第07講重組DNA技術(shù)的基本工具

目標】

1.闡明重組DNA技術(shù)所需的三種工具的作用。

2.提升對基因工程的理解能力，能夠合理分析在基因水平產(chǎn)生的問題。

3.了解進行DNA的粗提取和鑒定的原理，進行DNA的粗提取和鑒定的操作。

3.認同基因工程的作用及意義，認識到生物技術(shù)的發(fā)展離不開理論研究和技術(shù)創(chuàng)新。

4n

、【基礎(chǔ)知識】

工程的概念

項目具體內(nèi)容

操作對象基因

原理基因重組

操作環(huán)境體外

操作水平分子水平

結(jié)果獲得人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品

優(yōu)點克服遠緣雜交不親和的障礙;定向改造生物的性狀

二、限制性核酸內(nèi)切酶

（1）來源：主要從原核生物中分離出來。

（2）種類：約4000種

（3）作用:識別雙鏈DNA分子的某種特定核昔酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核昔酸之間的磷

酸二酯鍵斷開。

（4）限制酶識別序列的長度最常見的為6個核甘酸，也有少數(shù)限制酶的識別序列由4個、8個、或其他數(shù)

量的核昔酸組成。

①在中軸線兩側(cè)切割，形成黏性末端。如：EcoRI限制酶能識別GAATTC序列，為6個核甘酸，并在G和

A之間切開。

在中軸線兩側(cè)切割，形成黏性末端它?1之間堿基正好互補配對，因此稱這些片斷為物吐端.

②在中軸線處切割，形成平末端。如：Smal限制酶能識別CCCGGG序列，為6個核甘酸，并在G和C之

間切開。

中軸線

平末端

限制陶從識別序列的中心軸線處切開

在中軸線處切割,形成平末端

時，切開的DNA兩條單鏈的切口，是

平整的，這樣的切II叫V末端-。

總結(jié)歸納

1.限制性核酸內(nèi)切酶是可以識別并附著特定的核昔酸序列，并對每條鏈中特定部位的兩個脫氧核糖核甘酸之

間的磷酸二酯鍵進行切割的一類酶，簡稱限制酶。

2.限制作用實際就是限制酶降解外源DNA,維護宿主遺傳穩(wěn)定的保護機制。一般不切割自身的DNA分子，

是由于甲基化的修飾作用，可使腺喋玲A和胞嚏咤C甲基化而受到保護，通過甲基化作用達到識別自身遺

傳物質(zhì)和外來遺傳物質(zhì)的目的。

3.根據(jù)酶的功能特性、大小及反應時所需的輔助因子，限制性內(nèi)切酶可分為兩大類，即I類酶和n類酶。

其中，II類酶有EcoRI、BamHLHindII、HindIII等，在所識別的特定堿基序列上有特定的酶切位點，因

而DNA分子經(jīng)過II類酶作用后，可產(chǎn)生特異性的酶解片斷，這些片斷可用凝膠電泳法進行分離、鑒別。

4.限制酶識別DNA序列中的回文序列。回文序列指的是雙鏈DNA或RNA分子中的特定的核甘酸片段，該

片段在其中一條鏈上按5至J3,讀取的序列與其互補鏈上按相同的5,到3,讀取的序列一致。例如，DNA序列

ACCTAGGT之所以是回文序列，是因為它的互補序列是TGGATCCA,而反向互補序列是ACCTAGGT,和

其原來序列一致。有些限制酶的切割位點在回文的一側(cè)（如EcoRI、BamHLHind等），因而可形成粘性

末端；另一些H類酶如Alul、BsuRLBall,HalHRHPaLSmal等，切割位點在回文序列中間，形成平

末端。

三、DNA連接酶

（D作用：將雙鏈DNA片段“縫合”起來，恢復被限制酶切開的兩個核甘酸之間的磷酸二酯鍵。即把脫氧核糖

和磷酸交替連接而構(gòu)成的DNA骨架上的缺口連接起來。

⑵類型：

例EcoliDNAiSSSST?DNA3酶

來源大腸桿菌L噬菌體

功能只縫合黏性末端縫合黏性末端和平末端（效率較低）

結(jié)果恢復被限制酶切開的兩個核甘酸之間的磷酸二酯鍵|

歸納總結(jié)

1.DNA連接酶分為兩大類:一類是利用ATP催化兩個核甘酸鏈之間形成磷酸二酯鍵的依賴ATP的DNA連

接酶；另一類是利用煙酰胺腺喋吟二核甘酸（NAD+）的能量催化兩個核甘酸鏈之間形成磷酸二酯鍵的依賴

NAD+的DNA連接酶。DNA連接酶是通過催化形成磷酸二酯鍵把兩條DNA（雙股或是單股DNA）黏合成

一條。

2.教材中提到的EcoliDNA連接酶，來源于大腸桿菌，可用于連接粘性末端；T4DNA連接酶，來源于T4

噬菌體，可用于連接粘性末端和平末端，但連接效率低。E-coliDNA連接酶對胰蛋白酶敏感，可被其水解。

水解后形成的小片段仍具有部分活性，可以催化酶與NAD（而不是ATP）反應形成酶-AMP中間物，但不能繼

續(xù)將AMP轉(zhuǎn)移到DNA上促進磷酸二酯鍵的形成。T4DNA連接酶是ATP依賴的DNA連接酶，催化兩條

DNA雙鏈上相鄰的5,磷酸基和3,羥基之間形成磷酸二酯鍵。

四、基因進入受體細胞的載體

（1）載體作用：將目的基因載入受體細胞。利用它在宿主細胞內(nèi)對目的基因進行大量復制。

（2）載體種類：質(zhì)粒、噬菌體、動植物病毒等

（3）最常用載體：質(zhì)粒

大腸桿菌細胞

目的基因.

插入位點

氯爺青市素

抗性基閃

大腸桿菌及質(zhì)粒載體結(jié)構(gòu)模式圖

特點：

①裸露的、結(jié)構(gòu)簡單、獨立于真核細胞細胞核或原核細胞擬核DNA外，具有自我復制能力的環(huán)狀雙鏈DNA。

②有一個至多個限制酶切割位點。

③在基因工程操作中，真正被用作載體的質(zhì)粒都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進行過人工改造的。

④有特殊的標記基因，如：抗生素的抗性基因（四環(huán)素抗性基因（tetr）、氨葦青霉素抗性基因（ampr）等）、熒

光蛋白基因（綠色熒光蛋白基因（GFP）、紅色熒光蛋白基因（RFP）。

⑤對細胞無毒無害。

⑥大小適中，便于提取和操作。

歸納總結(jié)

1.基因工程中常用的運載體主要有兩類：

一類運載體是噬菌體或某些病毒等。

另一類是細菌細胞質(zhì)的質(zhì)粒，它是一種相對分子質(zhì)量較小、獨立于擬核之外的環(huán)狀DNA,有的一個細菌中

有一個，有的一個細菌中有多個。質(zhì)粒能通過細菌間的接合由一個細菌向另一個細菌轉(zhuǎn)移，可以獨立復制，

也可整合到細菌擬核DNA中，隨著擬核DNA的復制而復制。

2.質(zhì)粒作為載體是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上為適應實驗室操作而進行人工構(gòu)建的質(zhì)粒。與天然質(zhì)粒相比，質(zhì)粒載

體通常帶有一個或一個以上的標記基因（如抗生素抗性基因）和一個人工合成的含有多個限制性內(nèi)切酶識

別位點的多克隆位點序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量盡可能減少，以便于基因工程操作。

3.質(zhì)粒載體都有三個共同的特征：一個復制子、一個選擇性標志和一個克隆位點。

復制子是含有DNA復制起始位點的一段DNA,也包括表達由質(zhì)粒編碼的復制必需的RNA和蛋白質(zhì)的基因。

克隆位點是限制性內(nèi)切酶切割位點，外源性DNA可由此插入質(zhì)粒內(nèi)，而且并不影響質(zhì)粒的復制能力，或為

宿主提供選擇性表型。一般地，載體都含有多克隆位點，多克隆位點的存在可以確保載體合適大部分的DNA

片段，可以針對插入片段提供特定的酶切位點圖譜，防止插入片段插入不恰當?shù)奈恢茫谫|(zhì)粒重組操作方

面具有更大的靈活性。

編碼抗生素抗性的基因是最普遍的細菌選擇性標志（如pBR322）。主要的抗生素抗性基因有：氨葦青霉素

抗性基因、氯霉素抗性基因、四環(huán)素抗性基因和卡那霉素抗性基因四種。

五、DNA的粗提取和鑒定

（一）提取生物大分子的基本思路

選用一定的物理或化學方法分離具有不同物理或化學性質(zhì)的生物大分子。

DNA粗提取的基本思路：利用DNA與RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學性質(zhì)方面的差異，提取DNA,

去除其他成分。

（二）提取DNA的基本原理

1.DNA在NaCl中的的溶解性：

在NaCl溶液濃度低于0.14mol/L時，DNA的溶解度隨NaCl溶液濃度的增加而逐漸降低；在0.14mol/L時,

DNA溶解度最小；當NaCl溶液濃度繼續(xù)增加時，DNA的溶解度又逐漸增大。當氯化鈉的物質(zhì)的量濃度為

2moi/L時，DNA的溶解度最大；濃度為0.14mol/L時，DNA的溶解度最低。利用這一原理，可以使DNA

在鹽溶液中溶解或析出。

2.DNA對酶、高溫和洗滌劑的耐受性

（1）對酶的耐受性：蛋白酶能水解蛋白質(zhì)，但對DNA沒有影響。

（2）對溫度的耐受性：大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受60?80°C的高溫，而DNA在80℃以上才會變性。

（3）對洗滌劑的耐受性：洗滌劑能夠瓦解細胞膜，去除脂質(zhì)和蛋白質(zhì)但對DNA沒有影響。

3.DNA在酒精溶液中的溶解性

DNA不溶于酒精溶液，但細胞中某些蛋白質(zhì)則溶于酒精。將DNA與蛋白質(zhì)進一步分離。

（三）DNA的鑒定

沸水浴條件下，DNA遇二苯胺試劑呈現(xiàn)藍色

婺定紿果

歸納總結(jié)

1.實驗材料的選取：

凡是含有DNA的生物材料都可以考慮，但使用DNA含量相對較高的生物組織，成功的可能性更大。

2.破碎細胞，獲取含DNA的濾液

如果是動物細胞，則破碎比較容易，以雞血細胞為例，在雞血細胞液中加入一定量的蒸儲水，同時用玻

璃棒攪拌，過濾后收集濾液即可。如果實驗材料是植物細胞，需要先用洗滌劑溶解細胞膜。例如，提取洋

蔥的DNA時，在切碎的洋蔥中加入一定的洗滌劑和食鹽，進行充分的攪拌和研磨，過濾后收集研磨液。

3.去除濾液中的雜質(zhì)：

法一：DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同。當氯化鈉的物質(zhì)的量濃度為2moi/L時，DNA的溶解度最

大；濃度為014mol/L時，DNA的溶解度最低。利用這一原理，可以使DNA在鹽溶液中溶解或析出。

法二：是蛋白酶分解蛋白質(zhì)，不分解DNA,從而使提取的DNA與蛋白質(zhì)分開；

法三：是DNA和蛋白質(zhì)對高溫耐受性的不同，從而使蛋白質(zhì)變性，與DNA分離。

【考點剖析】

考點一：限制性內(nèi)切酶

［例1.圖甲表示某環(huán)型DNA分子經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶（EcoRI）完全酶切后的片段電泳結(jié)果若改變

條件使其酶切不充分就有可能獲得如圖乙所示的電泳結(jié)果（Kb即千個堿基對）。下列敘述錯誤的是（）

7.Okb

6.Okb

4.5kb

4.Okb—4.Okb

3.Okb

--2.5kb

2.Okb

1.5kb1.5kb

1.Okb1.Okb

0.5kb0.5kb

甲乙

A.該DNA分子全長至少為7Kb,該DNA分子中至少含有4個EcoRi酶切位點

B.反應時間越長，得到圖甲結(jié)果的可能性越大

C.限制性核酸內(nèi)切酶主要來自原核生物，化學本質(zhì)都是蛋白質(zhì)

D.適當增加EcoRi濃度，更可能得到圖乙的結(jié)果

【答案】D

【解析】據(jù)題意和圖示分析可知：環(huán)型DNA分子經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶（EcoRi）完全酶切后得到4,0、1.5、

1.0和0.5四種長度的DNA片段，說明該DNA分子全長至少為7Kb,至少含有4個EcoRI酶切位點。反

應時間越長或適當增加EcoRi濃度，DNA被切割越徹底，得到圖甲結(jié)果的可能性越大。環(huán)型DNA分子經(jīng)

限制性核酸內(nèi)切酶（EcoRI）完全酶切后得到4.0、1.5、1.0和0.5四種長度的DNA片段，說明該DNA分

子全長至少為7Kb,環(huán)狀DNA分子，可以被限制性核酸內(nèi)切酶（EcoRi）完全酶切后得到至少4個DNA

片段，說明該DNA分子中至少含有4個EcoRI酶切位點，故A正確；反應時間越長，DNA被切割越徹底,

得到圖甲結(jié)果的可能性越大，故B正確；限制性核酸內(nèi)切酶主要來自原核生物，限制酶的化學本質(zhì)是蛋白

質(zhì)，C正確；

D、適當增加EcoRI濃度，可得到圖甲的結(jié)果，故D錯誤。

考點二：DNA連接酶

2.限制酶和DNA連接酶是重組DNA技術(shù)常用的工具酶，限制酶通常將DNA分子切割成帶有

黏性末端的DNA片段，而DNA連接酶可縫合帶有黏性末端的DNA片段。據(jù)圖分析錯誤的是（）

A.圖示三個黏性末端一定由兩種不同的限制酶切割產(chǎn)生

B.圖示中共有兩種黏性末端，其中甲與乙黏性末端相同

C.a點核甘酸之間通過磷酸二酯鍵連接，b處核甘酸之間通過氫鍵連接

D.催化甲形成的限制酶有可能不識別由甲、乙形成的重組DNA分子

【答案】A

【解析】限制酶能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定核昔酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核昔酸

之間的磷酸二酯鍵斷裂，形成黏性末端和平末端兩種；DNA連接酶連接的是兩個核甘酸之間的磷酸二酯鍵。

切割產(chǎn)生甲的限制酶的識別列為：GAATTC//CTTAAG,切割產(chǎn)生乙的限制酶的識別列為：

CAATTG//GTTAAC,切割產(chǎn)生丙的限制酶的識別序列為：CTTAAG//GAATTC,由此可見，甲、乙、丙的

黏性末端是由三種限制酶催化產(chǎn)生的，A錯誤；由圖可知，甲、乙的黏性末端相同，均為AATT一,丙的黏

性末端為TTAA—,因此圖示中共有兩種黏性末端，B正確；a點屬于兩個核甘酸之間通過磷酸二酯鍵連接

成鏈，b點屬于兩條鏈之間的核甘酸，通過氫鍵相連，C正確；切割甲的限制酶的識別列為：

GAATTC//CTTAAG,而甲、乙片段形成的重組DNA分子序列為：GAATTG//CTTAAC,因此切割甲的限制

酶不能識別由甲、乙片段形成的重組DNA分子，D正確。

考點三、基因工程的載體

例3.質(zhì)粒是基因工程最常用的載體，下列有關(guān)質(zhì)粒的說法正確的是（）

A.質(zhì)粒不僅存在于細菌中，也存在于某些病毒中B.細菌的基因只存在于質(zhì)粒上

C.質(zhì)粒為小型環(huán)狀DNA分子D.質(zhì)粒是基因工程中的重要工具酶之一

【答案】C

【解析】基因工程常用的運載體：質(zhì)粒、噬菌體的衍生物、動植物病毒。質(zhì)粒是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單、

獨立于細菌擬核DNA之外并具有自我復制能力的雙鏈環(huán)狀DNA分子。質(zhì)粒主要存在于細菌、酵母菌等生

物中，病毒中沒有質(zhì)粒，A錯誤；細菌基因主要存在于擬核DNA上，也有少數(shù)存在于質(zhì)粒上，B錯誤；質(zhì)

粒為小型環(huán)狀DNA分子，存在于細胞核外或擬核外的細胞質(zhì)基質(zhì)中，C正確；質(zhì)粒是基因工程中的重要工

具之一，但不是工具酶，基因工程中的工具酶是限制酶和DNA聚合酶，D錯誤。

考點四、DNA的粗提取和鑒定

例4.如圖是“DNA粗提取與鑒定”實驗中的兩個操作步驟示意圖，相關(guān)敘述正確的是（）

95%酒精各加4mL:茶胺試劑

（冷卻，50mL）

試"管2

N一絲狀物溶液bDNA溶液

溶液aR

圖I圖2

A.圖1中溶液a是0.14mobL-1的NaCl溶液

B.圖1所示操作的原理是DNA能溶于酒精，而蛋白質(zhì)等雜質(zhì)不溶

C.圖2所示實驗操作中有一處明顯錯誤，可能導致試管2中藍色變化不明顯

D.圖2試管1的作用是證明2mol-L1NaCl溶液遇二苯胺出現(xiàn)藍色

【答案】C

【解析】圖1中溶液a是2moi的NaCl溶液，A錯誤；圖1所示操作的原理是DNA不能溶于酒精，而

蛋白質(zhì)等雜質(zhì)能溶，B錯誤；圖2所示實驗操作中有一處明顯錯誤（試管2中未將DNA溶于2moi的

NaCl溶液中）,可能導致試管2中藍色變化不明顯，C正確；圖2試管1的作用是證明2moi?1/NaCl溶

液遇二苯胺不會出現(xiàn)藍色，D錯誤。

1.（2021山東高考，13）粗提取DNA時，向雞血細胞液中加入一定量的蒸儲水并攪拌，過濾后所得濾液進行

下列處理后再進行過濾,在得到的濾液中加入特定試劑后容易提取出DNA相對含量較高的白色絲狀物的處

理方式是（）

A.加入適量的木瓜蛋白酶

B.37?40℃的水浴箱中保溫10-15分鐘

C.加入與濾液體積相等的、體積分數(shù)為95%的冷卻的酒精

D.加入NaCl調(diào)節(jié)濃度至2moi/Li過濾―調(diào)節(jié)濾液中NaCl濃度至0.14mol/L

【答案】A

【解析】木瓜蛋白酶可以水解DNA中的蛋白質(zhì)類雜質(zhì)，由于酶具有專一性，不能水解DNA,過濾后在得

到的濾液中加入特定試劑后容易提取出DNA相對含量較高的白色絲狀物，A正確；37?40℃的水浴箱中保

溫10?15分鐘不能去除濾液中的雜質(zhì)，應該放在60~75℃的水浴箱中保溫10-15分鐘，使蛋白質(zhì)變性析

出，B錯誤；向雞血細胞液中加入一定量的蒸儲水并攪拌，過濾后在得到的濾液中加入與濾液體積相等的、

體積分數(shù)為95%的冷卻的酒精，此時DNA析出，不會進入濾液中,C錯誤;加入NaCl調(diào)節(jié)濃度至2mol/L-

過濾一調(diào)節(jié)濾液中NaCl濃度至0.14mol/L,DNA在0.14moi/L的NaCl溶液中溶解度小，DNA析出，

不會進入濾液中，D錯誤。

2.（2020海南高考生物，10）下列關(guān)于“DNA的粗提取與鑒定”實驗的敘述，錯誤的是（）

A.羊的成熟紅細胞可作為提取DNA的材料

B.提取植物細胞的DNA時，需要加入一定量的洗滌劑和食鹽

C.預冷的酒精溶液能抑制核酸水解酶活性，防止DNA水解

D.在沸水浴條件下，DNA與二苯胺反應呈現(xiàn)藍色

【答案】A

【解析】羊的成熟紅細胞沒有細胞核，因此不可作為提取DNA的材料，A錯誤；提取植物細胞的DNA時,

需要加入一定量的洗滌劑和食鹽，洗滌劑的作用是瓦解細胞膜，而食鹽的作用是提高DNA的溶解度，B正

確；預冷的酒精溶液能抑制核酸水解酶活性，防止DNA水解，同時根據(jù)DNA蛋白質(zhì)溶于酒精，而DNA

不溶于酒精的特性將其析出，C正確；由分析可知，在沸水浴條件下，DNA與二苯胺反應呈現(xiàn)藍色，據(jù)此

鑒定DNA的存在，D正確。

3.（2018?北京）用XhoI和SalI兩種限制性核酸內(nèi)切酶分別處理同一DNA片段，酶切位點及酶切產(chǎn)物分

離結(jié)果如圖。以下敘述不正確的是（）

XhoI1Sa/1SalIXhoI

I____|_____一___2?A

圖l艇切位點圖

A.圖1中兩種酶識別的核甘酸序列不同

B.圖2中酶切產(chǎn)物可用于構(gòu)建重組DNA

C.泳道①中是用Sall處理得到的酶切產(chǎn)物

D.圖中被酶切的DNA片段是單鏈DNA

【答案】D

【解析】酶具有專一性，不同的限制酶識別并切割不同的核甘酸序列，A正確；圖2中酶切產(chǎn)物可用于

構(gòu)建重組DNA,B正確；分析圖1,限制酶Sall有三處切割位點，切割后產(chǎn)生4個DNA片段，泳道①

中是用Sall處理得到的酶切產(chǎn)物，C正確；圖中被酶切的DNA片段是雙鏈DNA,D錯誤。

4.（2017?北京）為了增加菊花花色類型，研究者從其他植物中克隆出花色基因C（圖1）,擬將其與質(zhì)粒（圖

2）重組，再借助農(nóng)桿菌導入菊花中。下列操作與實驗目的不符的是（

I

EroR!&oRI

IC基因|

圖1圖2

A.用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI和連接酶構(gòu)建重組質(zhì)粒

B.用含C基因的農(nóng)桿菌侵染菊花愈傷組織，將C基因?qū)爰毎?/p>

C.在培養(yǎng)基中添加卡那霉素，篩選被轉(zhuǎn)化的菊花細胞

D.用分子雜交方法檢測C基因是否整合到菊花染色體上

【答案】C

【解析】據(jù)圖分析可知，在目的基因的兩端、啟動子和終止子之間都有限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI的切割位

點，因此可以用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI切割目的基因和運載體，之后再用DNA連接酶連接形成基因表

達載體，A正確；將目的基因?qū)氲街参锛毎Ｓ棉r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，可以將目的基因C導入到農(nóng)桿菌的Ti

質(zhì)粒的T-DNA段，之后再用含C基因的農(nóng)桿菌侵染菊花愈傷組織，將C基因?qū)爰毎腥旧w上的DNA

上，B正確；圖2中顯示標記基因是潮霉素抗性基因，應該在培養(yǎng)基中添加潮霉素，篩選被轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌，

C錯誤；要檢測轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因，方法是采用分子雜交技術(shù)，D正確。

5.（2021?全國乙卷高考真題）用DNA重組技術(shù)可以賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人類需要的

生物產(chǎn)品。在此過程中需要使用多種工具酶，其中4種限制性核酸內(nèi)切酶的切割位點如圖所示。

IIII

GAATTCCCCGGGCTGCAGGATATC

CTTAAGGGGCCCGACGTCCTATAG

tttt

限制酶：EcoRISmalPstIEcoRV

回答下列問題：

（1）常用的DNA連接酶有E.coliDNA連接酶和TdDNA連接酶。上圖中酶切割后的DNA片

段可以用E.coliDNA連接酶連接。上圖中酶切割后的DNA片段可以用T&DNA連接酶連接。

（2）DNA連接酶催化目的基因片段與質(zhì)粒載體片段之間形成的化學鍵是o

（3）DNA重組技術(shù)中所用的質(zhì)粒載體具有一些特征，如質(zhì)粒DNA分子上有復制原點，可以保證質(zhì)粒在受

體細胞中能;質(zhì)粒DNA分子上有,便于外源DNA插入；質(zhì)粒DNA分子上有

標記基因（如某種抗生素抗性基因）,利用抗生素可篩選出含質(zhì)粒載體的宿主細胞，方法是o

（4）表達載體含有啟動子，啟動子是指。

【答案】（1）EcoRI、PstIEcoRLPstLSmal和EcoRV

（2）磷酸二酯鍵

（3）自我復制一至多個限制酶切位點用含有該抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)宿主細胞，能夠存活的即為含

有質(zhì)粒載體的宿主細胞

（4）位于基因首端的一段特殊DNA序列，是RNA聚合酶識別及結(jié)合的部位，能驅(qū)動轉(zhuǎn)錄過程

【解析】（1）限制酶EcoRI和PstI切割形成的是黏性末端，限制酶Smal和EcoRV切割形成的是平末端，

E.coliDNA連接酶來源于大腸桿菌，只能將雙鏈DNA片段互補的黏性末端之間的磷酸二酯鍵連接起來，

而T4DNA連接酶來源于T4噬菌體，可用于連接黏性末端和平末端，但連接效率較低。因此圖中EcoRI和

PstI切割后的DNA片段（黏性末端）可以用E.coliDNA連接酶連接，除了這兩種限制酶切割的DNA片段,

限制酶Smal和EcoRV切割后的DNA片段（平末端）也可以用T4DNA連接酶連接。

（2）DNA連接酶將兩個DNA片段連接形成磷酸二酯鍵。

（3）質(zhì)粒是小型環(huán)狀的DNA分子，常作為基因表達的載體，首先質(zhì)粒上含有復制原點，能保證質(zhì)粒在受

體細胞中自我復制。質(zhì)粒DNA分子上有一個至多個限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點，便于目的基因的導入。

質(zhì)粒上的標記基因是為了鑒定受體細胞中是否含有目的基因，具體做法是用含有該抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)宿

主細胞，能夠存活的即為含有質(zhì)粒載體的宿主細胞。

（4）啟動子是一段特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它

才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA,最終獲得需要的蛋白質(zhì)。

6.（2021海南）25.CRISPR/Cas9是一種高效的基因編輯技術(shù)，Cas9基因表達的Cas9蛋白像一把“分子剪

刀”，在單鏈向?qū)NA（SgRNA）引導下，切割DNA雙鏈以敲除目標基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9

基因編輯技術(shù)的工作原理如圖所示。

回答下列問題。

（1）過程①中，為構(gòu)建CRISPR/Cas9重組質(zhì)粒，需對含有特定sgRNA編碼序列的DNA進行酶切處理，然

后將其插入到經(jīng)相同酶切處理過的質(zhì)粒上，插入時所需要的酶是0

（2）過程②中，將重組質(zhì)粒導入大腸桿菌細胞的方法是。

(3)過程③~⑤中，SgRNA與Cas9蛋白形成復合體，該復合體中的SgRNA可識別并與目標DNA序列特

異性結(jié)合，二者結(jié)合所遵循的原則是o隨后，Cas9蛋白可切割____________序列。

(4)利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除一個長度為1200bp的基因，在DNA水平上判斷基因敲除是否成

功所采用的方法是，基因敲除成功的判斷依據(jù)是o

(5)某種蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人員將該蛋白酶基因插入到CRISPR/Cas9質(zhì)粒中獲得重

組質(zhì)粒，隨后將其導入到大腸桿菌細胞，通過基因編輯把該蛋白酶基因插入到基因組DNA中，構(gòu)建得到能

大量分泌該蛋白酶的工程菌。據(jù)圖簡述CRISPR/Cas9重組質(zhì)粒在受體細胞內(nèi)，將該蛋白酶基因插入到基因

組DNA的編輯過程：o

【答案】(1)DNA連接酶

(2)感受態(tài)細胞法

(3)堿基互補配對原則目標DNA特定的核甘酸序列

(4)DNA分子雜交技術(shù)出現(xiàn)雜交帶

(5)CRISPR/Cas9重組質(zhì)粒在受體細胞內(nèi)進行轉(zhuǎn)錄和表達，轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物是SgRNA,表達的產(chǎn)物是Cas9蛋

白，二者形成復合體,該復合體中的SgRNA可識別并與目標DNA序列特異性結(jié)合,從而插入到基因組DNA

中。

【解析】基因工程技術(shù)的基本步驟包括目的基因的獲取；基因表達載體的構(gòu)建；將目的基因?qū)胧荏w細胞;

目的基因的檢測與鑒定。

(1)基因工程所需的工具酶有限制酶和DNA連接酶，限制酶負責切割，DNA連接酶負責連接，因此為構(gòu)

建CRISPR/Cas9重組質(zhì)粒，需對含有特定sgRNA編碼序列的DNA進行酶切處理，然后將其插入到經(jīng)相同

酶切處理過的質(zhì)粒上，插入時所需要的酶是DNA連接酶。

(2)大腸桿菌是原核生物，屬于微生物，將目的基因?qū)胛⑸锛毎姆椒ㄊ歉惺軕B(tài)細胞法。

(3)根據(jù)題圖可知：在CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)中，SgRNA是根據(jù)靶基因設(shè)計的引導RNA,準確引導

Cas9切割與SgRNA配對的靶基因DNA序列。Cas9能借助SgRNA分子與目標DNA進行特異性結(jié)合的原

因在于SgRNA分子上的堿基序列與目標DNA分子上的堿基序列可以通過堿基互補配對原則實現(xiàn)SgRNA

與目標DNA特定序列的特定識別，進而定位；由此可見，Cas9在功能上屬于限制酶，可切割目標DNA特

定的核昔酸序列。

(4)可利用DNA分子雜交技術(shù)判斷基因敲除是否成功，若出現(xiàn)雜交帶，則說明基因敲除成功。

(5)根據(jù)圖示可知：CRISPR/Cas9重組質(zhì)粒在受體細胞內(nèi)進行轉(zhuǎn)錄和表達，轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物是SgRNA,表達的

產(chǎn)物是Cas9蛋白，二者形成復合體，該復合體中的SgRNA可識別并與目標DNA序列特異性結(jié)合，從而插

入到基因組DNA中。

7.（2021遼寧，24）PHB2蛋白具有抑制細胞增殖的作用。為初步探究某動物PHB2蛋白抑制人宮頸癌細胞

增殖的原因，研究者從基因數(shù)據(jù)庫中獲取了該蛋白的基因編碼序列（簡稱phb2基因），大小為0.9kb

（lkb=1000堿基對），利用大腸桿菌表達該蛋白。回答下列問題：

（1）為獲取phb2基因，提取該動物肝臟組織的總RNA,再經(jīng)過程得到cDNA,將其作為PCR

反應的模板，并設(shè)計一對特異性引物來擴增目的基因。

（2）圖1為所用載體圖譜示意圖，圖中限制酶的識別序列及切割位點見下表。為使phb2基因（該基因序

列不含圖1中限制酶的識別序列）與載體正確連接，在擴增的phb2基因兩端分別引入和

兩種不同限制酶的識別序列。經(jīng)過這兩種酶酶切的phb2基因和載體進行連接時，可選用

（填“E.coliDNA連接酶”或“T4DNA連接酶”）。

相關(guān)限制酶的識別序列及切割位點

名稱識別序列及切割位點名稱識別序列及切割位點

AJAGCTTGJAATTC

HindlllEcoRI

TTCGAfACTTAAfG

CAG；CTGCTGCJAG

PvitllPstI

GTCfGACGAfCGTC

GJGTACCGJGATCC

KpnlBamHI

CCATG^GCCTAGfG

注：箭頭表示切割位點

（3）轉(zhuǎn)化前需用CaCb處理大腸桿菌細胞，使其處于的生理狀態(tài)，以提高轉(zhuǎn)化效率。

（4）將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌接種在含氨葦青霉素的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，隨機挑取菌落（分別編號為1、2、3、

4）培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，用（2）中選用的兩種限制酶進行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)電分離，結(jié)果如圖2,

號菌落的質(zhì)粒很可能是含目的基因的重組質(zhì)粒。

注：M為指示分子大小的標準參照物；小于0.2kb的DNA分子條帶未出現(xiàn)在圖中

（5）將純化得到的PHB2蛋白以一定濃度添加到人宮頸癌細胞培養(yǎng)液中，培養(yǎng)24小時后，檢測處于細胞

周期（示意圖見圖3）不同時期的細胞數(shù)量，統(tǒng)計結(jié)果如圖4。分析該蛋白抑制人宮頸癌細胞增殖可能的原

因是將細胞阻滯在細胞周期的（填“Gi”或"S”或“G2/M”）期。

部Gi期幽S期口也、翔

f50

44

30

G2

20

10

0

對照PHB2

圖4

注：間期包括G1期、S期和G：期注：G,.小俵示G、和M

【答案】（1）逆轉(zhuǎn)錄（2）①.EcoRI②.PvitH③.T4DNA連接酶（3）感受態(tài)（4）

3（5）G2/M

【解析】（1）利用RNA獲得cDNA的過程稱為逆轉(zhuǎn)錄。

（2）根據(jù)啟動子和終止子的生理作用可知，目的基因應導入啟動子和終止子之間.圖中看出，兩者之間存

在于三種限制酶切點，但是由于Kpnl在質(zhì)粒上不止一個酶切位點，所以應該選擇EcoRI和PvitH兩種不同

限制酶的識別序列；根據(jù)PvitH的酶切序列，切出了平末端，所以構(gòu)建基因表達載體時，應該用T4DNA連

接酶連接質(zhì)粒和目的基因。

（3）轉(zhuǎn)化時用CaCL處理大腸桿菌細胞，使其處于感受態(tài)的生理狀態(tài)，以提高轉(zhuǎn)化效率。

（4）由于這些菌落都可以生長在含有氨葦青霉素的培養(yǎng)基中，因此都含有質(zhì)粒，重組質(zhì)粒包含了目的基因

和質(zhì)粒，如果用EcoRI和Pvitll兩種酶切割重組質(zhì)粒電泳后將獲得含有質(zhì)粒和目的基因兩條條帶，由于phb2

基因大小為0.9kb,所以對應電泳圖是菌落3。

（5）比較圖4中Gi期和S期細胞減少，而G2期細胞數(shù)目明顯增多，說明了Gi期和S期細胞可以進入G2

期，而G2期的細胞沒有能夠完成分裂進入Gi期，因此PHB2蛋白應該作用于G2/M期。

【過關(guān)檢測】

1.在基因工程操作中限制酶是不可缺少的工具。下列關(guān)于限制酶的敘述錯誤的是（）

A.限制酶主要是從原核細胞中獲取的

B.每一種限制酶只能識別特定的核甘酸序列

C.限制酶的作用位點是相鄰核昔酸之間的氫鍵

D.同一種限制酶切割不同的DNA分子可產(chǎn)生堿基互補配對的黏性末端

【答案】C

【解析】限制酶主要從原核細胞（細菌）中獲取,A正確;限制酶具有特異性,每一種限制酶只能識別特定的核普

酸序列，并在特定的位點進行切割,B正確;限制酶的作用位點是相鄰核甘酸之間的磷酸二酯鍵,C錯誤;同一種

限制酶切割不同的DNA分子可產(chǎn)生堿基互補配對的黏性末端,D正確。

2.下表為4種限制酶的識別序列和切割位點&表示切割位點），下列敘述正確的是（）

限制酶1一JGATC—

限制酶2—CATG—

限制酶3—GJGATCC—

限制酶4—GGJCGCC—

A.在使用限制酶的同時還需要解旋酶

B.限制酶1和3切割DNA分子產(chǎn)生的黏性末端相同

C.圖中限制酶的識別序列都由4個核甘酸組成

D.限制酶4作用后產(chǎn)生的是平末端

【答案】B

【解析】限制酶能識別雙鏈DNA的特定核甘酸序列并在特定位點進行切割，在使用限制酶時，不需要解旋酶,A

錯誤;限制酶1和3切割DNA分子,產(chǎn)生的黏性末端相同，均為GATC,B正確;限制酶3和4識別的序列分別是

—GGATCC一和一GGCGCC—,均由6個核甘酸組成,C錯誤;限制酶4切割后產(chǎn)生的是黏性末端,D錯誤。

3.以下是幾種不同限制性核酸內(nèi)切酶切割DNA分子后形成的部分片段。下列的敘述中，正確的是（）

①…CTGCA②“C③-TG@-G

…G??,CTTAA…AC-CTGCA

A.以上DNA片段是由4種限制酶切割后產(chǎn)生的

<A.ATT

CTTAAA

B.②片段是在酶切位點為上的限制酶作用下形成的

C.①和④兩個片段在DNA聚合酶的作用下形成的重組DNA分子

D.限制酶和DNA連接酶作用的部位都是磷酸二酯鍵

【答案】D

【解析】分析題圖可知：①④是同一種限制酶切割形成的，具有相同的黏性末端；②經(jīng)過限制酶切割后形

成的是黏性末端；③經(jīng)過限制酶切割后形成的是平末端。圖中①④是同一種限制酶切割形成的，因此①?

④DNA片段是由3種限制酶切割后產(chǎn)生的，A錯誤；切割②片段的限制酶的識別序列為GAATTC,識別位

點為GA之間，B錯誤；由于①④具有相同的黏性末端，所以能用DNA連接酶連接起來，形成重組DNA

分子，C錯誤；限制酶和DNA連接酶作用的部位都是磷酸二酯鍵，其中限制酶能將磷酸二酯鍵切斷，而

DNA連接酶能將磷酸二酯鍵連接起來，D正確。

4.DNA連接酶是基因工程的必需工具，下列有關(guān)DNA連接酶的敘述，正確的是（）

A.DNA連接酶可以將任意的兩個DNA片段連接成一個重組DNA分子

B.DNA連接酶發(fā)揮作用時需要識別特定的脫氧核甘酸序列

C.DNA連接酶可以催化兩個脫氧核甘酸之間磷酸二酯鍵的形成

D.E.coliDNA連接酶和T4DNA連接酶都能連接黏性末端和平末端

【答案】C

【解析】DNA連接酶可以連接互補配對的黏性末端或平末端，而非任意的兩個DNA片段,A錯誤;DNA連接

酶發(fā)揮作用時不需要識別特定的脫氧核甘酸序列,B錯誤;DNA連接酶可以催化兩個脫氧核甘酸之間磷酸二

酯鍵的形成,C正確;E.co〃DNA連接酶僅能連接黏性末端,T4DNA連接酶能連接黏性末端和平末端,D錯誤。

5.作為基因工程的運輸工具一載體，必須具備的條件及理由對應錯誤的是（）

A.能夠在宿主細胞中穩(wěn)定保存并大量復制，以便提供大量的目的基因

B.具有一個至多個限制酶切割位點，以便于目的基因的插入

C.具有某些標記基因，以便目的基因能夠準確定位與其結(jié)合

D.對宿主細胞無傷害,以免影響宿主細胞的正常生命活動

【答案】C

【解析】載體必須能夠在宿主細胞中穩(wěn)定地保存下來并大量復制，以便通過復制提供大量的目的基因,A正確;

載體必須具有一個至多個限制酶切割位點，以便于目的基因的插入,B正確;載體必須具有某些標記基因，以便

于重組后進行重組DNA分子的篩選,C錯誤;載體對宿主細胞無傷害，以免影響宿主細胞的正常生命活動,D正

確。

6.[2023寧夏石嘴山高三月考]在重組DNA技術(shù)中，將外源基因?qū)胧荏w細胞，通常利用質(zhì)粒作為載體。下列關(guān)

于質(zhì)粒的敘述，正確的是（）

A.質(zhì)粒是一種只存在于原核細胞中的、結(jié)構(gòu)簡單的環(huán)狀DNA分子

B.質(zhì)粒的復制和表達過程遵循中心法則和堿基互補配對原則

C.外源基因只有通過質(zhì)粒整合到受體細胞的DNA中才能表達

D.大多數(shù)天然質(zhì)粒都不需要人工改造，可以直接作為載體使用

【答案】B

【解析】質(zhì)粒是存在于許多原核細胞以及真核細胞中的具有自主復制能力的小型環(huán)狀DNA分子,A錯誤;質(zhì)

粒的復制和表達遵循中心法則，也遵循堿基互補配對原則,B正確;質(zhì)粒能獨立自主復制并穩(wěn)定存在，因此含有

外源基因的質(zhì)粒在受體細胞中可以獨立表達，外源基因不一定非要整合到受體細胞的DNA中才能表達,C錯

誤;天然的質(zhì)粒不能直接被用作載體,基因工程中真正被用作載體的質(zhì)粒都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進行過人

工改造的,D錯誤。

7.下列關(guān)于“DNA的粗提取與鑒定”實驗的敘述，錯誤的是（）

A.該實驗不能選擇哺乳動物成熟的紅細胞作為實驗材料

B.將洋蔥研磨液置于4。。冰箱中能防止DNA被降解

C.該實驗中加入體積分數(shù)為70%的預冷酒精可用來析出、純化DNA

D.用二苯胺試劑鑒定DNA需要進行沸水浴加熱

【答案】C

【解析】由于哺乳動物成熟的紅細胞中沒有細胞核和細胞器，因此不能作為提取DNA的材料,A正確;洋蔥研

磨液放在4℃的冰箱中可以使酶的活性降低，防止DNA降解,B正確;提純DNA時，加入的是預冷的、體積分

數(shù)為95%的酒精溶液,C錯誤;在沸水浴的條件下,DNA遇二苯胺會呈現(xiàn)藍色,D正確。

8.如圖為“DNA的粗提取與鑒定”實驗的部分操作流程。下列相關(guān)敘述正確的是（）

研磨液

95%

冷酒才

新鮮洋蔥&買濾液

圖1圖2圖3

A.將圖1中的研磨液過濾后保留沉淀

B.圖2過程，用玻璃棒進行快速交叉攪拌會使DNA析出更快

C.圖2析出得到的白色絲狀物只能溶于2mol/L的NaCl溶液

D.圖3對提取后的DNA進行鑒定，兩支試管中均要加入二苯胺試劑

【答案】D

【解析】圖1中新鮮洋蔥研磨后DNA存在于研磨液中,過濾后應保留濾液,A錯誤;圖2過程，用玻璃棒要輕輕

攪拌且攪拌要沿同一方向進行，防止DNA分子被弄斷,B錯誤;圖2析出得到的白色絲狀物主要成分是

DNA.DNA在2mol/L的NaCl溶液中溶解度高，并不是只能溶于2mol/L的NaCl溶液,C錯誤;圖3對提取后

的DNA進行鑒定，作為對照,兩支試管中均要加入二苯胺試劑,D正確。

8.下列有關(guān)基因工程工具的敘述，錯誤的是（）

A.限制性內(nèi)切核酸酶只能用于切割獲取目的基因

B.能連接黏性末端的DNA連接酶不一定能連接平末端

C.DNA連接酶縫合兩個黏性末端時有氫鍵的重新連接

D.基因工程中使用的載體有質(zhì)粒、某些動植物病毒及噬菌體

【答案】A

【解析】限制性內(nèi)切核酸酶不僅能用于切割獲取目的基因，也能切割質(zhì)粒,A錯誤;從大腸桿菌中分離的E.coli

DNA連接酶僅能連接黏性末端，而從T4噬菌體中分離的T4DNA連接酶既可以連接黏性末端，也可以連接平

末端，因此能連接黏性末端的DNA連接酶不一定能連接平末端,B正確;DNA連接酶縫合兩個黏性末端時有堿

基的互補配對，因此有氫鍵的重新連接,C正確;質(zhì)粒、某些動植物病毒及噬菌體都是基因工程中使用的載體,D

正確。

9.現(xiàn)有一長度為3000堿基對（bp）的線性DNA分子，用限制性內(nèi)切核酸酶完全酶切后，進行凝膠電泳，使酶切產(chǎn)

物分開。用酶H單獨酶切，結(jié)果如圖1;用酶B單獨酶切，結(jié)果如圖。用酶H和酶B同時酶切，結(jié)果如圖3o該

DNA分子的結(jié)構(gòu)及其酶切圖譜是（）

二

2000bp2000bp

1000bp