中性轉化酶（NI）活性檢測試劑盒（微量法）原理蔗糖轉化酶（Invertase，Ivr）催化蔗糖不可逆地分解為果糖和葡萄糖，是高等植物蔗糖代謝關鍵酶之一。根據最適pH，將高等植物Ivr分為酸性轉化酶（Acidinvertase，AI）和中性轉化酶（Neutralinvertase，NI）兩種類型。NI主要存在于細胞質中，負責分解細胞質中蔗糖為果糖和葡萄糖。CheKine?中性轉化酶（NI）活性檢測試劑盒（微量法）可檢測植物組織樣本。在該試劑盒中，NI催化蔗糖分解產生還原糖，進一步與3,5－二硝基水楊酸反應，生成棕紅色氨基化合物，在540nm有特征光吸收，在一定范圍內540nm光吸收值與還原糖生成量成正比。通過光吸收增加速率來計算NI活性。包裝清單試劑盒組分規格儲存條件48T96TExtractionBuffer60mL120mL4℃ReagentⅠ10mL20mL4℃ReagentIIPowder×1vialPowder×1vial4℃ReagentIII10mL20mL4℃，避光保存StandardPowder×1vialPowder×1vial4℃，避光保存注意：正式檢測前，建議選擇2-3個預期差異較大的樣本進行預實驗。自備耗材·酶標儀或可見光分光光度計（能測540nm處的吸光度）·96孔板或微量玻璃比色皿、可調節式移液槍及槍頭、1.5mL離心管·水浴鍋、低溫離心機、制冰機·去離子水·勻漿器或研缽（如果是組織樣本）試劑準備ExtractionBuffer：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。注意：ExtractionBuffer和ReagentIII有刺激性氣味，建議在通風櫥進行實驗。ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。WorkingReagentII：臨用前配制；48T加入7mLReagentⅠ，96T加入14mLReagentⅠ，充分溶解。用不完的試劑4℃保存2周。ReagentIII：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃避光保存。Standard：臨用前配制；加入1mL去離子水，充分溶解得10mg/mL，用不完的試劑4℃保存1個月。使用10mg/mLStandard，按照下表所示，進一步稀釋標準品：序號Standard體積（μL）去離子水體積（μL）濃度（mg/mL）Std.1200μL10mg/mLStandard8002Std.2600μLofStd.1(2mg/mLStandard)2001.5Std.3200μLofStd.1(2mg/mLStandard)2001Std.4200μLofStd.3(1mg/mLStandard)2000.5Std.5200μLofStd.4(0.5mg/mLStandard)2000.25Blank04000注意：每次實驗，請使用新配制的標準品；配制好的標準品需要在4h之內使用。樣本制備注意：建議使用新鮮樣本。如果不立即使用，可將樣品在-80℃下保存一個月。測定時，應控制解凍的溫度和時間。室溫環境下解凍時，需在4h內完成樣品解凍。植物組織：稱取約0.1g樣本，加入1mLExtractionBuffer，冰浴勻漿，12,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測。注意：如需測定蛋白濃度，推薦使用Abbkine貨號：KTD3002的蛋白質定量試劑盒（Bradford法）進行樣本蛋白質濃度測定。由于ExtractionBuffer中含有一定濃度的蛋白（約1mg/mL），所以在測定樣本蛋白濃度時需要減去提取液本身的蛋白含量。實驗步驟酶標儀或可見光分光光度計預熱30min以上，調節波長到540nm，可見光分光光度計用去離子水調零。操作表（下述操作在1.5mL離心管中操作）：試劑空白孔（μL）標準孔（μL）對照孔（μL）測定孔（μL）樣本005050Standard05000去離子水50000ReagentⅠ002000WorkingReagentII2002000200混勻，37℃保溫30min，置95℃水浴中10min（蓋緊，防止水分散失），流水冷卻。ReagentIII125125125125混勻，95℃水浴10min（蓋緊，以防止水分散失），流水冷卻后充分混勻，取200μL至96孔板或微量石英比色皿中，記錄540nm處吸光值A。空白孔記為A空白，標準孔記為A標準，對照孔記為A對照，測定孔記為A測定。計算ΔA測定=A測定-A對照，ΔA標準=A標準-A空白。注意：空白管和標準管只需做1-2次。實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本的ΔA小于0.01，可適當增大樣本量，如果ΔA大于1.2，樣本可用ExtractionBuffer進一步稀釋，計算結果乘以稀釋倍數，或減少提取用樣本量。結果計算注意：我們為您提供的計算公式，包括推導過程計算公式和簡潔計算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡潔計算公式為最終計算公式。標準曲線的繪制以標準溶液濃度為x軸，ΔA標準為y軸，繪制標準曲線，得到標準方程，將ΔA測定帶入方程得到x(mg/mL)。NI含量的計算：按樣本蛋白濃度計算：酶活單位定義：37℃每毫克蛋白每分鐘產生1μg還原糖定義為一個酶活力單位。NI(U/mgprot)=x×V樣÷(V樣×Cpr)÷T×1,000=33.3x÷Cpr按樣本鮮重計算：酶活單位定義：37℃每克樣本每分鐘產生1μg還原糖定義為一個酶活力單位。NI(U/g鮮重)=x×V樣÷(V樣×W÷V樣總)÷T×1,000=33.3x÷WV樣：加入樣本體積，0.05mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應時間，30min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；1,000：換算系數，1mg/mL=1,000μg/mL。注意事項如果加入ReagentIII，95℃水浴10min后有混濁物出現，建議12,000g，4℃離心5min后，取上清測定吸光度。結果展示以下數據僅供參考，實驗者需根據自己的實驗對樣品進行檢測。Figure1.本試劑盒測定玉米種子和胡蘿卜根莖中CHI的活性。相關產品CatalogNo.ProductNameKTB3110CheKine?蔗糖合成酶（SS