亞硝酸還原酶（NiR）活性檢測試劑盒（微量法）原理亞硝酸還原酶（NiR）是亞硝態(tài)氮還原過程中的關鍵酶，在自然界氮素循環(huán)過程中發(fā)揮著重要作用，其廣泛存在于微生物及植物體內，能夠催化亞硝酸鹽還原，減少亞硝態(tài)氮在環(huán)境中的積累，降低其對生物體生長發(fā)育的毒害作用。CheKine?亞硝酸還原酶（NiR）活性檢測試劑盒（微量法）能夠檢測植物組織、細菌、真菌樣本中亞硝酸還原酶活性，其原理是亞硝酸還原酶可將NO2-還原為NO，使樣本中參與重氮化反應生成紫紅色化合物的NO2-減少，即540nm處吸光值的變化可反映樣本中NiR的活性。包裝清單試劑盒組分規(guī)格儲存條件48T96TExtractionBuffer60mL120mL4℃ReagentⅠ2.8mL5.6mL4℃ReagentⅡPowder×1vialPowder×1vial4℃ReagentIII2.5mL5mL4℃ReagentIV5mL10mL4℃，避光保存ReagentV5mL10mL4℃，避光保存Standard1mL1mL4℃注意：正式檢測前，建議選擇2-3個預期差異較大的樣本進行預實驗。自備耗材·酶標儀或可見分光光度計（能測540nm處的吸光度）·96孔板或微量玻璃比色皿、可調節(jié)式移液槍及槍頭·恒溫水浴鍋、制冰機、低溫離心機·去離子水·勻漿器或研缽（如果是組織樣本）試劑準備ExtractionBuffer：即用型；使用前，平衡到室溫。4℃保存。ReagentI：即用型；使用前，平衡到室溫。4℃保存。ReagentII：臨用前配制；48T加入2.5mL去離子水，96T加入5mL去離子水，充分溶解待用。4℃可保存2周。ReagentIII：即用型；使用前，平衡到室溫（如出現沉淀可以70-80℃加熱溶解）。4℃保存。ReagentIV：即用型；使用前，平衡到室溫（如出現沉淀可以70-80℃加熱溶解）。4℃避光保存。ReagentV：即用型；使用前，平衡到室溫。4℃避光保存。注意：ReagentI有毒，ReagentIV和ReagentV有刺激性氣味，建議在通風櫥進行實驗。WorkingReagent：臨用前根據用量將ReagentIV和ReagentV以1：1的比例混合，現用現配。Standard：10μmol/mL亞硝酸鈉標準溶液。4℃保存。標準品制備：10μmol/mL亞硝酸鈉標準溶液，按照下表所示，進一步稀釋成標準品：序號Standard體積去離子水體積（μL）濃度（μmol/mL）Std.120μL10μmol/mLStandard9800.2Std.2500μLofStd.1(0.2μmol/mL)5000.1Std.3500μLofStd.2(0.1μmol/mL)5000.05Std.4500μLofStd.3(0.05μmol/mL)5000.025Std.5500μLofStd.4(0.025μmol/mL)5000.0125Std.6500μLofStd.5(0.0125μmol/mL)5000.00625Std.7500μLofStd.6(0.00625μmol/mL)5000.003125Std.805000（空白管）注意：每次實驗都要做一次標準品檢測，制作標曲；稀釋后的標準品溶液不穩(wěn)定，必須在4小時內使用。樣本制備注意：推薦使用新鮮樣本，如果不立即進行實驗，樣本可在-80℃保存1個月。測定時，應控制解凍的溫度和時間。室溫環(huán)境下解凍時，需在4h內完成樣品解凍。組織：稱取約0.1g的新鮮組織，加入1mLExtractionBuffer搗碎，冰浴超聲波提取（300W，超聲5s，間隔8s，總時間5min），10,000g，4℃離心10min，取上清液置于冰上待測。細菌或真菌細胞：收集500萬細菌或真菌細胞到離心管內，用冷PBS清洗細菌或真菌細胞，離心后棄上清，加入1mLExtractionBuffer，冰浴超聲波破碎細菌或真菌細胞3min（功率300W，超聲3s，間隔7s，總時間3min），然后10,000g，4℃離心10min，取上清液置于冰上待測。注意：如需測定蛋白濃度，推薦使用Abbkine貨號：KTD3001的蛋白質定量試劑盒（BCA法）進行樣本蛋白質濃度測定。實驗步驟酶標儀或可見分光光度計預熱30min，調節(jié)波長到540nm。可見分光光度計用去離子水調零。操作表（下述操作在1.5mLEP管中進行）：試劑基質管（μL）對照管（μL）測定管（μL）標準管（μL）樣本020200去離子水204000ReagentⅠ400400ReagentⅡ4040400混勻后，25℃孵育1hReagentIII4040400充分震蕩30s，常溫靜置5min，取上清至微量玻璃比色皿或96孔板中上清液7070700Standard00070WorkingReagent140140140140充分混勻，常溫靜置5min，測定540nm各管吸光值，分別記為A基質、A對照、A測定、A標準和A空白，計算ΔA測定=A基質-(A測定-A對照)，ΔA標準=A標準-A空白。注意：標準曲線、空白管和基質管只需測1-2次。實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果ΔA測定小于0.01可適當加大樣本量。如果ΔA測定大于0.7，樣本可用ExtractionBuffer進一步稀釋，計算結果乘以稀釋倍數，或減少提取用樣本量。結果計算注意：我們?yōu)槟峁┑挠嬎愎剑ㄍ茖н^程計算公式和簡潔計算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡潔計算公式為最終計算公式。1.標準曲線的繪制以標準溶液濃度為x軸，ΔA標準為y軸，繪制標準曲線，得到標準方程y=kx+b，將ΔA測定帶入方程得到x(μmol/mL)。2.NIR活性的計算：按樣本蛋白濃度計算：單位定義：每mg組織蛋白每小時還原1μmolNO2ˉ的量為一個酶活力單位。NiR(U/mgprot)=x×V反總÷V樣×V樣總÷(Cpr×V樣總)÷T=x×7÷Cpr按樣本鮮重計算：單位定義：每g組織每小時還原1μmolNO2ˉ的量為一個酶活力單位。NiR(U/g質量)=x×V反總÷V樣×V樣總÷W÷T=x×7÷W按細菌或真菌細胞數量計算：單位定義：每104個細菌或真菌細胞每小時還原1μmolNO2ˉ的量為一個酶活力單位。NiR(U/104)=x×V反總÷V樣×V樣總÷N÷T=x×7÷NV反總：取上清液前的反應體系體積，0.14mL；V樣：加入的樣本體積，0.02mL；V樣總：加入的ExtractionBuffer體積，1.0mL；T：反應時間，1h；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；N：細菌或真菌細胞數量，104。結果展示Figure1.本試劑盒測定擬南芥和平菇中NiR的活性Figure2.StandardCurveofNi