職業教育醫學生物技術專業教學資源庫胚胎干細胞的鑒定職業教育醫學生物技術專業教學資源庫1、ES細胞生物學特性（1）ES細胞形態結構及核型ES細胞具有與早期胚胎細胞相似的形態結構，胞體體積小，核大，有一個或幾個核仁。細胞中多為常染色質，胞質結構簡單，散布著大量核糖體和線粒體，核型正常，保留了二倍體性質。正常ES細胞染色體正常，如發生異常則其很難發育分化形成動物個體。

職業教育醫學生物技術專業教學資源庫（2）ES細胞生長特性ES細胞在體外分化抑制培養中，呈克隆狀生長，細胞緊密地聚集在一起，形似鳥巢，細胞界限不清，克隆周圍有時可見單個ES細胞和分化的扁平狀上皮細胞。

ES細胞增殖迅速，每18—24h分裂增殖1次。此外，其還可以在體外進行選擇、操作、凍存。凍存的細胞可在需要時隨時解凍，繼續培養不失其原有特性，并且來自一個克隆的細胞具有同樣的特征。職業教育醫學生物技術專業教學資源庫（3）ES細胞的高度分化潛能ES細胞在體外需在飼養層細胞上培養才能維持其未分化狀態，一旦脫離飼養層就自發地進行分化。在單層培養時細胞自發分化成多種細胞，懸浮培養中：“簡單類胚體”

“囊狀胚體”

細胞分化物。ES細胞可進行誘導分化

*用RA（維生素A酸或視黃酸）作誘導90％以上的ES細胞分化為神經膠質細胞，

*聚集培養的ES細胞誘導分化則可分化為有節律性收縮的心肌細胞。

*將ES細胞注射到同源動物皮下，可形成組織瘤，其細胞組成可代表3個胚層細胞。

*用ES細胞作核供體進行細胞核移植，可以得到可發育重構胚和動物個體。職業教育醫學生物技術專業教學資源庫

（4）堿性磷酸酶的表達

許多資料表明，小鼠、大鼠的桑椹胚細胞和囊胚細胞均有堿性磷酸酶（AKP）表達，小鼠的EC細胞和ES細胞中均含有豐富的AKP。而在已分化的EC細胞和ES細胞中AKP呈弱陽性或陰性。豬、兔的桑椹胚和早期囊胚AKP呈陽性。因此，AKP常用來作為鑒定EC細胞或ES細胞分化與否的標志之一。職業教育醫學生物技術專業教學資源庫

（5）胚胎階段特異性細胞表面抗原的表達

早期胚胎細胞表面均表達胚胎階段特異性表面抗原（SSEA-1）。在胚胎的原始外胚層細胞、ES細胞、EC細胞和原始生殖細胞的表面均可檢測到SSEA-1的表達。小鼠SSEA-1的表達自8細胞期開始，直到原始外胚層形成期。早期囊胚ICM細胞全部呈強陽性，晚期囊胚中部分ICM呈強陽性，部分呈弱陽性，少部分為陰性。因此，SSEA也常作為ES細胞鑒定的一個標志。職業教育醫學生物技術專業教學資源庫2、ES細胞的全能性主要體現在以下幾方面：

①形成畸胎瘤。將ES細胞注人同源動物皮下可形成畸胎瘤，包括三個胚層細胞；

②形成類胚體。培養ES細胞在非粘附底物中懸浮生長，或控制增殖細胞數目，能夠使之生成類胚體，它是一個與畸胎瘤相似的多種細胞系混雜的集合體、具有三個胚層組織；

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③直系分化。通過控制ES細胞生長環境，或遺傳操縱特定基因表達，ES細胞可直接分化成某特定種系細胞，例如將神經決定基因NeuroD2和NeuroD3轉人ES細胞，可使之分化為神經細胞；

④形成嵌合體。將ES細胞注射到同種動物囊胚腔中后，可以形成嵌合體（chimera），ES細胞可以參與嵌合體各個器官包括生殖腺的發育。這是檢驗一個細胞系是否為ES細胞的標準。職業教育醫學生物技術專業教學資源庫3、ES細胞的鑒定--細胞的形態結構--核型分析--堿性磷酸酶（AKP）染色--SSEA-I免疫熒光標記--分化能力檢測體外分化試驗體內分化試驗嵌合體形成試驗核移植試驗職業教育醫學生物技術專業教學資源庫

（1）ES細胞形態學鑒定依ES細胞的形態結構（胞體體積小，核大、有一個或幾個核仁）和生長特性（呈克隆狀生長，細胞緊密聚集，形似鳥巢，界限不清）對ES細胞進行初步鑒定。職業教育醫學生物技術專業教學資源庫

（2）核型分析

ES細胞具有正常二倍體核型，可用核型分析進行檢驗職業教育醫學生物技術專業教學資源庫

（3）堿性磷酸酶（AKP）染色原理：AKP在堿性條件（pH9.0-9.6）下能使孵育液中的α-磷酸奈酚鈉水解，產生α-奈酚，然后再與偶氮鹽偶聯，形成不溶性染料而呈現顏色。步驟：生長胚胎干細胞克隆的蓋片以無水乙醇或冷丙酮固定10-15min→水洗→滴加孵育液室溫5-10min→水洗10min→復染（甲基綠等）10min。結果：未分化胚胎干細胞顏色以所用偶氮鹽品種而異，分化者則為復染液顏色。對照：以已建系ES細胞（或小鼠的脫帶桑椹胚或囊胚）作為陽性對照，作用液中不含α-萘酚磷酸鈉為陰性對照。

職業教育醫學生物技術專業教學資源庫職業教育醫學生物技術專業教學資源庫（4）胚胎干細胞特異表面抗原的表達免疫熒光檢測SSEA胚胎階段特異性抗原:SSEA-1SSEA-3SSEA-4

Thmoson分離的hES陰性弱陽性強陽性Gearhart分離的hES陽性弱陽性陽性小鼠ES陽性陰性陰性鼠和人胚胎干細胞表達的表面抗原有種屬差異。職業教育醫學生物技術專業教學資源庫（4）胚胎干細胞特異表面抗原的表達RT-PCR檢測轉錄因子Oct-4的表達

Oct-4只限定在多潛能細胞中表達。人和小鼠的胚胎干細胞都表達轉錄因子Oct-4，當胚胎干細胞分化時，其表達能力大大降低。職業教育醫學生物技術專業教學資源庫職業教育醫學生物技術專業教學資源庫（5）分化能力檢測體外分化能力觀察:無飼養層和無抑制分化因子的條件下培養，胚胎干細胞會分化成各種細胞或發育成胚胎體：3d“簡單類胚體”

5-10d“囊狀胚體”

貼壁細胞為細胞分化物。職業教育醫學生物技術專業教學資源庫體內分化能力觀察：ES細胞接種同一品系小鼠腹股溝（107個細胞）或裸鼠、SCID小鼠（106個細胞）→約2周后出現腫塊，4-5周進一步增大，摘除腫塊→固定切片染色：見三個胚層組織，為畸胎瘤結構裸鼠和SCID小鼠可接種異種細胞和組織的移植也可接種腹腔，2-3周后觀察腫瘤職業教育醫學生物技術專業教學資源庫嵌合能力測定：野灰色小鼠品系（如129鼠）ES注射白化體小鼠（BALB/c小鼠）或純合非野灰色小鼠（C57BL/6小鼠）著床前胚胎內，或將來源于白化體小鼠的ES注射野灰色小鼠或純合非野灰色小鼠著床前胚胎內，再移植到假孕母鼠子宮內，使之發育成個體。如