埃博拉出血熱檢疫技術(shù)規(guī)范26儀器和設(shè)備6.1PCR擴(kuò)增儀。6.2熒光定量PCR儀。6.3水平電泳儀。6.4凝膠成像儀。6.5普通冰箱和-80℃冰箱。6.6低溫冷凍離心機(jī)(可控溫至4℃,離心速度可達(dá)12000g以上)。6.7二級(jí)生物安全柜。6.8高壓滅菌鍋。6.9微量可調(diào)移液器(2μL,10L,100L,1000L)及配套帶濾芯吸頭。7試劑和材料在檢測(cè)中使用的試劑均為分析純，試驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682的一級(jí)水的要求。7.4三氯甲烷。7.5異丙醇：使用前-20℃預(yù)冷。7.7溴化乙錠(EB):10mg/mL,使用濃度為05temL.7.8TagDNA酵：-20℃保存。7.9dNTPs:含dCTP、dGTP、dATPdITTP各10mmolL的混合物，-20℃保存。7.10AMV逆轉(zhuǎn)錄酶：-20℃保存。7.11瓊脂糖。7.12DNAMarker(100.-20006p)7.14上樣緩沖液。7.152x熒光PCR預(yù)混液。8檢驗(yàn)程序8.1樣品采集、保存及運(yùn)輸樣品的采集按照GB/T18088執(zhí)行。樣品溫度應(yīng)保持在0℃以下。樣品的保存和運(yùn)輸?shù)纳锇踩髤⒄铡恫≡⑸飳?shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例》的有關(guān)要求執(zhí)行8.2實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)組織樣品先去除包膜和其他結(jié)緒組織，選取內(nèi)部實(shí)質(zhì)部分，置研缽中，加入石英砂充分研磨，然后按照1:5比例加入0.1mol/LPBS(pH7.6-pH7.8)。4℃浸泡過(guò)夜或者-20℃反復(fù)凍融2次，每次30min,4℃條件下以8000g離心5min,取上清進(jìn)行后續(xù)操作。液體樣品如血液、尿液、唾液不必經(jīng)過(guò)研磨或凍融處理，直接進(jìn)行后續(xù)操作。不能立即進(jìn)行檢測(cè)3時(shí)，樣本凍存于-70℃左右超低溫冰箱備用。8.2.2病毒核酸提取取滅菌的1.5mL離心管，做好標(biāo)識(shí)。每管加入600μL裂解液，分別加入被檢樣本、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照各200μL,再加人200pL三氧甲烷，緊蓋離心管，混勻器上振蕩混勻15s后室溫靜置5min,于4℃12000g離心15min。取新的滅菌的1.5mL離心管，加入-20℃預(yù)冷400L異丙醇，吸取離心后將各管中的上清液轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的異丙醇中，避免吸出中間層，顱倒混勻。于4℃12000g離心15min,棄上清，倒置于吸水紙上，瀝干液體，加入600μL75%預(yù)冷乙醇，顛倒洗滌。于4℃12000g離心10min,棄上清，倒置于吸水紙上，瀝干液體，室溫干燥5min~10min。加入15μL~20μLDEPC水，溶解管底的RNA,5000g離心5s,冰上保存?zhèn)溆茫糸L(zhǎng)期保存應(yīng)放8.2.2.2核酸提取等效方法埃博拉病毒核酸提取也可以采用等效RNA提取試劑及方法，如采用商品化試劑盒或自動(dòng)化核酸抽提儀和配套核酸抽提試劑進(jìn)行核酸抽提。8.2.3陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照檢測(cè)過(guò)程中分別設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照為根據(jù)埃博拉病毒核苷酸序列通過(guò)基因合成、載體構(gòu)建和體外轉(zhuǎn)錄合成的RNA.以及包含埃博拉病毒NP或GP基因的假病毒，陰性對(duì)照可選擇其他類病毒的核酸樣本，空自對(duì)照為無(wú)菌水作為擴(kuò)增模板。8.2.4RT-PCR檢測(cè)方法8.2.4.1檢測(cè)引物上游引物NPF75-GAGTATGCTCCTTTCGC-3'下游引物NPR:5'-TTIGGTATTCGCCGTAG-3'GP基因擴(kuò)增引物：上游引物GPF:5'-GCAACTGCGAAGAGGAG-3'下游引物GPR:5'-CACGGGTGTATTATGGCT-3'引物工作濃度均為10μmoVL,配制后于-20℃左右保存。擴(kuò)增目的基因片段長(zhǎng)度分別為NP基因538bp、GP基因396bp。RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物參考序列見(jiàn)附錄C。在冰盒上配制20L逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系。在0.2mL離心管中依次加入：DEPC處理水6.5μL,隨機(jī)引物(25μmol/L)2μL,dNTPs照5μL。混勻，短暫離心，65℃保溫5min后，冰上迅速冷卻。然后在上述反應(yīng)管中加人：5x逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液4μL,RNA酶抑制劑(40U/pL)0.5μL,AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(200UpL)1μL。緩慢混勻。按以下程序進(jìn)行cDNA合成：30℃10min,42℃45min;95℃5min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，冰上冷卻。合成的cDNA可立即用于PCR擴(kuò)增，或保存于-20℃?zhèn)溆谩？刹捎猛饶孓D(zhuǎn)錄效率的商品化逆轉(zhuǎn)錄試劑盒。4可采用同等逆轉(zhuǎn)錄效率的商品化一步法RT-PCR試劑盒。在PCR反應(yīng)管中依次加人：去離子水33μL,10×TagDNA聚合酶緩沖液(不含Mg)5μLTagDNA聚合酶(5UHL正，合成的cDNA5μL。混勻，置于PCR儀中。按以下程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增：95℃5min;(95℃1min,55℃1min,72℃1min)35個(gè)循環(huán)；72℃10min。8.2.4.4瓊脂糖凝膠電泳用0.5×TBE電泳緩沖液配制1.5%的瓊脂糖凝膠，加入適量的電泳核酸染料。分別取5μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物與1pL6×載樣緩沖液混勻后加入樣品孔，使用DL2000DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物作為電泳參照。置于水平電泳儀上5V/cm電泳，當(dāng)載樣緩沖液中溴酚藍(lán)指示劑色帶遷移至瓊脂糖凝膠的2/3處時(shí)停止電泳，用凝膠成像儀觀察擴(kuò)增結(jié)果。8.2.4.5結(jié)果判定用凝膠成像系統(tǒng)分析，NP基因陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增出一條大小為538bp的特異性條帶，GP基因陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增出一條大小為396bp的特異性條帶，陰性對(duì)照和空白對(duì)照無(wú)特異性條帶；在陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照成立的情況下，如被檢樣品無(wú)條帶，則結(jié)果為陰性，如被檢樣品有條帶，且與陽(yáng)性對(duì)照一致大小，即判定為埃博拉病毒核酸陽(yáng)性。對(duì)于檢測(cè)陽(yáng)性的樣本可切下電泳分析的目的條帶，用凝膠回收試劑盒回收純化(按其說(shuō)明書(shū)進(jìn)行),進(jìn)行測(cè)序確認(rèn)病毒基因序列。8.2.5實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法8.2.5.1引物和探針用于檢測(cè)NP基因的弓物和探針：上游引物NP-FQ:S'-TTCCCTTTCCAGGACCCATC-3'下游引物NP-RQ:5-TCGGGAATCGTCGTATCCTG-3°探針NP-P:5'-FAM-CCTGGCCATCAAGATGATGATCCGAC用于檢測(cè)GP基因的引物和探針：上游引物GP-FQ:5'-AGCTGTATCAAACCGACCCA-3°下游引物GP-RQ:5'-CTCGTGGAGATTGTGGCAAG-3'探針GP-P:5'-FAM-CGCGCCGGACTCTGACCACT-BHQi-3'引物和探針的工作濃度均為10μmol/L,配制后于-20℃左右保存。實(shí)時(shí)熒光RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物參考序列見(jiàn)附錄D。8.2.5.3實(shí)時(shí)熒光PCR采用20μL反應(yīng)體系：熒光PCR預(yù)混液(2x)10μL,探針0.6L,上、下游引物各0.4μL,cDNA模板1L,RNasefreeH?O補(bǔ)足20pL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min,95℃變性10s,58℃530s,40個(gè)循環(huán)。每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)進(jìn)行熒光信號(hào)的采集。檢測(cè)結(jié)束后，根據(jù)收集的熒光曲線和C值判定結(jié)果。8.2.5.4結(jié)果判定及報(bào)告本方法檢驗(yàn)結(jié)果判定及報(bào)告如下。——檢測(cè)樣本有明顯的熒光增幅曲線，且C值≤35時(shí)，判為陽(yáng)性，報(bào)告“檢出埃博拉病毒核酸(實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法。——檢測(cè)樣本熒光增幅曲線的C值介于35和40之間時(shí)，應(yīng)重復(fù)進(jìn)行試驗(yàn)，若重新檢測(cè)的Ct值仍介于35和40之間。且曲線有明顯的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，判為陽(yáng)性，報(bào)告“檢出埃博拉病毒核酸(實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法；否則判為陰性，報(bào)告“未檢出埃博拉病毒核酸(實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法”。——檢測(cè)樣本熒光增幅曲線的C值介于40和45之間時(shí)，可采用膜過(guò)濾法濃縮核酸樣本，再重新進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)。若重新檢測(cè)的Ct值有明顯減少趨勢(shì)。且曲線有明顯的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期。判為陽(yáng)性，報(bào)告“檢出埃博拉病毒核酸(實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法)。此類樣本建議采用其他方法進(jìn)一步驗(yàn)證；否則判為陰性，報(bào)告“未檢出埃博拉病毒核酸(實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法”。埃博拉出血熱埃博拉出血熱(Eholahaemorhagicfever,EHF)是一種人獸共患病，是由絲狀病毒科的埃博拉病毒(Eholavius,EBOV)導(dǎo)致人和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物(如猩猩和猴子)發(fā)生急性感染的烈性出血性傳染病，人感染后死亡率高達(dá)50%-90%。A2傳染源及宿主動(dòng)物hat),尤其是活躍在撒哈拉以南的非洲(包括幾內(nèi)亞)的3類水果蝙蝠——無(wú)尾肩章果蝠(Epomopsfrangueri)、錘頭果蝠(Hypsignathusmonstosus)和小領(lǐng)果蝠(Myonycteristoryurta)被認(rèn)為是埃博拉病毒可能的自然宿主。受病毒感染的果蝠通過(guò)直接或間接的方式與其他動(dòng)物接觸來(lái)散播病毒，導(dǎo)致人類和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物如大猩猩、黑猩猩、恒河猴、獼猴的大規(guī)模流行。有研究發(fā)現(xiàn)在中非倉(cāng)鼠和尖鼠體內(nèi)檢測(cè)到埃博拉病毒核酸，標(biāo)志著嚙齒類動(dòng)物也有可能是儲(chǔ)存宿主。另外，豬和犬是至今為止確定能感染埃博拉病毒的家畜。此外，有報(bào)道來(lái)自非洲熱帶叢林中的森林玲羊和豪豬感染埃博拉出血熱情況。潛在媒介調(diào)查中，在節(jié)肢動(dòng)物包括臭蟲(chóng)、半翅類昆蟲(chóng)等體內(nèi)未檢測(cè)發(fā)現(xiàn)有埃博拉病毒。A.3臨床癥狀早期癥狀為起病急，突然高熱、極度乏力則烈頭痛、咽喉痛，全身肌肉和關(guān)節(jié)疼痛，可能還有寒顫和精神萎靡等。隨后可出現(xiàn)嚴(yán)重的度內(nèi)疼痛、惡心、吐逆和瀉肚等消化系統(tǒng)病狀。發(fā)病4d-5d后進(jìn)入極期，患者主要表現(xiàn)為持續(xù)高燒。全身感染中毒癥候和消化道病癥更加嚴(yán)重，并伴有不同水平的出血現(xiàn)象，包含口鼻、結(jié)膜，腸胃、陰道和肌膚等部位出血，也見(jiàn)嘔血和血尿等，多數(shù)患者可在面、頸、軀干和手臂等部位出現(xiàn)彌漫性紅斑樣丘疹，這是區(qū)別于其他類似疾病的癥狀。特重者可出現(xiàn)意識(shí)窒礙(如譫妄、嗒順)、休克、多器官衰竭及致死性并發(fā)癥等。A.4病理變化埃博拉