ATP檸檬酸裂解酶（ACL）活性檢測試劑盒（微量法）原理ATP檸檬酸裂解酶（ATPcitratelyase，ACL）是催化檸檬酸生成乙酰輔酶A的關鍵胞質酶，其催化產生的乙酰輔酶A是合成脂肪酸與膽固醇等脂類物質的主要原料，并可參與相關重要蛋白的修飾作用，是體內能源物質代謝的樞紐性物質。CheKine?ATP檸檬酸裂解酶（ACL）活性檢測試劑盒（微量法）可檢測動植物組織，細菌和細胞，血清（漿）。在該試劑盒中，在ATP和輔酶A存在的情況下，ACL能將檸檬酸催化裂解為乙酰輔酶A、草酰乙酸、ADP和磷酸鹽，蘋果酸脫氫酶進一步催化草酰乙酸和NADH生成蘋果酸和NAD+，導致340nm處光吸收下降。包裝清單試劑盒組分規格儲存條件48T96TExtractionBuffer60mL60×2mL4℃ReagentⅠ12mL24mL4℃ReagentIIPowder×1vialPowder×1vial-20℃，避光保存ReagentIIIPowder×1vialPowder×1vial4℃，避光保存注意：正式檢測前，建議選擇2-3個預期差異較大的樣本進行預實驗。自備耗材·酶標儀或可見光分光光度計（能測340nm處的吸光度）·96孔UV板或微量玻璃比色皿、可調節式移液槍及槍頭、1.5mL離心管·水浴鍋、低溫離心機·去離子水·勻漿器或研缽（如果是組織樣本）試劑準備ExtractionBuffer：即用型；使用前，平衡到室溫。4℃保存。ReagentI：即用型；使用前，平衡到室溫。4℃保存。注意：ExtractionBuffer和ReagentI有少許刺激性氣味，建議在通風櫥進行實驗。Note:ExtractionBufferandReagentIhaveaslightirritatingodor,soitisrecommendedtoexperimentinafumehood.ReagentII：即用型；使用前，平衡到室溫。-20℃避光保存。ReagentIII：即用型；使用前，平衡到室溫。4℃避光保存。WorkingReagent：臨用前配制；將ReagentII和ReagentIII轉移至ReagentⅠ中，充分溶解待用。用不完的試劑-20℃避光分裝保存1個月，避免反復凍融。樣本制備注意：建議使用新鮮樣本。如果不立即使用，可將樣品在-80℃下保存一個月。測定時，應控制解凍的溫度和時間。室溫環境下解凍時，需在4h內完成樣品解凍。組織：稱取約0.1g樣本，加入1mLExtractionBuffer，冰浴勻漿，8,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測。細菌和細胞：收集500萬細菌或細胞到離心管內，用冷PBS清洗細菌或細胞，離心后棄上清，加入1mLExtractionBuffer，冰浴超聲波破碎細菌或細胞30次（功率20%或200W，超聲3s，間隔7s），然后8,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測。血清（漿）：直接檢測。注意：如需測定蛋白濃度，推薦使用Abbkine貨號：KTD3001的蛋白質定量試劑盒（BCA法）進行樣本蛋白質濃度測定。實驗步驟酶標儀或可見光分光光度計預熱30min以上，調節波長到340nm，可見光分光光度計用去離子水調零。將WorkingReagent在37℃(哺乳動物)或25℃（其它物種）預熱5min。操作表（下述操作在96孔UV板或微量玻璃比色皿中操作）：試劑測定孔（μL）樣本20WorkingReagent180混勻，立即記錄340nm處20s時的吸光值A1和320s后的吸光值A2，計算ΔA=A1-A2。注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果ΔA小于0.02可適當加大樣本量或延長反應時間。如果ΔA大于0.4，樣本可用ExtractionBuffer進一步稀釋，計算結果乘以稀釋倍數，或減少提取用樣本量。結果計算注意：我們為您提供的計算公式，包括推導過程計算公式和簡潔計算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡潔計算公式為最終計算公式。ACL活性的計算：使用96孔UV板測定的計算公式如下按樣本蛋白濃度計算：單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmolNADH定義為一個酶活力單位。ACL(U/mgprot)＝[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr)÷T=643.08×ΔA÷Cpr按樣本鮮重計算：單位的定義：每克組織每分鐘消耗1nmolNADH定義為一個酶活性單位。ACL(U/g鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W×V樣÷V樣總)÷T=643.08×ΔA÷W按細菌或細胞密度計算：單位的定義：每104個細菌或細胞每分鐘消耗1nmolNADH定義為一個酶活性單位。ACL(U/104)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(n×V樣÷V樣總)÷T=643.08×ΔA÷n按液體體積計算單位的定義：每mL液體每分鐘消耗1nmolNADH定義為一個酶活性單位。ACL(U/mL)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷V樣÷T=643.08×ΔAV反總：反應體系總體積，2×10-4L；ε：NADH摩爾消光系數，6.22×103L/mol/cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.02mL；V樣總：加入ExtractionBuffer的體積，1mL；T：反應時間，5min；W：樣本質量，g；n：細胞總數，以萬計。使用微量石英比色皿測定的計算公式將上述計算公式中光徑d:0.5cm調整為d:1cm進行計算即可。結果展示以下數據僅供參考，實驗者需根據自己的實驗對樣品進行檢測。Figure1.本試劑盒測定兔肝臟和煙草葉中ACL的活性相關產品CatalogNo.ProductNameKTB1261CheKine?乙酰輔酶A羧化酶（ACC）活性檢測試劑