ICS65.020.01CCSB0523IDB23/T3897—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定起草。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發布機構不承擔識別專利的責任。本文件由黑龍江省農業農村廳提出。本文件起草單位：東北農業大學、黑龍江省綠色食品科學研究院、哈爾濱學院、黑龍江省農業科學本文件主要起草人：胡小梅、李鳳蘭、董士嘉、李孝忠、王浩、谷春濤、高愛麗、孫以新、馮旭、高云飛、虞琦、賀付蒙、田苗。1DB23/T3897—2024基于60Coγ輻射技術創制秸稈降解真菌種質資源篩選鑒定技術規程本標準界定了基于60Coγ輻射技術創制秸稈降解真菌種質資源篩選鑒定技術的術語和定義，規定了秸稈降解真菌創制、突變菌株篩選鑒定、秸稈降解菌株保藏和檔案管理。本文件適用于60Coγ輻射誘變創制秸稈降解真菌種質資源的篩選與鑒定。2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB10252γ輻照裝置的輻射防護與安全規范GB/T17568γ輻照裝置設計建造和使用規范GB/T23874飼料添加劑木聚糖酶活力的測定分光光度法HJ710.11-2014生物多樣性觀測技術導則大型真菌NY/T3494農業生物質原料纖維素、半纖維素、木質素測定SN/T2632微生物菌種常規保藏技術規程3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1秸稈降解真菌能夠將作物秸稈分解、腐化的一類產孢絲狀真菌。4秸稈降解真菌創制4.1菌種來源從自然環境中分離的具有降解秸稈能力的真菌，置于-80℃冰箱凍存備用。4.2培養方法4.2.1培養基4.2.1.1馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）培養基馬鈴薯浸出粉12g，葡萄糖20g，瓊脂15g，去離子水定容至1000mL，121℃滅菌20min。4.2.1.2高粱粒培養基高粱粒5g，去離子水5mL，121℃滅菌20min。2DB23/T3897—20244.2.1.3產酶培養基（MA）十二水磷酸氫二鈉17.907g，硫酸銨1.4g，磷酸二氫鉀2.0g，七水硫酸鎂0.60g，氯化鈣0.60g，尿素0.3g，失水山梨醇單油酸酯聚氧乙烯醚0.5mL，蛋白胨2.0g，微量元素溶液1mL，pH5.5，去離子水定容至1000mL。4.2.1.4微量元素溶液七水硫酸亞鐵0.5g，一水硫酸錳0.16g，七水硫酸鋅0.14g，六水合二氯化鈷0.2g，去離子水定容至100mL，0.22μm無菌濾膜過濾除菌。4.2.2菌種活化將凍存的菌種解凍后在PDA培養基上采用四區劃線方法進行活化，長出單菌落后，備用。4.2.3孢子懸浮液制備將菌種活化后長出的單菌落接種至高粱粒培養基中，30℃培養，菌絲長滿平板48h后，將產生的孢子用無菌0.9%（w/v）生理鹽水洗脫并用四層無菌紗布過濾除去菌絲體，在6000rpm條件下離心20min收集沉淀。將沉淀再用適量生理鹽水重懸后，利用血球計數板計算孢子濃度，并用生理鹽水將孢子濃度稀釋至1×106CFU/mL～1×108CFU/mL。4.3輻射處理4.3.1輻射劑量選擇金屬元素鈷源（60Co）的γ射線進行輻射誘變處理，真菌孢子懸浮液的60Coγ輻射劑量以2000Gy為宜。4.3.2輻射裝置60Coγ輻射裝置應符合GB/T17568的規定。4.3.3輻射方法輻射方法應符合GB10252的規定。5突變菌株篩選鑒定5.1菌株篩選5.1.1篩選指標篩選指標包括菌株致死率、形態指標、纖維素酶和半纖維素酶活力、木質素酶活力、和秸稈降解率。5.1.2致死率誘變結果以致死率表示，致死率按式（1）計算：3DB23/T3897—2024式中：LR—致死率；Cc—陰性對照PDA平板菌落數；CT—試驗組PDA平板菌落數。5.1.3形態指標篩選將輻射誘變后符合致死率≥85%的菌株孢子懸浮液稀釋100倍，取100μL稀釋孢子液涂布在PDA平板上。在28℃下培養至長出菌落，進行形態學觀察，并與誘變前的菌株進行比較，獲得形態上具有差異的突變菌株。5.1.4纖維素酶和半纖維素酶活力測定5.1.4.1內切葡聚糖酶活力取1%（w/v）羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液1.5mL，加入0.5mL稀釋后的粗酶液，50℃水浴條件下孵育30min。采用3,5-二硝基水楊酸（DNS）測定法，加入1.5mLDNS顯色劑。沸水浴5min終止反應，在540nm波長處測定吸光度，三次重復實驗。根據葡萄糖標準曲線計算酶活力，每分鐘水解CMC-Na產生1μmol還原糖所需的酶量定義為1U。對照組中加入沸水浴30min滅活的粗酶液，其它條件均相同，按照式（2）計算酶活力。5.1.4.2外切葡聚糖酶活力取0.1%（w/v）對硝基苯酚纖維二糖苷（pNPC）溶液50μL，加入100μL稀釋后的粗酶液，50℃水浴條件下孵育30min。加入150μL10%Na2CO3溶液終止反應，在420nm波長下測定吸光度，三次重復實驗。根據對硝基苯酚標準曲線計算酶活力，每分鐘水解pNPC產生1μmol對硝基苯酚所需的酶量定義為1U。對照組中加入沸水浴30min滅活的粗酶液，其它條件均相同，按照式（2）計算酶活力。5.1.4.3β-葡萄糖苷酶活力取0.5%（w/v）水楊苷溶液，加入0.5mL稀釋后的粗酶液，在50℃水浴條件下孵育30min。采用DNS測定法，加入1.5mLDNS顯色劑，沸水浴5min終止反應，在540nm波長處測定吸光度，三次重復實驗。根據葡萄糖標準曲線計算酶活力，每分鐘水解水楊苷產生1μmol還原糖所需的酶量定義為1U。對照組中加入沸水浴30min滅活的粗酶液，其它條件均相同，按照式（2）計算酶活力。5.1.4.4木聚糖酶活力按照GB/T23874的規定執行。式中：U—相應纖維素或半纖維素酶活力；m—根據標準曲線方程計算出相應葡萄糖或對硝基苯酚質量（mg）；M—葡萄糖或對硝基苯酚摩爾質量（g/molt—酶解反應時間（min）；1000—轉化因子，1mmol=1000μmol；4DB23/T3897—2024n—樣品總稀釋倍數。5.1.5木質素酶活力測定5.1.5.1漆酶活力取3.3mL100mmol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH4.5），加入0.5mL0.5mmol/LABTS（2,2'-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）溶液，加入200μL粗酶液，混勻。在30℃水浴條件下孵育3min，在420nm（3420=36000L·mol-1·cm-1）處測定吸光度變化，三次重復實驗。每分鐘氧化1μmolABTS所需的酶量為一個酶活單位（U），按照式（3）計算酶活力。5.1.5.2錳過氧化物酶活力取2.5mL50mmol/L琥珀酸-琥珀酸鈉緩沖液（pH4.5），加入0.4mL1.6mmol/LMnSO4溶液，加入1mL粗酶液，加入100μL10mmol/LH2O2溶液，混勻。在37℃水浴條件下孵育3min，在240nm（3240=6500L·mol-1·cm-1）處測定吸光度變化，三次重復實驗。每分鐘氧化1μmolMn2+轉化為Mn3+所需的酶量為一個酶活單位（U），按照式（3）計算酶活力。5.1.5.3木質素過氧化物酶活力取2.5mL250mmol/L酒石酸-酒石酸鈉緩沖液（pH3.0加入0.4mL10mmol/L藜蘆醇（VA加入1mL粗酶液，加入100μL10mmol/LH2O2溶液，混勻。在30℃水浴條件下孵育3min，在310nm（3310=9300L·mol-1·cm-1）處測定吸光度變化，三次重復實驗。每分鐘氧化1μmol的藜蘆醇所需的酶量為一個酶活單位（U），按照式（3）計算酶活力。酶酶式中：U—相應木質素酶活力；△A—t時間內吸光度變化值；l—比色皿厚度（cmt—反應時間（min）；V總—反應體系體積（mL）；V酶—反應中酶液的體積（mL）；5.1.6秸稈降解率選擇纖維素酶活力、半纖維素酶活力和木質素酶活力高（如占前50%）的突變菌株進行秸稈降解率測定。將選取的突變菌株用液體PDA培養基培養至OD600=0.8，離心去上清，用蒸餾水將菌體重懸獲得菌懸液。取烘干的2g秸稈放入50mL經0.22μm的濾膜進行過濾的土壤懸浮液中，然后加入上述調整好的菌液。在15℃條件下培養2周，然后將降解后的秸稈取出放置在80℃中48h烘干。參照NY/T3494，測定秸稈中木質素、纖維素、半纖維素的含量。以第0d為對照組，均進行三次重復。木質素、纖維素、半纖維素的降解率分別按式（456）計算：5DB23/T3897—2024式中：LD—木質素降解率；CD—纖維素降解率；HD—半纖維素降解率；M1—對照組秸稈中木質纖維素含量；M2—處理