸附待測物的薄膜，組裝到DGT結構的最內層，常用的結合相材料為聚合物樹脂、商業SPE柱填料和新型吸附材料。3.5DGT擴散相DGTdiffusivegelDGT的擴散相是指為待測分子提供擴散通道的薄膜，組裝在DGT結構的中間層，是定量計算的基礎。常用的擴散相材料有包括瓊脂糖交聯聚丙烯酰胺凝膠(APA)和瓊脂糖凝膠。3.6DGT濾膜filtermembraneDGT裝置的濾膜一般指內部孔徑為0.45μm的濾膜，常用的DGT濾膜有聚偏氟乙烯膜(PVDF)、硝酸纖維素膜(CN)、醋酸纖維素膜和親水性聚醚砜濾膜(PES)。3.7擴散系數diffusivecoefficient擴散系數是指目標離子在單位時間每單位濃度梯度的條件下、以擴散的方式垂向通過單位面積擴散相的質量或摩爾數。它是一個衡量某種物質分子通過隨機運動在另一種物質中傳播速度的指標。4方法原理DGT技術是以Fick第一擴散定律為理論基礎，整個裝置由結合相、擴散相和濾膜以及固定這三層膜的上下兩部分的塑料外套（AES樹脂）組成（圖1）。塑料蓋子可以卡在底座上，使底座、吸附膜、擴散膜、濾膜無縫接觸，蓋子上有直徑為2cm的窗口，待測物質通過窗口擴散進入內部凝膠。圖1DGT裝置以及采樣原理圖其中，濾膜主要用來避免外界顆粒物進入裝置內部，擴散相提供待測分子的擴散通道，而結合相對待測物質具有吸附作用，可以根據不同的分析物選擇不同的結合相材料。外部分析物通過濾膜以及擴散相，最終固定在結合相上。通過測量結合相上吸附目標物的質量（M）可以實現對外界環境濃度（Cb）的定量。由于擴散相的存在，使得在裝置表面擴散紊流層占總體擴散通路比率大大減小，在流動良好的水體，紊流層厚度(δ)可以忽略不計。在靜態水中，也可以使用不同厚度的擴散相裝置進行準確定量紊流層厚度。另外，參數擴散系數是每個目標物特有的參數，可以在實驗室條件下單獨測定得到，此參數受實際環境條件影響很小，可以直接應用于實際采樣過程中的計算，無需額外校正，相較于其他被動采樣器，定量準確性大大提高。3T/LNEMA019—2024此外，在DGT實際采樣過程中，復雜、多變的環境介質往往會對結合相表面電荷狀況、目標物的狀態等造成影響，但實驗表明當pH在4~9的變化范圍內、離子強度0.001~0.75mol/L的范圍內、溶解性有機質（DOM）介于0~20mg/L的范圍內時，DGT裝置的采樣性能幾乎不受外界環境干擾。而在自然環境中，不同水體的pH、離子強度和溶解性有機質（DOM）濃度普遍在5~8.5，0.01-0.5mol/L和1~20mg/L范圍內，因此，實際采樣時復雜的外界環境條件DGT采樣的效果沒有明顯的影響。5材料及試劑所使用的試劑除了另有說明外，均為符合國家標準的分析純，實驗用水為新鮮制備的去離子水或蒸餾水。5.1材料DGT裝置、氮氣、DGT有機玻璃投放器、浮標、手持式GPS儀、溫度計、塑封袋、10mL離心管等。5.2試劑5.2.1純水實驗室用水應為一級水、應符合GB/T6682相關要求。5.2.2乙腈（CH3CN）液相色譜純。5.2.3甲醇（CH3OH）液相色譜純5.2.4抗生素標準儲備液，ρ=1000mg/L準確稱取10.0mg抗生素標準樣品，用甲醇（5.2.3）溶解并定容到10mL的棕色容量瓶中，配制成1000mg/L抗生素的標準儲備溶液，制備的標準貯備液于－20℃以下冷凍、密封、避光保存，保存期5.2.5抗生素標準使用液，ρ=10.0mg/L取抗生素標準貯備溶液（5.2.4）1.00mL于100.0mL容量瓶中，甲醇定容，混勻，配制成標準使用溶液。于－20℃以下避光保存，保存期為90d。5.2.6抗生素內標儲備液，ρ=100.0mg/L內標物推薦13C6-磺胺吡啶和環丙沙星-d8，也可使用其他性質相近同位素物質。用甲醇（5.2.3）作為溶劑配制，制備的標準貯備液于-20℃以下冷凍、密封、避光保存，保存期為180d。5.2.7抗生素內標使用液，ρ=1.0mg/L移取適量內標貯備液（5.2.6用甲醇（5.2.3）稀釋，于-20℃以下避光保存，保存期為90d。6儀器和設備除非另有說明，分析時均使用符合國家標準A級玻璃量器。實驗所涉及的玻璃器皿都經過甲醇和超純水的徹底洗滌。4T/LNEMA019—20246.1液相色譜儀液相色譜儀：具紫外檢測器或二極管陣列檢測器。色譜柱：填料為5μmODS，柱長25cm，內徑4.6mm的反相色譜柱，或其它等效色譜柱。6.2高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜儀高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜儀：高效液相色譜具備梯度洗脫功能，質譜儀配有電噴霧離子色譜柱：C18柱或其他等效色譜柱，柱長50mm，內徑2.1mm，填料粒徑1.7μm，或其他等效色譜柱。6.3微量進樣器微量進樣器：10μL、50μL和100μL。6.4濾膜濾膜：孔徑0.22μm醋酸纖維濾膜、親水性聚丙烯、親水性聚四氟乙烯（PTFE）或其他等效材質。6.5分析實驗室通用儀器設備一般實驗室常用儀器和設備。7DGT裝置的準備（1）采用HLB-DGT裝置。該裝置結合相由通用型HLB填料摻雜于聚丙烯酰胺凝膠中制備而成，擴散膜是瓊脂糖凝膠，厚度分別為0.5mm，0.8mm，1.0mm和1.4mm，濾膜是聚醚砜(PES)。（2）DGT裝置在室溫下保存，已開封包裝的DGT裝置可放在裝有少量0.01MNaCl溶液的自封袋中，保持袋中濕潤，并定期檢查。（3）為防止裝置受到污染，使用前勿使裝置長時間暴露空氣中，勿用手或其他物品接觸DGT裝置暴露窗口。（4）裝置投放前，充氮氣16h以上。8水體中抗生素的測定步驟8.1DGT裝置的投放8.1.1已采集的水樣采集的水樣裝到20L左右的容器中，將已準備好的DGT裝置放置到容器中固定，保持裝置的采樣窗口朝向水體，并不斷攪動水體（攪拌）。放置一段時間（60h）。8.1.2現場投放（1）將DGT裝置六個為一組固定在有機玻璃投放器上，然后將投放器放置到指定的采樣點沒入水中，用繩子固定。（2）在投放器的尼龍線末端系上浮標，確定投放地點的位置，同時進行GPS定位。記錄投放時間，測定水溫、水深、電導率、pH等常規參數。（3）DGT裝置在水體中一般持續放置7天。5T/LNEMA019—20248.2DGT裝置的回收和保存8.2.1已采集的水樣取出DGT裝置，用去離子水沖洗裝置的外表面，取出結合相后裝入自封袋內，滴入幾滴去離子水保濕后，密封保存待分析。8.2.2現場回收通過GPS和浮標找到DGT裝置位置，取出DGT裝置，用去離子水沖洗裝置的外表面，取出結合相后裝入自封袋內，滴入幾滴去離子水保濕后，密封保存待分析。8.3DGT采集樣的分析8.3.1DGT結合相提取從DGT裝置中取出的固定相放到10mL離心管中，使用甲醇/乙酸(9:1v/v)混合溶劑5mL洗脫兩次的方式洗脫回收的DGT結合相，洗脫后取出固定膜，保存洗脫液待測定。8.3.2提取液的測定DGT洗脫液加入一定量內標物，經過氮吹濃縮至近干，復溶于1mLLC-MS/MS初始流動相溶液中，過0.22μm的PES濾膜后，采用高效液相色譜-三重四極桿質譜聯用儀(HPLC-MS/MS)測定抗生素。9結果計算9.1結合相上吸附痕量有機污染物質量的計算吸附量（M,單位μg）的計算按照方程（1）進行計算：Ce為提取液中目標物的濃度，Ve為洗脫液體積，Vg為結合相體積，fe為目標物的洗脫率。9.2DGT平均濃度（CDGT）的計算式中：?g為擴散層厚度（cmD為痕量有機污染物在擴散層中擴散系數(cm2·s-1)，A為擴散相的開口的面積，t為DGT裝置的放置時間。9.3擴散紊流邊界層（DBL）的計算DGT用于測定水中自由態離子的濃度存在擴散邊界層δ,所以水體中應用DGT時至少需要放置2種不同厚度擴散膜組成的DGT裝置，從而可應用下列公式得到兩個方程，其中δ和Cb為未知數，解方程得到δ的厚度和目標物的濃度：6T/LNEMA019—2024（3）式中：M為單位時間內的累積量，?g是擴散膜厚度，As指有效采樣面積，t指DGT投放時間，Dg指擴散膜的擴散系數，Ag指DGT窗口暴露面積，Dw指水體擴散系數。9.4方法檢出限本標準的方法檢出限（MDL）測定步驟如下：1)儀器定量限（LOQLOQ是基于HPLC-MS/MS儀器十倍的信噪比S/N計算得出。2)方法檢出限（MDLMDL是將DGT裝置部署于空白溶液中采樣7天后測得的LOQ，代入公10精密度和準確度10.1精密度的計算連續測量同一有證標準樣品6次，用式（4）計算標準偏差Sn：X——n次測量的算術平均值；Sn——n次測量的標準偏差；相對偏差RSD用式（5）計算：本標準規定3種濃度水平的平行樣品測試結果(≥6次）相對標準偏差應小于20%。10.2準確度的計算準確度通過測定加標回收率來計算，選擇一個有證標準樣品進行加標，重復測定6次，回收率按式（6）計算：（6）式中：?X%——加標回收率；X——測定平均值；7T/LNEMA019—2024Xb——樣品本底值Xs——標準值。本標準規定3種濃度水平的樣品加標回收率測試結果，回收率應在75%～120%之間。11廢物處理實驗中產生的廢物應分類收集，統一保管，并做好相應標識，委托有資質的單位進行處理。8T/LNEMA019—2024附錄A（規范性附錄）瓊脂糖擴散膜在25℃下的擴散系數本標準中DGT方法以瓊脂糖疊加PES濾膜作為擴散層，抗生素在瓊脂糖擴散相內的擴散系數通過擴散室法進行測定(圖1.1)，擴散室包括A室和B室，兩室通過瓊脂糖擴散相和聚醚砜濾膜相連，測定時，A室放置有裝有50mL含5mgL-1抗生素溶液(以0.01molL-1NaCl作為背景溶液)，B室僅放置0.