T/CAS952—2024Qualitycontrolspecificationsforimmdetectionbasedonfluorescentlylabel 2 3 3 3 3 4 4 4 5 5 6 7 7 7 7 7 7 9請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件起草單位：安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院、遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院、中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院、南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院、浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院、空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)京）有限公司、北京大學(xué)第一醫(yī)院/北京大學(xué)泌整合醫(yī)學(xué)學(xué)會(huì)/北京檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)會(huì)、北京中檢體盧佳斌、孫世珺、焦磊、王愛香、李娜、穆紅、馬慧寧、李曉霞、趙林勝、孫琦、戴其全基于熒光標(biāo)記二抗的免疫組織化學(xué)檢測(cè)質(zhì)量控制規(guī)范本文件規(guī)定了基于熒光標(biāo)記二抗的免疫組織化學(xué)檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)基本要求、操作程序和質(zhì)量控制的本文件適用于病理實(shí)驗(yàn)室規(guī)范開展熒光標(biāo)記二抗免疫組織化下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用GB39707醫(yī)療廢物處理處置污染CNAS-CL02:2023醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記在抗體上的顯色物質(zhì)（熒光素、酶、金屬離子、同位素、色原體）顯色來檢測(cè)組織細(xì)胞抗原，對(duì)其進(jìn)行定位、定性及半定量的檢測(cè)的技2將組織浸入適宜的固定劑，使細(xì)胞和組織內(nèi)的物質(zhì)盡可能保持在其生活狀態(tài)時(shí)的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和將組織蛋白內(nèi)或蛋白之間因甲醛固定形成的交聯(lián)打開，使之恢復(fù)到原有空間狀態(tài)的過程。常用熒光標(biāo)記二抗fluorescencelabeledsecondarEDTA-Tris：三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸緩沖液（EthylenediamineTetraaceticAcid-trishydroxymethylaminomethanFITC：熒光素5-異硫氰酸酯（FluoresceinI空間設(shè)置應(yīng)考慮免疫組織化學(xué)染色機(jī)、純水儀、電磁爐、蒸汽壓力鍋、恒溫箱、生物顯微鏡等設(shè)備安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，針對(duì)生物、化學(xué)、放射及物理等危害制定防護(hù)性措施及合適化學(xué)實(shí)驗(yàn)室的空間和布局應(yīng)與實(shí)驗(yàn)室活動(dòng)相匹配，宜設(shè)立單獨(dú)的免疫組織化學(xué)染色區(qū)b)機(jī)器清潔系統(tǒng)：染色切片達(dá)到一定數(shù)量時(shí)，機(jī)器提示系統(tǒng)清潔；d)條碼掃描系統(tǒng)：全自動(dòng)識(shí)別試劑與玻片上的條碼、試劑位，可讀取打印的標(biāo)簽；g)染色系統(tǒng)：預(yù)置染色標(biāo)準(zhǔn)程序，具備a)試劑安全：有毒廢液與無毒廢液區(qū)分排放，方4純水儀的制水量和效率應(yīng)滿足實(shí)驗(yàn)室最大檢測(cè)量的需求。純水儀制備的純水在性狀、電導(dǎo)率、實(shí)驗(yàn)室所用熒光生物顯微鏡應(yīng)符合JB/T5479的要求。d)固定時(shí)間根據(jù)組織大小，在6h～48h之間，直徑小于2mm的活檢組織固定b)脫水過程應(yīng)緩慢進(jìn)行，每種梯度乙醇的作用時(shí)間宜設(shè)定為60min～120min；d)脫水劑應(yīng)定期或根據(jù)組織數(shù)量進(jìn)行更換，確認(rèn)達(dá)到脫水效果。a)透明程序宜使用二道透明劑，宜根據(jù)組織的類型和大小及脫水機(jī)的效率5a)透明后的組織應(yīng)經(jīng)過2次～3次浸蠟程序，每次時(shí)間為30min～90min；b)建議使用熔點(diǎn)為56℃~58℃或58℃~60℃的優(yōu)質(zhì)切片石蠟，浸蠟溫度控制在60℃~b)在包埋組織時(shí)，應(yīng)根據(jù)所處理組織的類型決定組織的包埋方向；c)應(yīng)根據(jù)烤片溫度確定烤片時(shí)間，例如60℃~65℃烤片時(shí)間應(yīng)控制在60min～120min，70℃~80℃烤片時(shí)間應(yīng)控制在30min～60min，不應(yīng)高溫長(zhǎng)時(shí)間烤片。b)新鮮組織樣本冷凍切片后應(yīng)及時(shí)固定。固定液應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)具體要求選擇含有丙酮（10min~c)細(xì)胞樣本應(yīng)及時(shí)離心后涂片。涂片后及時(shí)放入含有丙酮（5min～10min）、甲醛（10min~d)細(xì)胞樣本如需要制備成細(xì)胞蠟塊，則離心沉淀后用濾紙或滲透性好的紙張包裹，放入10%b)抗原修復(fù)（可選擇熱修復(fù)方式或酶修復(fù)方式）；6h)滴加適量二抗試劑（根據(jù)需求選取合適的熒光標(biāo)記的二抗），37℃避光孵育20min（具）；j)滴加適量DAPI染細(xì)胞核，室溫避光孵育（濃度和時(shí)間根據(jù)DAPI試劑說明書使用），細(xì)），染色后切片可在2℃~8℃短期保存一周。如需長(zhǎng)期保存，可在-20℃保存12個(gè)月，保存期間在使用熒光試劑選擇時(shí)，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蜆悠奉愋瓦x擇合適的熒光試劑。遵循熒光試劑解、濃度選擇、染色時(shí)間和觀察分析等使用步驟。注意熒光試劑的保存條件，避免陽光直射和高溫b)抗原表達(dá)應(yīng)在特定部位，且定位清晰準(zhǔn)確，而無背景染色；c)組織的前處理不佳導(dǎo)致的抗原異位，此時(shí)d)抗體的不同克隆號(hào)在不同組織中的定位不同，此時(shí)應(yīng)標(biāo)注陽性部位某些抗體在不同腫瘤類a)陰性結(jié)果的判讀應(yīng)區(qū)分真陰性和假陰性，由于檢測(cè)方法靈敏度有高低之注：熒光信號(hào)強(qiáng)度與待測(cè)標(biāo)記物蛋白含量有關(guān)。建議參考內(nèi)參細(xì)胞的蛋白表達(dá)熒光強(qiáng)度達(dá)到中b)應(yīng)區(qū)分在出血、壞死、刀痕和邊緣細(xì)胞區(qū)域出現(xiàn)的非特異性的陽性信號(hào)，應(yīng)結(jié)合形態(tài)學(xué)特c)定性判讀：免疫熒光染色結(jié)果判讀過程中，多數(shù)染色結(jié)果的判讀為定性。染色結(jié)果可信的前提下，信號(hào)出現(xiàn)在預(yù)期部位（分為細(xì)胞膜型、細(xì)胞質(zhì)型、細(xì)胞核合型四種陽性細(xì)胞類型強(qiáng)度可以被觀察到，反之則為陰性；d)半定量判讀：參考組織化學(xué)評(píng)分（histochemistry），77.1.4應(yīng)定期對(duì)基于熒光標(biāo)記二抗的IHC檢測(cè)中資源要素和b)臨床樣本的檢測(cè)應(yīng)選擇具有注冊(cè)證的體外診斷設(shè)備，并定d)二抗的選擇應(yīng)考慮與一抗的種屬匹配，同時(shí)二抗標(biāo)記的熒光基團(tuán)應(yīng)與實(shí)驗(yàn)室的熒光生物顯微鏡相匹配；同時(shí)標(biāo)記多個(gè)抗原時(shí)，既應(yīng)考慮一抗與二抗的種屬匹配，也應(yīng)選擇合適e)選擇的熒光標(biāo)記二抗應(yīng)與組織無交叉反應(yīng)，以便最大f)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)按照試劑制造商說明儲(chǔ)存和分裝相關(guān)試劑和耗材，并監(jiān)測(cè)相關(guān)的環(huán)境條件；g)新進(jìn)抗體應(yīng)進(jìn)行抗體性能驗(yàn)證并填寫抗體驗(yàn)證質(zhì)控表，確定抗體效價(jià)、組織定位；不同批h)熒光標(biāo)記的選擇：熒光標(biāo)記的波長(zhǎng)應(yīng)盡量在肉眼可見范圍內(nèi)，避免無法過拍照軟件曝光后拍照觀察）造成的判讀失誤。封片時(shí)應(yīng)選用專用的具有防淬滅功i)新進(jìn)或維修后再次投入臨床使用的設(shè)備，以及新貨號(hào)或新批次試劑在實(shí)施常規(guī)臨床檢測(cè)之抗原修復(fù)的原則：選擇合適的修復(fù)液，采用恰當(dāng)?shù)男迯?fù)時(shí)間和修復(fù)溫度，最大程度地暴露抗原8影響熱修復(fù)的因素包括修復(fù)液的pH值、修復(fù)時(shí)間和修復(fù)溫度，抗原修復(fù)應(yīng)滿足以b)修復(fù)液pH值的選擇：常用的修復(fù)液包括檸檬酸鹽（CitratepH6.0）、EDTA（pH8.0）、EDTA（pH9.0）和EDTA-Tric)抗原修復(fù)時(shí)間和修復(fù)溫度的設(shè)定：應(yīng)根據(jù)試劑說明書選擇合適的抗原修d)酶消化過程與酶的濃度、活性、反應(yīng)溫度及pH密切相關(guān)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)參考試劑說明書，根據(jù)陰性對(duì)照和陽性對(duì)照確認(rèn)酶的濃度及活性，探究最佳孵育時(shí)間和溫a)對(duì)于石蠟包埋樣本，對(duì)照組織應(yīng)與待檢組織采取相同的程序進(jìn)行固定、b)對(duì)照組織應(yīng)與待檢組織采用相同的檢測(cè)流程，如對(duì)照組織檢測(cè)失敗，那么本次檢測(cè)流程視a)基于熒光標(biāo)記二抗的IHC檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)參考國(guó)家衛(wèi)健委病年版）設(shè)立免疫熒光染色室間質(zhì)評(píng)合格率（指參加省級(jí)及以上病理