天然和重組蛋白結(jié)構(gòu)測(cè)定第一節(jié)X-射線晶體結(jié)構(gòu)分析

I.概念—基本原理1).X-射線2).X-射線衍射3).周期函數(shù)與富里哀()定理4).晶體5).天然和重組蛋白質(zhì)X-射線晶體結(jié)構(gòu)分析的特殊性第一節(jié)X-射線晶體結(jié)構(gòu)分析(續(xù)1)II.蛋白質(zhì)結(jié)晶和晶體生長(zhǎng)1).對(duì)原材料的要求2).晶體生長(zhǎng)的生物化學(xué)條件3).晶體生長(zhǎng)的物理?xiàng)l件4).技術(shù)和方法5).蛋白質(zhì)晶體的鑒定第一節(jié)X-射線晶體結(jié)構(gòu)分析(續(xù)2)III.衍射數(shù)據(jù)收集1).晶體的收集和處理2).X-射線源的選擇3).衍射線記錄裝置及其使用方法4).衍射數(shù)據(jù)收集的全自動(dòng)化考慮第一節(jié)X-射線晶體結(jié)構(gòu)分析(續(xù)3)IV.確定相位1).數(shù)據(jù)的統(tǒng)一和還原2).同晶置換法3).分子置換法4).差值電子密度法5).多波長(zhǎng)反常散射法6).全自動(dòng)化數(shù)據(jù)處理和位相計(jì)算第一節(jié)X-射線晶體結(jié)構(gòu)分析(續(xù)4)V.電子密度圖詮釋1).電子密度修飾2).分辨率3).分析電子密度圖4).全自動(dòng)化程序發(fā)展前景第一節(jié)X-射線晶體結(jié)構(gòu)分析(續(xù)5)VI.結(jié)構(gòu)模型精化1).R因子2).限制性最小二乘修正3).全自動(dòng)化軟件4).結(jié)構(gòu)模型表達(dá)X-ray研究蛋白質(zhì)的3-D結(jié)構(gòu)x-ray照射結(jié)晶，產(chǎn)生布拉格繞射，得到繞射分析圖振幅amplitude相角α由電腦分析繞射圖，可得繞射波的強(qiáng)度Ｉ＋結(jié)構(gòu)因子F(structurefactor)經(jīng)過Forier變換之後多張電子密度圖(electrondensitymap)比較第二節(jié)核磁共振波譜的溶液結(jié)構(gòu)解析I.概述---蛋白質(zhì)溶液三級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定1).蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息2).核磁共振的波譜信息3).由波譜參數(shù)提取蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息4).由核磁共振數(shù)據(jù)計(jì)算蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)第二節(jié)核磁共振波譜的溶液結(jié)構(gòu)解析(續(xù)1)II.基本的多維核磁共振實(shí)驗(yàn)1).二維同核(1H-1H)核磁共振實(shí)驗(yàn)2).二維異核(1H-15N/13C)核磁共振實(shí)驗(yàn)3).三維異核(1H-13C-15N)核磁共振實(shí)驗(yàn)4).四維異核(1H-13C15N)核磁共振實(shí)驗(yàn)5).TROSY類型的多維核磁共振實(shí)驗(yàn)第二節(jié)核磁共振波譜的溶液結(jié)構(gòu)解析(續(xù)2)III.多維核磁共振波譜解析簡(jiǎn)介1).核磁共振波峰的序列指認(rèn)2).立體定向(stereospecific)指認(rèn)3)NOE交叉峰的指認(rèn)及峰強(qiáng)度的正確測(cè)定測(cè)量方法LauemethodRotating-crystalmethodPowdermethod

Method(X-ray)λ(晶體)θ接收訊號(hào)Laue連續(xù)波長(zhǎng)固定平面底片Rotating-crystal固定可變動(dòng)(旋轉(zhuǎn))圓柱狀底片powder固定可變動(dòng)圓柱狀底片Lauemethod由科學(xué)家VonLaue所設(shè)計(jì)第一種被用來測(cè)量繞射點(diǎn)的方法2dsinθ=nλ連續(xù)波長(zhǎng)晶體固定平面底片Rotating-crystalmethod多用在大型晶體(如蛋白質(zhì))上在晶體繞射時(shí)進(jìn)行旋轉(zhuǎn)固定波長(zhǎng)晶體旋轉(zhuǎn)圓柱狀底片Powdermethod原理與Rotating-crystal相似結(jié)晶為粉末狀回流程圖固定波長(zhǎng)晶體角度變動(dòng)圓柱狀底片布拉格繞射圖回流程圖核磁共振(NMR)波譜學(xué)原理及其應(yīng)用第一章緒言1.1回顧:NMR現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)于1945年，發(fā)展迅速，已成為當(dāng)代研究物質(zhì)結(jié)構(gòu)最有力的工具。1946年哈佛大學(xué)Purcell小組和斯福大學(xué)Block小組幾乎同時(shí)觀測(cè)了石蠟中質(zhì)子的信號(hào)，1952年獲諾貝爾物理獎(jiǎng)。1951年發(fā)現(xiàn)化學(xué)位移現(xiàn)象。1952年Hahn等發(fā)現(xiàn)自旋偶合現(xiàn)象，顯示NMR技術(shù)可用來研究分子結(jié)構(gòu)。1958年第一臺(tái)30MHz(CW-30MHz)。1965年提出快速FT變換方法。1966年R.R.Ernst等實(shí)現(xiàn)了FT-NMR實(shí)驗(yàn)。將信號(hào)采集由頻率域→時(shí)域，使信號(hào)累加變得容易，大大提高NMR靈敏度，13C核的測(cè)量成為可能，這是一次革命。利用不同的脈沖組合來加工核自旋體系的信息，獲得特定的分子結(jié)構(gòu)信息：馳豫時(shí)間，共振峰的分類（DEPT，1NEPT）1971年J.J.Jeener首次引入二維譜的概念。1974年R.R.Ernst小組首次成功地實(shí)現(xiàn)二維實(shí)驗(yàn)，NMR進(jìn)入全新時(shí)代。上世紀(jì)80年代是NMR迅速發(fā)展的十年。1991年R.R.Ernst本人獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。1.2儀器的基本構(gòu)造DataprocessingrfconsoleTransmitterReceiverMagnetSampletubeProberfpulseB0Sampletubeinsidecoil

FTSpectrumFIDNMR發(fā)展的里程碑YearDevelopmentNature1970FTNMRInstrumental1975SuperconductingmagnetsInstrumental19802DNMRMethodological1985ProteinstructuredeterminationMethodological1990Isotopelabeling/multidimensionalNMRMethodological1990PulsedfieldgradientsInstrumental/Methodological1995NMRscreeningMethodological1997TROSYMethodological1998LC-NMR/LCMS-NMRInstrumental2000CryoprobesInstrumentalpeakE0

B0nodetroughEBt0

ifabscissascaleistimeifabscissascaleislength1.3電磁輻射的性質(zhì)ElectromagneticwavewithelectricvectorEandmagneticvectorB

RadiationWavelength,(nm)Frequency,(Hz)Energy(kJ/mol)Cosmicrays<10-3>3x1020>1.2x108Gammarays10-1-10-33x1018-3X10201.2x106-1.2x108X-rays10-10-13x1016-3x10181.2x104-1.2x106Farultraviolet200-101.5x1015-3x10166x102-1.2x104ultraviolet380-2008x1014-1.5x10153.2x102-6x102visible780-3804x1014-8x10141.6x102-3.2x102Infrared3x104-7801013-4x10144-1.6x102Farinfrared3x105-3x1041012-10130.4-4Microwaves3x107-3x1051010-10124x10-3-0.4Radiofrequency1011-3x107106-10104x10-7-4x10-3Electromagneticspectrum波實(shí)際上是由二個(gè)正交(互相垂直)的彼此完全相同的波組成的。其中一個(gè)描述輻射的電場(chǎng)矢量(E)，在一個(gè)平面內(nèi)振蕩，而另一個(gè)波描述磁場(chǎng)矢量(B)，在垂直于電場(chǎng)的平面內(nèi)振蕩。波可用二個(gè)獨(dú)立的量，波長(zhǎng)(

)和最大振幅(圖中的E0和B0)來表征。電磁輻射以固定的速度傳播，可用頻率

來描述波，頻率是相鄰兩個(gè)波之間的距離t0

的倒數(shù)。

t0的單位是秒，

的單位赫茲(Hz)

在t0時(shí)間內(nèi)，電磁波傳播的距離為

。

C=?t0

對(duì)某一特定的波，其波長(zhǎng)和頻率不是二個(gè)互為獨(dú)立的量，而是互為反比例的關(guān)系。高頻輻射具有短的波長(zhǎng)，而低頻輻射則具有長(zhǎng)的波長(zhǎng)。

電磁波除了波動(dòng)性外，還表現(xiàn)出粒子的某些行為。光子最重要的類粒子性質(zhì)是它的能量(E)。每一個(gè)光子具有分立的能量，它與頻率成正比關(guān)系。這種關(guān)系可表示如下：

E=h

式中h－普朗克常數(shù)，其值為6.63x10-27爾格．秒對(duì)NMR的目的來說，我們特別感興趣的是射頻輻射(rf)，其頻率范圍與收音機(jī)和電視機(jī)的接收頻率相同。通常采用頻率為200-750MHz的波段。表中能量標(biāo)尺的低能端，恰好是我們實(shí)現(xiàn)NMR實(shí)驗(yàn)所需要的能量。第二章原子核的磁性2.1原子核的結(jié)構(gòu)化合物是由分子組成，分子本身是原子的聚集體。每一個(gè)原子都有若干帶負(fù)電荷的電子。電子圍繞一個(gè)體積極小的帶正電荷的原子核運(yùn)動(dòng)。99.9%以上的原子的質(zhì)量都集中在原子核上，核只占原子體積的1/1012。2.1.1原子核的組成原子核是由原子和中子組成的。原子核中質(zhì)子的數(shù)目(Z代表原子序數(shù))，決定原子的特征及其核電荷。在元素周期表中，每一個(gè)元素的原子序數(shù)表示在化學(xué)符號(hào)的右邊，左上角的角碼是同位素的質(zhì)量數(shù)(A)，它是Z和N的整數(shù)和。

A=Z+N2.1.2核自旋質(zhì)子是一種轉(zhuǎn)動(dòng)著的帶電荷的粒子(Z=1)，故有磁矩。磁矩只有兩種可能的取向，在無外磁場(chǎng)時(shí)，這兩種取向的能量是簡(jiǎn)并的，習(xí)慣上采用核自旋量子數(shù)m來表征。如對(duì)一個(gè)質(zhì)子，m=+?或-?。把這種核描述為1/2的核自旋(I)。核電荷帶正電，故核磁矩沿磁場(chǎng)方向(m=+?)排列的核，其能量最低。B0

m=+?m=-?中子不帶電，也有磁矩，并且自旋I=?。在磁場(chǎng)中，它也有兩種取向，對(duì)中子來說，由于

取負(fù)值，故穩(wěn)定的方向?qū)?yīng)于m=-?。原子ZX中I與Z和m的關(guān)系原子序數(shù)Z質(zhì)量數(shù)I實(shí)例偶偶06C8O16S奇奇1H9F15P7NI=?偶奇6CI=?

5BI=3/2奇偶整數(shù)1H7NI=1121632m11931151311214核自旋為零的核，其I=0，因此不能用NMR來檢測(cè)。2.1.3核自旋的多重度I=1/2的原子核在磁場(chǎng)中給出兩個(gè)自旋取向。I>1/2的原子核可取兩個(gè)以上的自旋態(tài)?？赡茏孕龖B(tài)(即不同的m值)的總數(shù)(多重度)僅取決于I值。多重態(tài)=2I+1(能級(jí)的數(shù)目)在這些2I+1個(gè)態(tài)(能級(jí))中，每一個(gè)態(tài)具有它自己的量子數(shù)m，m=-1，-1+1，…I-1，I。例如對(duì)于I=?，多重度是2，即m=?和m=-?；對(duì)于I=1，多重度是3，即m=-1，0，+1。核I多重度m值11B3/24-3/2,-?,?,3/212C01014N13-1,0,117O5/26-5/2,-3/2,-?,?,+3/2,+5/231P1/22-?,?P

B0→2.1.4核的角動(dòng)量和磁矩

根據(jù)經(jīng)典圖象，原子核取球形，繞自己的軸轉(zhuǎn)動(dòng)。因此，許多原子核具有內(nèi)稟角動(dòng)量PP=I(I+1)?

?=h/2π，h＝planck常數(shù)

I為角動(dòng)量量子數(shù)，簡(jiǎn)稱核自旋，

I=0，?，2/3，2…核1H2H10B11B12C13C14N15N16O17Ospin1/2133/201/211/205/2P與之相對(duì)應(yīng)的磁矩

，有如下關(guān)系式：

=P

是比例常數(shù)，稱磁旋比

=I(I+1)?

I=0,=0觀測(cè)不到NMR信號(hào)對(duì)大多數(shù)的原子核

與P同向少數(shù)情況下如15N，29Si，

與P反向2.1.5在靜磁場(chǎng)中原子核的行為

方向量子化一個(gè)I0原子核，置于靜磁場(chǎng)B0中，P方向量子化，如圖所示：m=+?m=-?PZ=??PZ=-??m=+1m=0m=-1PZ=?PZ=0PZ=-?PZ=m?

m

磁量子數(shù)，或稱方向量子數(shù)取m＝I，I－１，．．．I中任何一個(gè)數(shù)值，共有(2I+1)個(gè)不同的m值。對(duì)13C，1H核I=?，mZ=+?，mZ=-?；對(duì)2H，14N核I=1，mZ=+1，-1。

方向量子化

Z=m?m=+?()m=-?()z,BO

自旋為?的核在磁場(chǎng)中的兩個(gè)進(jìn)動(dòng)錐體經(jīng)典表示法，核偶極子繞Ｚ軸（與靜磁場(chǎng)方向一致）進(jìn)動(dòng)。它的行為如同陀螺一樣，進(jìn)動(dòng)頻率（或稱Larmor頻率）

L正比與靜磁場(chǎng)強(qiáng)度B0。

L=

對(duì)于進(jìn)動(dòng)著的核，核偶極子進(jìn)動(dòng)的角度只能取某一確定的數(shù)值，如I=?的質(zhì)子，角度是54。44’。

2πB02.1.6核在磁場(chǎng)中的能量

當(dāng)一磁性核質(zhì)子置于磁場(chǎng)B0中時(shí)，磁矩

與B0相互作用，其作用能E有E=-B0=-ZB0

對(duì)具有(2I+1)個(gè)可能取向的原子核，有(2I+1)個(gè)能級(jí)又稱為核塞曼(Zeeman)能級(jí)E=-m?

B0m=-?()E

=+?

?B0m=-1m=+?()E

=-?

?B0m=+1E-1=

?B0m=0E+1=-

?B0E0=0E0I=?1H,13CI=12H,14N

對(duì)于1H和13C，I=?，有兩個(gè)能級(jí)；對(duì)于2H和14N，I=1，有三個(gè)能級(jí)，如上圖所示

E

E2EB0B1B2m=+?()m=-?()0

兩個(gè)相鄰能級(jí)的能級(jí)差為

E=

?B0

所以

E正比于BO2.17能級(jí)的布居數(shù)(population)

在宏觀的樣品中，在熱平衡時(shí)，在不同的能級(jí)中，磁性核是如何分布的呢？這可用Boltzmann來回答

式中N

代表上能級(jí)的粒子數(shù)，N

代表較低能級(jí)的粒子數(shù)，K

波爾茲曼常數(shù)，T絕對(duì)溫度。N

N

=e-E/K

T

1-EK

T1-=K

T

?B0

例：溫度25℃（298K），磁場(chǎng)強(qiáng)度為5.87T時(shí)，求出1H核在上下能級(jí)各占多少？解：利用方程式只有兩個(gè)自旋態(tài)N

(m=-?)＝1-N

(m=+?)

故N

(m=-?)=0.49999和N

(m=+?)=0.50001N(m=-?

)N(m=+?

)=exp[EKT]=exp[1.66x10-25J1.38x10-23JK-1298K]=0.99996

1H的兩個(gè)自旋態(tài)布居數(shù)相差極其微小的，相差的數(shù)量級(jí)為20ppm，對(duì)其它原子核，相差更小。與其它技術(shù)，如IR和UV光譜相比，是造成NMR靈敏度相對(duì)較低的原因。z,BO

m=+?m=-?N

N

M02.18宏觀磁化強(qiáng)度從經(jīng)典圖象出發(fā)，I=?，如1H，13C，位于雙錐面上的核繞靜磁場(chǎng)Z進(jìn)動(dòng)。將樣品中所有的核磁矩的Z分量相加得（沿磁場(chǎng)方向）宏觀磁化強(qiáng)度M0。在脈沖NMR實(shí)驗(yàn)中，M0起著重要的作用。第三章NMR實(shí)驗(yàn)的基本原理3.1共振條件以氯仿(CHCl3)溶液中質(zhì)子(1H)為例。在磁場(chǎng)中，

1H的能級(jí)圖如下所示E-?=+?

?B0E+?=-?

?B0EBB00E=?1質(zhì)子在靜磁場(chǎng)中的能級(jí)差

當(dāng)頻率

1滿足?1=E時(shí)，能級(jí)間發(fā)生躍遷，

E=E-?-E+?=??B0+??B0=?B0?1=?B0

L=1=

B0

即當(dāng)射頻場(chǎng)的頻率與核磁場(chǎng)中的拉摩爾進(jìn)動(dòng)頻率匹配時(shí)，這時(shí)發(fā)生共振。低能級(jí)的磁性核吸收一個(gè)輻射量子躍遷至較高能級(jí)；同時(shí)，位于高能級(jí)的核釋放出能量回到低能級(jí)。每次躍遷都伴隨著自旋方向的變化。

2π

躍遷選擇規(guī)律：

m=±1

稱為單量子躍遷，即在相鄰的兩個(gè)能級(jí)之間躍遷。BEB00m=-1m=+1m=0E-1=

?B0E0=0E+1=-

?B014N(I=1)在靜磁場(chǎng)中的能級(jí)差1H和13C在不同靜磁場(chǎng)中的共振頻率B0[T]共振頻率[MHz]1H13C1.416015.11.888020.12.119022.632.3510025.154.7020050.35.6725062.97.0530076.49.40400100.611.74500125.714.09600150.93.2脈沖傅立葉變換NMR方法脈沖傅立葉變換方法，其主要目的是提高核磁共振儀的靈敏度，實(shí)驗(yàn)時(shí)間短，便于進(jìn)行信息的加工。用射頻脈沖激勵(lì)與傅立葉變換。在脈沖方法中，樣品中所有的質(zhì)子(或者所有的13C核)都同時(shí)被射頻脈沖所激發(fā)，現(xiàn)在要問，這種脈沖的組成即如何產(chǎn)生的？一個(gè)有一定寬度(tp)的射頻方形脈沖的頻譜中包含全部頻率成分。但是各頻率分量的幅度不均勻，射頻頻率f1最強(qiáng)，然后在f1兩邊幅度逐漸衰減，它的頻譜是連續(xù)的tpf1f單個(gè)射頻的脈沖tp選的足夠小，在f1附近獲得較均勻的頻譜。tp~10s，可獲得最大FID信號(hào)。3.3馳豫核自旋系統(tǒng)由于受外界作用離開平衡狀態(tài)以后能夠自動(dòng)地向平衡狀態(tài)恢復(fù)，這個(gè)過程稱為馳豫過程。引入兩個(gè)參數(shù)T1和T2，T1是描述自旋與晶格(周圍介質(zhì))相互作用，因此稱為自旋-晶格馳豫時(shí)間；T2描述自旋-自旋相互作用，因此稱為自旋-自旋馳豫(或橫向馳豫)時(shí)間。它們可以用來研究物質(zhì)相互作用的性質(zhì)。脈沖核自旋系數(shù)FT激勵(lì)響應(yīng)FID波譜脈沖激勵(lì)的系統(tǒng)可用各種脈沖研究分子中各種基團(tuán)單獨(dú)的馳豫時(shí)間，從而提供了分子動(dòng)力學(xué)的信息，可了解分子中各基團(tuán)的排列，相互作用的強(qiáng)弱，已成為NMR中必不可少的參數(shù)。3.4化學(xué)位移及其表示法3.4.1化學(xué)位移的定義根據(jù)NMR共振條件

L=

B0

當(dāng)施加靜(外)磁場(chǎng)B時(shí)，B可誘導(dǎo)分子中的電子產(chǎn)生一個(gè)附加的的磁場(chǎng)B’，B’的方向可于外靜場(chǎng)方向相同或相反，而B’的大小與外磁場(chǎng)B成正比，故與磁矩相互作用總的有效磁場(chǎng)為:Beff=(1-)H

稱為屏蔽常數(shù)，與磁性和所處的化學(xué)環(huán)境有關(guān)，而與外磁場(chǎng)無關(guān)。

2π

這時(shí)核磁共振的條件應(yīng)寫為

=(1-)B0一般

>0，||?1。

是描述孤立原子核性質(zhì)的常數(shù)。

與化合物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)有關(guān)，對(duì)處在不同環(huán)境中的同一種原子核，它的值是不同的?？梢姺肿踊蛟又械拇判院擞捎谄帘涡?yīng)，使其NMR頻率偏離于裸體核的NMR頻率，此稱為化學(xué)位移。

2π3.4.2化學(xué)位移的表示方法

在實(shí)際中，把化學(xué)位移寫成不依賴于磁場(chǎng)或頻率的相對(duì)數(shù)值的形式。定義化學(xué)位移是相對(duì)于某個(gè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行測(cè)量的：

=

單位是ppm，

值與儀器條件無關(guān)。實(shí)驗(yàn)中所用標(biāo)準(zhǔn)樣品應(yīng)當(dāng)是穩(wěn)定的，它的化學(xué)位移不依賴溫度和濃度。對(duì)質(zhì)子和13C來說，常用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是TMS(四甲基硅烷)。它的譜線出現(xiàn)在場(chǎng)強(qiáng)最高區(qū)。設(shè)它的共振點(diǎn)為零。B測(cè)-B標(biāo)B標(biāo)x1063.4.3樣品處理樣品分析前，必須精制充分，不應(yīng)含有鐵和其它雜質(zhì)。黏度不要過高（影響馳豫時(shí)間），黏度越大，分辨率越差，樣品可適度稀釋來提高分辨率。3.4.4溶劑對(duì)樣品要有足夠的溶解度：對(duì)1H譜一般需要5mg，13C譜最好用10~15mg。與樣品不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。溶劑的吸收峰對(duì)樣品信號(hào)沒有干擾。3.4.5標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

目前最常用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是TMS[(CH3)4Si]。在大部分有機(jī)溶劑中有很好的溶解度。TMS為球形分子，所有質(zhì)子的化學(xué)環(huán)境相同。TMS信號(hào)一般位于核磁共振圖譜最高場(chǎng)區(qū)(右側(cè))的單峰。TMS的化學(xué)位移被規(guī)定為

0.00，其它有機(jī)物質(zhì)的共振峰大多在此峰的左邊(即

為正值)。另外TMS的沸點(diǎn)為27℃，測(cè)試后很容易除去。TMSDDS第四章影響化學(xué)位移的因素與各類氫核的化學(xué)位移4.1化學(xué)位移與結(jié)構(gòu)的關(guān)系4.1.1電子效應(yīng)誘導(dǎo)效應(yīng)分子中某一氫核的化學(xué)位移與該核外層的電子云密度有很大的關(guān)系，電子云密度越大，所產(chǎn)生的感應(yīng)磁場(chǎng)越大，核的實(shí)受磁場(chǎng)越弱，即受到的屏蔽作用越大。通常把電負(fù)性引起的去屏蔽作用叫做誘導(dǎo)效應(yīng)。鹵甲烷δCH3I2.16CH3Br2.68CH3Cl3.05CH3F4.26電負(fù)性遞增去屏蔽遞增b.共軛效應(yīng)

氧、氮等雜原子可于雙鍵、苯環(huán)進(jìn)行p

共軛，故在連有這些雜原子的共軛體系中，要同時(shí)考慮由于電負(fù)性和共軛效應(yīng)所引起的電子云密度分布的變化。例如：下列化合物氫核的化學(xué)位移與共軛體系的電子云轉(zhuǎn)移方向呈有規(guī)律的相關(guān)性。4.1.2鄰近基團(tuán)的磁各向異性

大量資料表明，某些化學(xué)鍵和基團(tuán)呈現(xiàn)各向異性，它們可對(duì)不同空間位置上的質(zhì)子施加不同的影響，即它們的屏蔽作用是有方向性的。芳環(huán)苯環(huán)上六個(gè)sp2雜化碳原子共平面，六個(gè)

軌道則可兩面交蓋形成大

共軛體系。此大

共軛體系可在外加磁場(chǎng)的作用下產(chǎn)生抗磁環(huán)流（見下圖）。

HHx++苯環(huán)的屏蔽作用在苯環(huán)的外周區(qū)域感應(yīng)磁場(chǎng)的方向與外加磁場(chǎng)的方向相同（順磁屏蔽），苯環(huán)質(zhì)子正好位于去屏蔽區(qū)，實(shí)受磁場(chǎng)強(qiáng)度為外加磁場(chǎng)和感應(yīng)磁場(chǎng)之和，這些質(zhì)子可在較低的磁場(chǎng)下發(fā)生共振（故此區(qū)域標(biāo)以“-”號(hào)），其δ值比較大。在苯環(huán)上下方感應(yīng)磁場(chǎng)與外加磁場(chǎng)相反（抗磁屏蔽），位于苯環(huán)上下方的質(zhì)子的實(shí)受磁場(chǎng)為外加磁場(chǎng)與感應(yīng)磁場(chǎng)的差，這些質(zhì)子必須在較高的磁場(chǎng)下才能發(fā)生核磁共振（故此區(qū)域標(biāo)以“+”號(hào)），其δ值比較小，甚至是負(fù)值。十八輪烯烯質(zhì)子:δ7.9~7.0其它大

共軛體系的化合物和苯環(huán)的情況類似。如十八輪烯，外質(zhì)子的化學(xué)位移為δ9.28，而環(huán)內(nèi)質(zhì)子為δ-2.9。b.雙鍵雙鍵的磁各向異性羰基和碳碳雙鍵與苯環(huán)相似。在其平面上下方均有一個(gè)錐形屏蔽區(qū)（用“＋”號(hào)表示的區(qū)域），其它區(qū)域?yàn)槿テ帘螀^(qū)（用“－”號(hào)表示的區(qū)域）。叁鍵a和單鍵b的磁各向異性abc.叁鍵和單鍵叁鍵互相垂直的兩個(gè)

軌道電子可以繞

鍵產(chǎn)生環(huán)電流，在外加磁場(chǎng)作用下可以產(chǎn)生與叁鍵平行但方向與外加磁場(chǎng)相反的感應(yīng)磁場(chǎng)，即叁鍵兩端位于屏蔽區(qū)，叁鍵的上下為去屏蔽區(qū)。單鍵也有各向異性，其方向與雙鍵相似。單鍵的磁各向異性對(duì)直立和平伏氫的影響在比較具有六元環(huán)結(jié)構(gòu)的甾體和萜類成分的氫譜時(shí)發(fā)現(xiàn)，直立鍵上質(zhì)子的化學(xué)位移一般要比平伏鍵小0.05~0.8。這種差別實(shí)際就是由單鍵的各向異性作用引起的。d.氫鍵氫鍵的形成往往使該質(zhì)子信號(hào)向低場(chǎng)移動(dòng)，這是因?yàn)闅滏I的締合作用減少了質(zhì)子周圍的電子云密度。締合又可分為分子內(nèi)締合和分子間締合。前一種締合與濃度幾乎無關(guān)；后者取決與濃度的高低，濃度愈高，締合愈甚。故在實(shí)驗(yàn)操作上可采用稀釋法區(qū)分分子內(nèi)和分子間締合。e.溶劑效應(yīng)實(shí)驗(yàn)證明，同一個(gè)樣品在不同溶劑中測(cè)定的核磁共振譜圖會(huì)有所差異，這是因?yàn)橛行┤軇┤绫?、吡啶等本身存在親核或親電子中心，可與樣品形成“瞬間復(fù)合物”，改變了有關(guān)質(zhì)子的實(shí)際存在狀態(tài)，從而使其化學(xué)位移有所漂移。4.2各類氫核的化學(xué)位移4.2.1sp3雜化碳上的氫sp3雜化碳上的氫，即飽和烷烴(基)中的氫的化學(xué)位移一般在δ0~2之間，且大致按環(huán)丙烷<CH3<CH2<CH的順序依次增大。但當(dāng)與氫相連的碳上同時(shí)連有強(qiáng)吸電子原子，如氧、氯、氮等，或者鄰位有各向異性基團(tuán)，如雙鍵、羰基、苯基等時(shí)，它們的化學(xué)位移值會(huì)大幅度增加，往往超出此范圍。一些sp3雜環(huán)碳上氫核的化學(xué)位移一些環(huán)狀化合物sp3雜環(huán)碳上氫核的化學(xué)位移4.2.2

sp２雜化碳上的氫sp2雜化碳上的氫核是指烯氫和苯環(huán)上的氫，烯氫的化學(xué)位移在δ4.5~7.0之間，芳?xì)浼?/p>

，

-不飽和羰基系統(tǒng)中

位信號(hào)在δ6.0~8.0之間，醛基氫在δ9.0~10.0之間。一些烯氫的化學(xué)位移芳環(huán)和芳雜環(huán)也是由sp2雜化碳組成的。由于受到各向異性作用，芳環(huán)上的氫多在較低場(chǎng)出現(xiàn)核磁共振信號(hào)。一些芳環(huán)和芳雜環(huán)氫的化學(xué)位移4.2.3

sp雜化碳上的氫sp雜化碳多指炔烴，有時(shí)也指疊烯碳，如丙二烯。炔氫及炔鍵上甲基的化學(xué)位移一般都在δ1.7~2.3之間。炔鍵易與其它不飽和鍵及帶有孤對(duì)電子的雜原子發(fā)生共軛，故炔鏈上的取代情況對(duì)炔氫的化學(xué)位移影響較大。一些炔氫的化學(xué)位移4.2.4活潑氫活潑氫不僅容易與帶有孤對(duì)電子的雜原子締合，而且可以與介質(zhì)中的活潑氫進(jìn)行動(dòng)態(tài)交換?；衔铴腞OH0.5~5.0ArOH(游離)4.0~8.0ArOH(分子內(nèi)締合)10.0~15.0ROOH6.5~9.5烯醇(分子內(nèi)締合)15.0~19.0RCOOH10.0~13.5一些氫鍵質(zhì)子的化學(xué)位移范圍第五章自旋－自旋偶合5.1引言本章介紹原子核之間的磁相互作用，稱之為自旋-自旋偶合，標(biāo)量偶合或者稱為J-偶合。這種磁相互作用使液態(tài)乙醇（CH3CH2OH）產(chǎn)生8個(gè)共振（原來是3個(gè)共振峰）。5.2自旋－自旋偶合對(duì)NMR譜的影響自旋－自旋偶合會(huì)引起NMR譜線的進(jìn)一步分裂，如CH3CH2OH，CH3峰分裂為三重峰，相對(duì)強(qiáng)度為1:2:1，CH2峰分裂為四重峰，相對(duì)強(qiáng)度為1:3:3:1。例：H13CO2-

1H和13C：I=?在無偶合的情況下：在13C-1H偶合的情況：1H-13C標(biāo)量偶合對(duì)1H的能級(jí)和譜線的影響自旋自旋A和X能級(jí)圖和波譜(a)Ａ核與磁場(chǎng)Ｂ0的相互作用(b)X核與磁場(chǎng)Ｂ0的相互作用(c)標(biāo)量偶合J=JAX>05.3多重峰(1)AX自旋體系I=?，如H13CO2-。(2)二個(gè)不等性核(I=?)(AMX)的偶合JAM>JAX>0。mMmX-JAKMKK=M,X+?+?-?(JAM+JAX)+?-?-?(JAM-JAX)-?+?+?(JAM-JAX)-?-?+?(JAM+JAX)Spin-spincouplinginanAMXspinsystemNMRspectrumofnucleusAinAX2spinsystem.ThetripletarisesfromthefourcombinationsofthetwoXspins,asindicated.DrawnforJAX>0.(3)與二個(gè)等性核(Ｉ＝?)AX2的偶合NMRspectrumofnucleusAinAX3spinsystem.ThequartetarisesfromtheeightcombinationsofthethreeXspins,asindicated.DrawnforJAX>0.(4)與三個(gè)等性核(Ｉ＝?)AX3的偶合m1m2m3-JAXmi+?+?+?-3/2JAX+?+?-?+?-?+?-?JAX-?+?+?+?-?-?-?+?-?+?JAX-?-?+?-?-?-?+3/2JAXSpin-spincouplinginanAX3spinsystem(5)與n個(gè)等性核(Ｉ＝?)AXn的偶合-?AX-?-?+?+?+?(6)Ｉ>?核的偶合例1:14NH(I=1)例2:11B(I=3/2)5.4等性核

有二類等性核:化學(xué)等性和磁等性在CH2F2分子中，二個(gè)質(zhì)子具有同樣的化學(xué)位移，每一個(gè)質(zhì)子對(duì)Fa和Fb具有相同的偶合常數(shù)。在CH2=CF2中，順式和反式1H-19F偶合常數(shù)不同?；瘜W(xué)等性質(zhì)子磁等性質(zhì)子5.5長(zhǎng)程偶合

跨越四根鍵及更遠(yuǎn)的偶合稱為長(zhǎng)程偶合，偶合常數(shù)一般小于1Hz。但是，對(duì)于連結(jié)偶合核的鍵在空間中呈固定‘W’構(gòu)型的分子。在‘W’構(gòu)型中，偶合常數(shù)3J(H，H)為正號(hào)。非剛性分子如丙烷及其衍生物，4J(H，H)值小于0.5Hz，并且只有在高分辨的條件下才能觀察到。烯丙基化合物中質(zhì)子之間的四鍵偶合強(qiáng)烈地依賴于C－H鍵與雙鍵π軌道的軸之間的角度φ.烯丙基偶合的符號(hào)均為“－”。φ=0°:最大（-3Hz）φ=90°:最小（-0.5Hz）五鍵或大于五鍵的偶合只有在很少數(shù)的情況下才能觀測(cè)到。如不飽和化合物萘，苯甲醛和在allenes及alkynes。對(duì)于home-allylicprotonpair

來說，常常發(fā)現(xiàn)非常大的偶合常數(shù)，在不飽和五元雜環(huán)中，觀測(cè)到相隔四根單鍵和一個(gè)雙鍵的偶合5J。

第六章13CNMR譜

有機(jī)化合物中，13C化學(xué)位移的范圍比1H要大得多，δ=0～200ppm之間，因此，13C譜線的分辨相當(dāng)好。13C譜在研究有機(jī)分子結(jié)構(gòu)方面比1HNMR重要得多。對(duì)于分子中的每一個(gè)碳來說，經(jīng)常只給出相應(yīng)的一條譜峰。6.1烷烴和環(huán)烷烴

以甲基環(huán)己烷為例，氫譜δ～0.8－2ppm

，分辨不好且呈寬峰。碳譜δ=50～60ppm

，分辨良好。烷烴:在烷烴中，某個(gè)13C核的化學(xué)位移依賴于位于α和β位置鄰近碳的數(shù)目，同時(shí)依賴于碳鏈分枝程度，在表中列出某些烷烴的13C化學(xué)位移值?；衔铴?C1)δ(C2)CH4-2.3CH3-CH3

6.5CH2(CH3)216.116.3(CH3-CH2)2

13.124.9CH(CH3)324.623.3C(CH3)4

27.431.4

烷烴的13C化學(xué)位移取代基明顯地影響著化學(xué)位移。如表所示，以丙烷的衍生物為例:H原子被CH3取代α和β-13C核的屏蔽分別降低8.8和8.6ppm。而與之相反，γ-13C核屏蔽增加大約3ppm，(分別稱之為α-，β-和γ-效應(yīng))。α效應(yīng)隨取代基電負(fù)性的增加而增加，F(xiàn)使α－13C核的化學(xué)位移增加～70ppm，CI，Br表現(xiàn)出類似的電負(fù)性關(guān)系，I則為例外。Xδ(Cα)

δ(Cβ)

δ(Cγ)

H16.116.316.1CH324.924.913.1NH344.627.411.5NO277.421.210.8F85.223.69.2Br35.426.112.7I9.026.815.2丙烷衍生物的13C化學(xué)位移

環(huán)烷烴，表中給出某些環(huán)烷烴的δ值。環(huán)丙烷中的13C核具有出乎意料之外的屏蔽作用(正屏蔽)，與1H譜的情況相類似。五元環(huán)以上的其它化合物，13Cδ在24－29ppm之間?；衔铴?/p>

Cyclopropane

-2.8Cyelobutane

22.4Cyclopentane

25.8Cyclohexane

27.0Cycloheptane

28.7環(huán)烷烴的13C化學(xué)位移

6.2烯烴

雙鍵碳核的13C共振，其δ值在100-150ppm之間，表中列出乙烯衍生物13C化學(xué)位移值。對(duì)于烷基取代的乙烯，連有取代基的烯烴13C核，其屏蔽(δ=120至140)低于端基碳(δ=105至120)?；衔?/p>

δ(C1)

δ(C2)δ(C3)

H2C1=C2H2123.5H3C3C1H=C2H2

133.4115.919.9H3CCH=CHCH3(cis)124.211.4H3CCH=CHCH3(trans)125.416.8(H3C)2C=CH2141.8111.324.2Cyclohex-I-ene

127.425.4(C4:23.0)直鏈烯烴的13C化學(xué)位移

Xδ(C1)δ(C2)-H123.5123.5-CH3133.4115.9-CH=CH2137.2116.6-C6H5137.0113.2-F148.289.0-Cl125.9117.2-Br115.6122.1-I85.2130.3-OCH3153.284.1-OCOCH3141.796.4-NO2145.7122.4CN108.2137.5單取代乙烯的13C化學(xué)位移

6.3芳烴(苯，烷基苯，稠環(huán)芳烴)

苯，烷基苯取代，稠環(huán)芳烴，輪烯，其13C信號(hào)的δ值，大約在120至140之間，下面列舉一些常見的芳烴化合物。引入取代基后，13C的化學(xué)位移范圍拓寬，其范圍為δ=100－150ppm。烯烴的化學(xué)位移也落在這個(gè)范圍內(nèi)。有時(shí)這會(huì)給譜線的歸屬帶來困難。表列出某些單取代基苯環(huán)上碳的13C化學(xué)位移。Xδ(C1)δ(C2)δ(C3)δ(C4)-H128.5-CH3137.7129.2128.4125.4-COOH130.6130.1128.4133.7-F163.3115.5131.1124.1-OH155.4115.7129.9121.1-NH2146.7115.1129.3118.5-NO2148.4123.6129.4134.6-I94.4137.4131.1127.4單取代基苯環(huán)的13C化學(xué)位移

6.4烯丙基

在烯丙基中，中心碳核的屏蔽特別低C2:δ=212.6.在烯丙基衍生物中也觀察到類似的效應(yīng)，其中心碳原子核的δ值介于195和215ppm之間，因此兩端13C核其屏蔽大于烯烴的碳原子核。屏蔽值受取代基的影響。當(dāng)四個(gè)氫原子全部被OCH3取代，化學(xué)位移之間的關(guān)系則相反。6.5>C=O和-OH化合物Carbonyl基(酮基和醛基)和-OH基及其衍生物的13C化學(xué)位移位于δ=160－220ppm.在大多數(shù)情況下，這些都是季碳原子，一般信號(hào)強(qiáng)度特別低，這是因?yàn)檫@些季碳有長(zhǎng)的Spin－lattice弛豫時(shí)間T1.這些功能團(tuán)中，低的13C屏蔽主要是來自順磁屏蔽項(xiàng)。

2.3.6.1醛和酮在常見官能團(tuán)中，羰基的碳原子由于其共振峰出現(xiàn)在低場(chǎng)，因此很容易被識(shí)別。羰基碳原子，共振之所以在低場(chǎng)，是因?yàn)棣小，|σpara|大，共振在低場(chǎng)，用中介效應(yīng)也可以解釋。下表中列出一些醛和酮的化學(xué)位移，在醛和酮類中羰基13C核的屏蔽最小，其范圍從δ=190-220ppm。隨著烷基取代基數(shù)目增加，屏蔽進(jìn)一步降低(即δ增大)，二叔丁基酮δ=218.0，而六氯丙酮，δ=175.5ppm，這是兩個(gè)相反的極端情況。

化合物δ(C1)δ(C2)δ(C3)δ(C4)H3C2-C1HO200.531.2H3C-CH2-CHO202.736.75.2(CH3)2CH-CHO204.641.115.5(CH3)3C-CHO205.642.423.4H2C=CH-CHO193.3136.0136.4C6H5-CHO191.0CH3C2OC1H330.7206.7C4H3C3H2C2-OC1H327.5206.335.27.0(CH3)2CHCOCH327.5212.541.618.2(CH3)3CCOCH324.5212.844.326.5(CH3)3CC3OC2(CH3)328.645.6218.0Ph-CO-Ph195.2Cl3C1C2OCCl390.2175.5H2C1=C2H-C3CH3128.0137.1197.525.7

醛和酮的13C化學(xué)位移

2.3.6.2羧酸及其衍生物

在一元羧酸中，羧基13C的屏蔽大于在酮和醛類中羰基13C的屏蔽，其化學(xué)位移δ=160-180ppm。在堿性溶液中，酸變?yōu)轸然x子，會(huì)引起羧基13C核屏蔽降低，同樣也會(huì)引起位于α、β和γ位置上碳核屏蔽降低，另一方面，酰胺(amide)，?；u化物，醚和酐在所有情況下，其屏蔽都大于母體酸。若醋酸中CH3

基氫被甲基(CH3)取代，則羧基13C信號(hào)出現(xiàn)在低場(chǎng)，即δ值較高?；衔铴模–1）δ（C2）C2H3C1OOH176.920.8(pD1.5)a)CH3COO182.624.5(pD8)a)CH3CON(CH3)2170.421.5CH3:35and38.0CH3COCl170.433.6CH3COOCH3171.320.6OCH3:51.5CH3COOCH=CH2167.920.5=CH:141.5=CH2:97.5(CH3CO)2O167.421.8CH3COSH194.532.6醋酸衍生物的13C化學(xué)位移

化合物δ（C1）δ（C2）δ（C3）H-C2H2C1OOH175.720.3C3H3-C2H2-C1OOH179.827.69.0(CH3)2CH-COOH184.134.118.1(CH3)3C-COOH185.938.727.1H2N-CH2-COOH(D2O)pD0.45171.241.5pD12.05182.746.0HO-CH2-COOH(D2O)177.260.4ClCH2-COOH173.740.7Cl3C-COOH167.088.9H2C3=C2H-C1OOH168.9129.2130.8C6H5-COOH168.0α－取代醋酸的13C化學(xué)位移

第七章二維核磁共振譜概述7.1碳原子級(jí)數(shù)的確定碳原子級(jí)數(shù)(CH3,CH2,CH,C)就是碳原子上連氫原子的數(shù)目，即碳譜線的多重性，測(cè)定的方法有：APT法(attachedprotontest)又稱丁調(diào)制法；INEPT法(insensitivenucleienhancedbypolasizationtransfer)不靈敏核的極化轉(zhuǎn)移增強(qiáng)；DEPT法(distortionlessenhancementbypolasizationtransfer)不失真地極化轉(zhuǎn)移增強(qiáng)。不失真指相位不失真。目前DEPT法被普遍采用。

=1/(2J)

=1/(2J)

=1/(2J)

y’

PictorialdepictionoftheDEPTpulsesequence

CH,CH2,CH3信號(hào)強(qiáng)度依賴于

。CH：I=[r(1H)/r(13C)]sin

CH2：I=[r(1H)/r(13C)]sin

CH3：I=[3r(1H)/4r(13C)](sin

+sin3

)

=90

，CH2，CH3曲線通過0，CH曲線達(dá)到最大，因此

2=90

，只能給出CH子譜。

=135

，CH2譜線朝下，CH3，CH譜線朝上。

=45

，季碳不出峰，CH，CH2，CH3譜線朝上。用DEPT方法區(qū)分季碳，CH，CH2和CH3，只需做三個(gè)實(shí)驗(yàn)，

=45

，90

，135

。其實(shí)只需做二個(gè)實(shí)驗(yàn)，

=90

和135

，就可區(qū)CH，CH2，CH3。7.2二維NMR基本原理1971年比利時(shí)科學(xué)家J.J.Jeener首次提出二維譜的思路。1974年-1975年，R.R.Ernst對(duì)二維核磁共振波譜從理論到實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了仔細(xì)的研究。1976年，R.R.Ernst用密度算符對(duì)2DNMR原理進(jìn)行了理論闡述。1976年以后，2DNMR技術(shù)得到了非常迅速的發(fā)展。1979年，2DNMR技術(shù)應(yīng)用與蛋白質(zhì)的研究，2DNMR技術(shù)已經(jīng)成為研究復(fù)雜有機(jī)化合物和生物大分子不可缺少的工具。二維NMR所包含的信息往往從常規(guī)一維NMR實(shí)驗(yàn)匯總不能得到，如2DNMR可以檢測(cè)多量子躍遷（零、雙、叁等），這在任何一維NMR實(shí)驗(yàn)中是無法實(shí)現(xiàn)的。2DNMR引進(jìn)第二個(gè)頻率域，大大增加了NMR譜所包含的信息量。7.32DNMR實(shí)驗(yàn)的基本組成部分

所有的2DNMR實(shí)驗(yàn)在時(shí)間區(qū)域上都可分為四個(gè)時(shí)期，即準(zhǔn)備期、演化期、混合期（也可以沒有）和檢測(cè)期。一維：s(t1)s(F1)二維：s(t1,t2)s(F1,F2)FTFT準(zhǔn)備期演化期混合期檢測(cè)期準(zhǔn)備期：主要任務(wù)使核處于熱平衡狀態(tài)或者在一次采樣之后使自旋恢復(fù)到平衡狀態(tài)。演化期：準(zhǔn)備期建立起來的平衡態(tài)破壞之后核自旋在旋轉(zhuǎn)坐標(biāo)XY平面發(fā)生進(jìn)動(dòng)。進(jìn)動(dòng)的過程一般稱為演化。t1是變化的。混合期：在演化期完成之后，可以選擇測(cè)定已演化的磁化矢量，混合期有可能不存在，它不是必不可少的。檢測(cè)期（t2）：在檢測(cè)期內(nèi)以通常方式檢出FID信息。與t2軸對(duì)應(yīng)的

2

是通常的頻率軸，與t1軸對(duì)應(yīng)的

1是什么，則決定于在演化期是何種過程。7.42DNMR譜的分類

分為三大類1.J分辨譜亦稱為J譜，把化學(xué)位移和自旋偶合的作用分辨開來。2.化學(xué)位移相關(guān)譜（Chemicalshiftcorrelationspectroscopy）是2DNMR的核心，它表明共振信號(hào)的相關(guān)性。有三種位移相關(guān)譜：同核，異核，NOE和化學(xué)交換等相關(guān)譜。3.多量子譜（multiplequantumspectroscopy）Δm>1的整數(shù)，用脈沖序列可檢出多量子躍遷，得到多量子躍遷的二維譜。7.52DNMR譜的表現(xiàn)形式堆積圖等高線圖7.61H-HCOSY譜（同核化學(xué)位移相關(guān)譜）譜圖特征是對(duì)角線上的峰對(duì)應(yīng)一維1H譜，對(duì)角線外的交叉峰在F1和F2域的δ值對(duì)應(yīng)相偶合核的化學(xué)位移，提供通過三鍵偶合的1H-H相關(guān)信息。每個(gè)交叉峰做平行于F1和F2軸的縱線和水平線，得到兩個(gè)相互偶合核的化學(xué)位移。通過交叉峰可以建立各相互偶合1H的關(guān)聯(lián)。COSY譜通常有絕對(duì)值型和相敏型兩種。

7.7HMQC(heteronuclearmultiplequantumcorrelation)

HMQC是1H檢測(cè)的直接的異核化學(xué)位移相關(guān)譜。F2維代表1H的化學(xué)位移，F(xiàn)1維代表

13C的化學(xué)位移，所給出的信息與直接檢測(cè)的CH-COSY譜基本相同。在實(shí)驗(yàn)時(shí)可采用13C去偶和不去偶兩種方式。采用13C去偶時(shí)，13C，1H的交叉峰只出一個(gè)。無13C去偶時(shí)，13C，1H的交叉峰出兩個(gè)，即受13C的偶合作用，與其相連的1H在F1維（13C方向）分裂成兩個(gè)峰，兩峰的距離即是13C，1H偶合常數(shù)。

7.8HMBCHMBC譜是1H檢測(cè)的遠(yuǎn)程的異核化學(xué)位移相關(guān)譜。給出的信息與COLOC譜基本相同。但由于靈敏度的增強(qiáng)，使獲取的可能性和譜峰的可靠性大大增加，現(xiàn)已基本取代直接檢測(cè)的遠(yuǎn)程異核相關(guān)譜，成為結(jié)構(gòu)解析的常用有效手段。HMBC實(shí)驗(yàn)可以不用13C去偶的方式，因?yàn)檫h(yuǎn)程13C，1H之間的偶合常數(shù)較小，在數(shù)字分辨率較低的情況下（二維譜的數(shù)字分辨率均大大低于一維譜）幾乎顯示不出裂分的效應(yīng)。同時(shí)可以區(qū)別直接偶合的13C，1H相關(guān)峰。它們?cè)贖MBC譜中受13C的偶合而產(chǎn)生裂分。

7.9NOESY

NOESY譜：NOESY譜給出的是1H，1H相關(guān)關(guān)系，但這種關(guān)系不是通過化學(xué)鍵來實(shí)現(xiàn)的，而是通過空間距離的遠(yuǎn)近來實(shí)現(xiàn)的，即兩個(gè)氫原子在距離小于5A時(shí)，即可產(chǎn)生NOE相關(guān)峰。NOE相關(guān)峰可以揭示1H之間的空間關(guān)系，故是分子構(gòu)象研究的主要實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，目前多應(yīng)用于多肽及蛋白質(zhì)的構(gòu)象研究中。在多糖的研究中，NOE可幫助確定接點(diǎn)和糖的構(gòu)型，亦可做為構(gòu)象研究的依據(jù)。

第三節(jié)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)I.蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)方法準(zhǔn)確性的評(píng)估II.序列相似性對(duì)比III.蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

1).統(tǒng)計(jì)方法

2).基于已有知識(shí)的預(yù)測(cè)方法

(knowledge-basedmethod)3).混合方法(hybridsystemmethod)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)主要有兩大類方法：（1）理論分析方法通過理論計(jì)算（如分子力學(xué)、分子動(dòng)力學(xué)計(jì)算）進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。（2）統(tǒng)計(jì)的方法對(duì)已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，建立序列到結(jié)構(gòu)的映射模型，進(jìn)而對(duì)未知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)根據(jù)映射模型直接從氨基酸序列預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)。包括：經(jīng)驗(yàn)性方法結(jié)構(gòu)規(guī)律提取方法同源模型化方法III 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

蛋白質(zhì)序列：

↓二級(jí)結(jié)構(gòu)：1、二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)概述蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的基本依據(jù)是： 每一段相鄰的氨基酸殘基具有形成一定二級(jí)結(jié)構(gòu)的傾向。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)問題是模式分類問題二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的目標(biāo)：判斷每一段中心的殘基是否處于

螺旋、

折疊、轉(zhuǎn)角（或其它狀態(tài)）之一的二級(jí)結(jié)構(gòu)態(tài)，即三態(tài)。

基本策略（1）

相似序列→相似結(jié)構(gòu)QLMGERIRARRKKLKQLMGAERIRARRKKLK結(jié)構(gòu)？基本策略（2）

分類分析α螺旋提取樣本聚類分析學(xué)習(xí)分類規(guī)則預(yù)測(cè)….-Gly-Ala-Glu-Phe-….二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的方法大體分為三代：第一代是基于單個(gè)氨基酸殘基統(tǒng)計(jì)分析從有限的數(shù)據(jù)集中提取各種殘基形成特定二級(jí)結(jié)構(gòu)的傾向，以此作為二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的依據(jù)。第二代預(yù)測(cè)方法是基于氨基酸片段的統(tǒng)計(jì)分析統(tǒng)計(jì)的對(duì)象是氨基酸片段片段的長(zhǎng)度通常為11-21片段體現(xiàn)了中心殘基所處的環(huán)境在預(yù)測(cè)中心殘基的二級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)，以殘基在特定環(huán)境形成特定二級(jí)結(jié)構(gòu)的傾向作為預(yù)測(cè)依據(jù)這些算法可以歸為幾類：（1）基于統(tǒng)計(jì)信息（2）基于物理化學(xué)性質(zhì)（3）基于序列模式（4）基于多層神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（5）基于多元統(tǒng)計(jì)（6）基于機(jī)器學(xué)習(xí)的專家規(guī)則（7）最鄰近算法第一代和第二代預(yù)測(cè)方法對(duì)三態(tài)預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確率都小于70%，而對(duì)

折疊預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確率僅為28

48%其主要原因是只利用局部信息第三代方法（考慮多條序列）運(yùn)用長(zhǎng)程信息和蛋白質(zhì)序列的進(jìn)化信息準(zhǔn)確度有了比較大的提高2、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)方法經(jīng)驗(yàn)參數(shù)法蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的組成規(guī)律性比較強(qiáng)三種基本二級(jí)結(jié)構(gòu)平均占氨基酸殘基的85%各種二級(jí)結(jié)構(gòu)非均勻地分布在蛋白質(zhì)中有些蛋白質(zhì)中含有大量的

螺旋如血紅蛋白和肌紅蛋白而一些蛋白質(zhì)中則不含或者僅含很少的

螺旋如鐵氧蛋白有些蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)以

折疊為主如免疫球蛋白例：肽鏈Ala(A)-Glu(E)-Leu(L)-Met(M)傾向于形成

螺旋肽鏈Pro(P)-Gly(G)-Tyr(Y)-Ser(S)則不會(huì)形成

螺旋

每種氨基酸出現(xiàn)在各種二級(jí)結(jié)構(gòu)中傾向或者頻率是不同的例如：Glu主要出現(xiàn)在

螺旋中

Asp和Gly主要分布在轉(zhuǎn)角中

Pro也常出現(xiàn)在轉(zhuǎn)角中，但是絕不會(huì)出現(xiàn)在

螺旋中可以根據(jù)每種氨基酸殘基形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的傾向性或者統(tǒng)計(jì)規(guī)律進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)經(jīng)驗(yàn)參數(shù)法由Chou和Fasman在70年代提出來是一種基于單個(gè)氨基酸殘基統(tǒng)計(jì)的經(jīng)驗(yàn)預(yù)測(cè)方法。 通過統(tǒng)計(jì)分析，獲得的每個(gè)殘基出現(xiàn)于特定二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象的傾向性因子，進(jìn)而利用這些傾向性因子預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

一個(gè)氨基酸殘基的構(gòu)象傾向性因子定義為

Pi=Ai/Ti (i=

,β,c,t) 式中下標(biāo)i表示構(gòu)象態(tài) 如

螺旋、β折疊、轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲等；Ti是所有被統(tǒng)計(jì)殘基處于構(gòu)象態(tài)i的比例；Ai是第A種殘基處于構(gòu)象態(tài)i的比例；Pi大于1.0表示該殘基傾向于形成二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象i，小于1.0則表示傾向于形成其它構(gòu)象。

發(fā)現(xiàn)關(guān)于二級(jí)結(jié)構(gòu)的經(jīng)驗(yàn)規(guī)則 基本思想是在序列中尋找規(guī)則二級(jí)結(jié)構(gòu)的成核位點(diǎn)和終止位點(diǎn)。

掃描輸入的氨基酸序列，利用一組規(guī)則發(fā)現(xiàn)可能成為特定二級(jí)結(jié)構(gòu)成核區(qū)域的短序列，然后對(duì)于成核區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)展，不斷擴(kuò)大成核區(qū)域，直到傾向性因子小于1.0為止。規(guī)則：（i）α螺旋規(guī)則

（ii）β折疊規(guī)則

（iii）轉(zhuǎn)角規(guī)則

(iv)重疊規(guī)則

延伸成核區(qū)延伸

（i）α螺旋規(guī)則沿蛋白質(zhì)序列尋找α螺旋核相鄰的6個(gè)殘基中如果有至少4個(gè)殘基傾向于形成α螺旋，則認(rèn)為是螺旋核。從螺旋核向兩端延伸直至四肽片段的α螺旋傾向性因子的平均值{P

}<1.0為止。將螺旋兩端各去掉3個(gè)殘基剩余部分若長(zhǎng)于6個(gè)殘基，而且{P

}>1.03，則預(yù)測(cè)為螺旋。

延伸螺旋核延伸（ii）β折疊規(guī)則相鄰6個(gè)殘基中若有4個(gè)傾向于形成β折疊，則認(rèn)為是折疊核。折疊核向兩端延伸直至4個(gè)殘基的平均折疊傾向性因子{P

}<1.0。若延伸后的片段的{P

}>1.05，則預(yù)測(cè)為β折疊。（iii）轉(zhuǎn)角規(guī)則轉(zhuǎn)角的模型為四肽

四肽片段Pt的平均值大于100，并且Pt的均值同時(shí)大于P

的均值以及P

的均值，則可以預(yù)測(cè)這樣連續(xù)的4個(gè)殘基形成轉(zhuǎn)角。

則可以預(yù)測(cè)這樣連續(xù)的4個(gè)氨基酸形成轉(zhuǎn)角。(iv)重疊規(guī)則

對(duì)于螺旋和折疊