生物信息與數(shù)據(jù)處理第三節(jié)基因組分析策略和技術(shù)1

克隆克隆（cloning）：涉及將特定DNA片段插入類似于染色體的載體（vector）中，載體使它們能在活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制。由于所有片段的拷貝都是相同的，所以叫分子克隆（molecularclone），這些片段可純化并可直接用于研究或儲(chǔ)存在文庫中以便進(jìn)一步分析。一分子生物學(xué)工具基因文庫（geneticlibrary）：所有克隆到載體上的基因的集合形成基因文庫（geneticlibrary）。一個(gè)理想的基因文庫應(yīng)包括一個(gè)生物體DNA中每個(gè)片段的拷貝。基因組等價(jià)物（geneticequivalent）在這樣一個(gè)完整的基因組文庫中克隆的數(shù)目（用基因組的大小除以平均片段長度）稱為基因組等價(jià)物（geneticequivalent）。克隆過程的隨機(jī)性使某些片段將被克隆多次而另一些可能在基因組等價(jià)物中并不出現(xiàn)。增加基因組文庫中克隆的數(shù)量將增加任一給定DNA片段都至少含有其一個(gè)拷貝的可能性。具有4個(gè)或5個(gè)基因組等價(jià)物的文庫平均每個(gè)DNA片段有4或5個(gè)拷貝，基因組任一特定部分有至少一個(gè)拷貝的可能性為95%。分子克隆技術(shù)流程2基因組文庫chromosomesonificationcloningGenomicDNAlibraryVector3cDNA文庫（cDNAlibrary）所有蛋白編碼區(qū)域共有的特征是它們被核糖體翻譯之前全轉(zhuǎn)化成mRNA。逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）將mRNA轉(zhuǎn)化成互補(bǔ)DNA（cDNA），然后克隆成為文庫。由于細(xì)胞通常只轉(zhuǎn)錄具有重要功能的基因的mRNA，所以展示cDNA文庫往往可以抓住基因組的關(guān)鍵部分。在任一類型的器官或細(xì)胞文庫中，cDNA的相對(duì)豐度可以指示一個(gè)特定基因的表達(dá)量。cDNA文庫cloningGenomicDNAlibraryVectormRNAcDNAReversetranscriptase

4聚合酶鏈反應(yīng)PolymeraseChainReaction，ＰＣＲ背景知識(shí)

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction,PCR)：是一種對(duì)特定的DNA片段在體外進(jìn)行快速擴(kuò)增的方法。

1985年Kary.Mullis及同事創(chuàng)立。隨后借助于熱穩(wěn)定性TaqDNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)，1987年KaryMullis等完成了自動(dòng)化操作裝置，使PCR技術(shù)進(jìn)行實(shí)用階段。1993年度，KaryMullis因發(fā)明了“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”而獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。PCR反應(yīng)系統(tǒng)模板DNA：要擴(kuò)增的基因片段即目的基因一對(duì)引物：引導(dǎo)DNA鏈的合成，“引子”四種三磷酸脫氧核苷：合成DNA鏈的原料熱穩(wěn)定的DNA聚合酶：催化DNA合成適當(dāng)?shù)木彌_體系：鎂離子等模板DNA

PCR反應(yīng)必須以DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增,一般反應(yīng)中的模板數(shù)量為102-105

個(gè)拷貝對(duì)于單拷貝基因,需要0.1μg的人基因組DNA引物兩段與待擴(kuò)增靶DNA序列互補(bǔ)的寡核苷酸片段，一般15－25堿基長

ATCGGCTAAGCTATCCGT四種磷酸脫氧核苷酸(dNTP)合成DNA鏈所需要的原料:

dATP

dGTP

dCTP

dTTPTaqDNA聚合酶

TaqDNA聚合酶是從嗜熱水生菌中提純出來的，是一種耐高溫的DNA聚合酶方法三個(gè)基本步驟:(1)變性：目的雙鏈DNA片段在94℃下解鏈(2)退火：兩種引物在適當(dāng)溫度(50℃左右)下與模板上的目的序列通過堿基配對(duì)結(jié)合(3)延伸：在TaqDNA聚合酶作用下，以目的DNA為模板進(jìn)行DNA合成由這三個(gè)基本步驟組成一輪循環(huán),理論上每一輪循環(huán)將使目的DNA擴(kuò)增一倍,這些經(jīng)合成產(chǎn)生的DNA又可作為下一輪循環(huán)的模板,所以經(jīng)25-35輪循環(huán)就可使DNA擴(kuò)增達(dá)100萬倍。變性模板DNAPCR反應(yīng)－－變性PCR反應(yīng)－－退火退火PCR反應(yīng)－－引物延伸引物延伸PCR擴(kuò)增－－30個(gè)循環(huán)PCR結(jié)果－－

凝膠電泳二DNA序列測(cè)定1Sanger雙脫氧末端終止法測(cè)序原理

在DNA聚合酶的作用下，以脫氧核苷三磷酸（dNTP）為鏈延伸劑，2‘,3’-雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP）為鏈終止劑，對(duì)所測(cè)定的DNA序列進(jìn)行循環(huán)聚合反應(yīng)。

ddNTP與dNTP之間的差別僅在于其脫氧核糖的3‘位少一個(gè)羥基，前者因缺乏3’羥基而不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵。因此，當(dāng)DNA鏈末端堿基為ddNTP時(shí)，該鏈的延伸反應(yīng)便終止在適當(dāng)?shù)臈l件下，所測(cè)DNA聚合反應(yīng)產(chǎn)生一系列多核苷酸鏈，它們的長度呈梯度分布，差別為一個(gè)核苷酸不同長度的多核苷酸鏈通過凝膠電泳，按分子量被分離出來，基于對(duì)其長度和標(biāo)記物的共同識(shí)別，可依次讀出所測(cè)DNA的每個(gè)核苷酸1-1所示）。

“雙脫氧末端終止”的含義2雙脫氧鏈終止法對(duì)DNA多聚酶的要求

高活性無5’－3’外切核酸酶活性無3’－5’外切核酸酶活性

klenow多聚酶噬菌體T7編碼的“Sequenase”（測(cè)序酶）3第一代DNA自動(dòng)測(cè)序

自動(dòng)熒光毛細(xì)管凝膠電泳測(cè)序儀代表：安瑪西亞公司MegaBACE1000

96個(gè)電泳讀長高達(dá)500-600bp

日分析能力達(dá)1000個(gè)樣品自動(dòng)熒光垂直板凝膠電泳測(cè)序儀

代表：ABI公司377型垂直板自動(dòng)測(cè)序儀

96個(gè)泳道讀長高達(dá)700-800bp

日分析能力達(dá)300個(gè)樣品

電泳，看誰跑得快熒光檢測(cè)探頭

短片段先檢測(cè)到長片段后檢測(cè)到4Solexa

測(cè)序原理Solexa測(cè)序技術(shù)屬于新一代測(cè)序技術(shù)（第二代），其核心思想是邊合成邊測(cè)序（sequencingbysynthesisorligation）。即生成新DNA互補(bǔ)鏈時(shí)，要么加入的dNTP通過酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)催化底物激發(fā)出熒光，要么直接加入被熒光標(biāo)記的dNTP，在合成或連接生成互補(bǔ)鏈時(shí)，釋放出熒光信號(hào)。通過捕獲光信號(hào)并轉(zhuǎn)化為一個(gè)測(cè)序峰值，獲得互補(bǔ)鏈序列信息。可以在DNA擴(kuò)增表面讀取數(shù)千萬個(gè)32-40bp長的片段。GenomeAnalyzer

ClusterStation

以邊合成邊測(cè)序?yàn)闃?biāo)志的新一代測(cè)序技術(shù)的代表有四種測(cè)序平臺(tái)：

Roche(454)GSFLXsequcncer

Illuminagenomeanalyzer(Solexa)AppliedBiosystems

SOLiDsequencer

HeliScopeSequencer

Solexa公司在2006年被Illumina公司以6.15億美元的高價(jià)收購，并將Solexa測(cè)序儀命名為Illuminagenomeanalyzer。

1)添加接頭：

利用物理方法將待測(cè)樣品DNA打碎，在單鏈DNA碎片兩端加上接頭5Solexa測(cè)序流程2).表面結(jié)合(ClusterStation)

Solexa測(cè)序時(shí)利用微注射系統(tǒng)將已經(jīng)加過接頭的待測(cè)片斷和接頭隨機(jī)添加到玻璃FlowCell內(nèi)，每一個(gè)FlowCell又被分成8條lane，每條Lane的內(nèi)表面上能以共價(jià)鍵的形式隨機(jī)固定單鏈接頭序列和帶接頭的單鏈待測(cè)DNA片斷。

3).橋型擴(kuò)增循環(huán)獲得多拷貝待測(cè)DNA片斷

在Flowcell內(nèi)加入未被標(biāo)記的dNTP和酶起始固相橋型擴(kuò)增；所有單鏈橋型待測(cè)片段被擴(kuò)增成雙鏈橋片斷，通過變性，釋放出互補(bǔ)的單鏈，錨定到附近的固相表面；通過不斷循環(huán)，將會(huì)在Flowcell的固相表面上獲得上百萬條成簇分布的雙鏈待測(cè)片斷。4).測(cè)序：加入DNA聚合酶和被熒光標(biāo)記的dNTP

和接頭引物進(jìn)行擴(kuò)增，在每一個(gè)測(cè)序列簇延伸互補(bǔ)鏈時(shí)，每加入一個(gè)被熒光標(biāo)記的dNTP就能釋放出相應(yīng)的熒光，測(cè)序儀通過捕獲熒光信號(hào)，并通過計(jì)算機(jī)軟件將光信號(hào)轉(zhuǎn)化為測(cè)序峰，從獲得待測(cè)片段的序列信息。三大規(guī)模測(cè)序的策略1工作框架圖與精細(xì)圖工作框架圖:

目的：獲得基因組的基本結(jié)構(gòu)信息（如GC組成、重復(fù)序列）、基因的識(shí)別和功能分類、SNP的發(fā)現(xiàn)等測(cè)序量：4－5倍基因組大小的覆蓋度序列覆蓋率：90%以上，準(zhǔn)確度不低于99%。精細(xì)圖目的：對(duì)重要功能基因及調(diào)控序列進(jìn)行精確的染色體定位，為基因的功能研究奠定基礎(chǔ)測(cè)序量：8－10倍基因組大小的覆蓋度序列覆蓋率：99%以上，序列準(zhǔn)確度不低于99.99％。2全基因組霰彈法與逐步克隆法全基因組霰彈法（WholeGenomeShot-gun)逐步克隆法（ClonebyClone）全基因組霰彈法霰彈法(Shot-gun)，亦稱“鳥槍法”，用于全基因組隨機(jī)測(cè)序方法：借助物理或化學(xué)手段，將整個(gè)基因組隨機(jī)打斷成一定大小的片段進(jìn)行測(cè)序，再根據(jù)序列間的重疊關(guān)系進(jìn)行計(jì)算機(jī)排序和組裝，確定它們?cè)诨蚪M中的位置優(yōu)點(diǎn)：速度快，簡(jiǎn)單，成本較低缺點(diǎn)：序列的拼接組裝比較困難，在重復(fù)序列較多的區(qū)域難度更大逐步克隆法以物理圖譜為基礎(chǔ)、以大插入片斷克隆為單位的定向測(cè)序策略方法：構(gòu)建以染色體為單位的遺傳圖譜，再利用高覆蓋度的大片段基因組文庫(BAC、PAC等)獲得精細(xì)的物理圖；選擇合適的BAC或PAC克隆進(jìn)行亞克隆測(cè)序，得到一條完整的BAC序列；參照物理圖譜，將相互關(guān)聯(lián)、部分重疊的BAC克隆連成一個(gè)大的重疊群(Contig)。優(yōu)缺點(diǎn)：技術(shù)難度較高，尤其是大片段基因組文庫和精細(xì)物理圖譜的構(gòu)建技術(shù)性極強(qiáng)；費(fèi)用高、費(fèi)時(shí)………ATGCCGTAGGCCTAGCTAGGCCTAGCTCGGA……

………ATGCCGTAGGCCTAGCTCGGA……基因組DNABAC文庫根據(jù)物理圖譜正確定位的BAC或contig用于霰彈法測(cè)序的候選克隆用于霰彈法測(cè)序的亞克隆測(cè)序并組裝完整的基因組序列逐步克隆法（ClonebyClone）

全基因組霰彈法（WholeGenomeShot-gun)基因組DNA

霰彈法克隆測(cè)序并進(jìn)行全基因組序列組裝完整的基因組序列BACbyBACWholeGenomeShotgun…thesequencingofthehumangenomeislikelytobetheonlylargesequencingprojectcarriedtocompletionbythemethodsdescribedinthisissue.MaynardV.Olson,Themaps:Clonebyclonebyclone,Nature409,816-818(2001)

兩種大規(guī)模基因組測(cè)序策略的比較

項(xiàng)目

策略全基因組霰彈法逐步克隆法

遺傳背景不需要需要（需構(gòu)建精確的物理圖譜）速度快慢費(fèi)用低高計(jì)算機(jī)性能高（以全基因組為單位進(jìn)行拼接）低（以BAC為單位進(jìn)行拼接）適用范圍工作框架圖精細(xì)圖代表測(cè)序物種果蠅、擬南芥、水稻人、線蟲3逐步克隆法（ClonebyClone)物理圖譜的構(gòu)建大片段克隆的篩選霰彈法測(cè)序與“工作框架圖”的構(gòu)建序列的全組裝與“完成圖”構(gòu)建A物理圖譜的制作遺傳圖譜是根據(jù)DNA重組原理，用遺傳學(xué)距離來排定含有插入片段克隆群次序的圖譜，它所顯示的是基因組內(nèi)基因與專一的多態(tài)性DNA路標(biāo)（Marker）的相對(duì)位置物理圖譜是直接檢測(cè)DNA標(biāo)記在染色體上實(shí)際位置的圖譜，是把克隆群中的DNA片段按其在基因組上的實(shí)際物理位置進(jìn)行排序a.物理圖的種類主要有以下四類：限制性作圖（RestrictionMapping）:描述以稀有酶切位點(diǎn)為生物學(xué)界標(biāo)的順序和距離，形成基因組或染色體區(qū)域上的酶切圖譜可把DNA定位在100kb-1Mb范圍內(nèi)熒光標(biāo)記原位雜交作圖（FluorescentinsituHybridization,FISH）:

使用熒光原位雜交技術(shù)確定含有路標(biāo)的DNA片段在染色體上的區(qū)帶位置與分布

DNA片段可被定位在2-10Mb的范圍內(nèi)依靠重疊克隆群的基因組作圖（Clone-basedMapping）:根據(jù)克隆之間的重疊順序構(gòu)建重疊群（Contig），繪制物理連鎖圖通過粘粒重疊克隆群把DNA定位在小于2Mb的范圍內(nèi)序列標(biāo)簽位點(diǎn)作圖（SequenceTaggedSite,STS）是從基因組上篩選特異序列作為路標(biāo)平均100kb一個(gè)

b序列標(biāo)簽位點(diǎn)（STS）作圖STS圖譜:

是最基本和最為有用的染色體物理圖譜之一，STS（SequenceTaggedSite)本身是隨機(jī)地從人類基因組上選擇出來的長度在200～300bp左右的特異性短序列（每個(gè)STS在基因組中是唯一的，STS圖譜就是以STS為路標(biāo)（平均每100Kb一個(gè)），將DNA克隆片段有序地定位到基因組上。STS的來源:

隨機(jī)基因組序列表達(dá)基因序列，如EST

遺傳標(biāo)記序列，如微衛(wèi)星標(biāo)記有關(guān)STS的信息可在基因組數(shù)據(jù)庫GDB中找到http://gdbwww.gdb.org物理圖譜構(gòu)建的步驟確定各STS序列及其在基因組中的位置大插入片段基因組文庫的構(gòu)建（BAC文庫）以特定STS為標(biāo)記篩選并定位克隆含有STS的克隆在基因組中排序基因組數(shù)據(jù)庫（GDB）中至少含有24568個(gè)STS路標(biāo)信息

B大片段克隆的篩選－－BAC文庫的構(gòu)建NotI、SacI脈沖場(chǎng)凝膠電泳得200Kb左右的大片段DNA

純化后與載體連接

電轉(zhuǎn)化，將連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞插有外源DNA片段的BAC載體在含有氯霉素的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)每一個(gè)菌落為帶有相同外源DNA片段的單克隆BAC克隆的篩選“STS-PCR反應(yīng)池”方案篩選種子克隆特定的STS標(biāo)記

相互間具有重疊片段的BAC克隆根據(jù)STS信息組裝成contig，并定位于基因組上Contig每一個(gè)菌落為帶有相同外源DNA片段的單克隆“反應(yīng)池”方法將待篩文庫中的克隆分別保存于96孔保菌板中，每孔為一個(gè)單克隆每組“反應(yīng)池”：即由1個(gè)“超級(jí)池”、8個(gè)“板池”、8個(gè)“行池”和12個(gè)“列池”所組成。以8板為單位將96孔板分成若干組，每組中，所有克隆混合組成1個(gè)“超級(jí)池”（SuperPool），每板的克隆分別混合組成8個(gè)“板池”（PlatePool）,8個(gè)板的各行、列克隆分別混合組成8個(gè)“行池”（RowPool）和12個(gè)“列池”(ColumnPool)。篩選：通常分三輪進(jìn)行第一輪，對(duì)所有組的“超級(jí)池”進(jìn)行PCR，篩選出陽性“超級(jí)池”第二輪，對(duì)含有陽性“超級(jí)池”的組內(nèi)的“板池”、“行池”和“列池”進(jìn)行28個(gè)PCR擴(kuò)增，根據(jù)各板、行、列的陽性結(jié)果進(jìn)行三維交叉定位，得到若干個(gè)候選克隆第三輪，隨機(jī)選取幾個(gè)候選克隆，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，挑出STS的陽性克隆延伸克隆的篩選－－指紋圖譜（FPC）法

STS的密度尚未達(dá)到繪制高精度物理圖譜的要求，且在基因組中的分布不均勻，造成很多區(qū)域沒有陽性克隆覆蓋,形成空洞。需用指紋圖譜（FPC法）或末端序列（WalkingbyEndSequence)步移等手段對(duì)種子克隆進(jìn)行延伸，形成連續(xù)克隆群。利用延伸方法篩選得到的克隆稱為延伸克隆。Contig1Contig2重疊序列重疊序列延伸引物篩選到的延伸克隆>20kb~300bpMolecularweightmarkerevery5thlane

BACclones培養(yǎng)提取BACDNAHindIII完全酶切

1%瓊脂糖凝膠電泳

指紋圖譜法

（WalkingbyFingerprintingdatabase）

挑取靠近空洞（gap）的種子克隆，酶切構(gòu)建其指紋圖譜，在FPC數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)，搜索含有此克隆的重疊克隆群信息，從中確定覆蓋空洞區(qū)域的克隆，達(dá)到延伸目的。HindIII完全酶切HindIII完全酶切FPC數(shù)據(jù)庫中比對(duì)CloneACloneBCloneCCABa隨機(jī)測(cè)序BacClone:100-200kbShearedDNA:1.0-2.0kbSequencingTemplates:RandomReadsC霰彈法測(cè)序組裝phred

讀取程序：實(shí)現(xiàn)堿基識(shí)別和錯(cuò)誤率估算，生成*.phd文件phd2fasta轉(zhuǎn)化程序：

將*.phd文件轉(zhuǎn)化為FASTA格式的*.seq,*.seq.qual的文件cross_match

載體標(biāo)記程序：將*.seq文件中的載體順序標(biāo)記為Xphrap

拼接程序：拼接各短片段，并進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估consed

校對(duì)程序：查看拼接結(jié)果，并結(jié)合人工校對(duì)b序列組裝－－I數(shù)據(jù)處理與拼接>rax_539101.y1.abdCHROMAT_FILE:rax_539101.y1.abdPHD_FILE:CCCCCCCCTCAAGTAAAATACTATCTCGGAACGACATAACGTTTTAGATTCGTCATAGTCTTTCCTGTACAACTCATTGAGCCTCACGCCGTTGTCCATTTGCTGTTTGCCATTTAGTCGTACGTCGGTGGGACAGGGGAGTCGGATGTATAGCAGGTTCTTTACAATATTGCAGCACCATGGGTTCGCCAGAGAGTTGTGGGTCTTCTATTGATCATAGATATCTAGCGATGCCTAAGTGCATGGTTTA1）Phred－－把峰圖文件轉(zhuǎn)化成序列文件（*.seq文件），并賦予質(zhì)量值（*.seq.qual文件）*.seq.qual文件>203c04_0102.g1.abi68217430ABI000000000000000002121292626

26

32334748485151

514642353434

34

34

344242425656

56

56484844444242

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42353131

31

313542485651514242

42

42404537374036453535

3532454542423737

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37444456564242363535

35

35

353737

37405151

51515656

56

56

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56424446434240404545

3535

3529291729314039454042404237353535

3537424244464343

434242

42

42

42

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4237424444563737

37

37

37

37465144434242353630333338383636

36

364242443737

3737

37312929

2924242828

283642444242

42352929

29

29

29

29422935292525322725161717242429292329334040

40

402525000000000000000000000000000000000000000000000000000>203C04_0411.Z1.ABDCHROMAT_FILE:203C04_0411.Z1.ABDPHD_FILE:203C04_0411.Z1.ABD.phd.1TIME:SunFeb600:20:412000XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXCTGGGGGGCTCTTTTCTCCAGTTTTAAAGGCCTTGGAGCTCCGTTGATCCATTAACGACCTTCGAAAAGGGGGAGAACAGGATCAGGTAAATATGAGTGGTACCCTTATCAACCATTTTAAAGATCTTGCCCCCCTTTAAATCAGAGATGTATAAGCACAAAGGGGTTTTTCTGCCAACATAGTGTTCACAAAAAAAGGTATATAACCCTCAGCAGTTCGAAAAATATAGCCTCGGAATCACACGAGTATCGGCATTATATAAACCACGTCTAATGTAAGCACT2）cross_matchcross_match

載體標(biāo)記程序：

將*.seq文件中的載體順序標(biāo)記為X生成文件：*.seq.screen

ContigReadsassembly測(cè)序拼接，拼接成各短片段－－reads重疊群（contig）3）phrap4)consed用來觀看和編輯phrap拼接結(jié)果的圖形工具Consen