免疫實驗技術全攻略解析流式細胞實驗設計技巧分享應用型抗體開發策略孫月紅FCM資深實驗專家北京義翹神州科技股份有限公司義翹神州CONTENT流式概述與實驗要點1流式實驗常見問題匯總2流式應用型抗體開發策略3流式概述與實驗要點01義翹神州流式VS熒光顯微鏡流式熒光顯微鏡單個、流動、依次視野、靜止、同時PMT肉眼/CCD細胞群體特征量分布細胞內部結構信息流式：單個細胞分析，收集每個細胞的數據WB：群體分析，得到多個細胞的平均值流式VSWB流式細胞術（FlowCytometry）：單細胞或生物顆粒、多參數、高通量、快速、定量、分選義翹神州細胞固有參數前向角散射光（FSC）：入射激光的同向散射光信號，反應細胞相對大小及其表面積。側向角散射光（SSC）：入射激光90

角的散射光信號，反應細胞粒度及細胞內相對復雜度。粒細胞單核細胞淋巴細胞流式細胞儀的信號——散射光信號義翹神州源自：細胞自發熒光：細胞自身在激光照射下，發出微弱熒光信號，噪聲信號。特異性熒光信號：細胞經熒光素標記后，受激光照射得到的熒光信號。每種熒光染料會產生特定波長的熒光和顏色，通過波長選擇通透性濾片，可將不同波長的熒光信號區分開，送入不同的光電檢測器。選擇不同的單抗及染料可同時測定單個細胞的多個不同參數。流式細胞儀的信號——熒光信號義翹神州源自：源自：檢測指標選擇抗體搭配熒光素樣品制備樣品質量實驗對照實驗細節上機檢測儀器設置補償調節收集細胞數目數據分析分析方式流式技術關鍵環節義翹神州方案設計常用免疫細胞標記物義翹神州白細胞CD45+髓系細胞淋巴細胞T細胞CD3+初始T細胞CD45RA+CCR7+中央記憶T細胞CD45RA-CCR7+效應記憶T細胞CD45RA-CCR7-終末效應記憶T細胞CD45RA+CCR7-TregCD4+CD25+CD127lowFoxP3+Tc細胞CD8+Th細胞CD4+Th1IFNγ-Th2IL4+Th17IL17+γδT細胞TCRγδ+NKT細胞CD3+CD56+NK細胞CD3-CD56+CD56brightCD16low/-CD56dimCD16+B細胞CD19+初始B細胞IgD+CD27-邊緣區B細胞IgD+CD27+記憶B細胞IgD-CD27+單核細胞經典CD14++CD16-非經典CD14+CD16++中間型CD14+CD16+嗜堿性粒細胞CD3-CD14-CD19-CD56-HLA-DR-CD123+FcER1+先天淋巴細胞CD3-CD14-CD19-CD56-CD2+CD127+樹突狀細胞pDCCD3-CD19-CD56-CD14-HLA-DR+CD11C-

CD123+cDCCD3-CD19-CD56-CD14-HLA-DR+CD11C+CD123-+:positive/highexpression-:negative/lowexpressionKeycDC1CD141+FCER1-cDC2CD141-FCER1+常用免疫細胞標記物義翹神州T細胞CD3+初始T細胞CD44-CD62L+中央記憶T細胞效應記憶T細胞TregCD25+FoxP3+Tc細胞CD8+Th細胞CD4+Th1IFNγ-Th2IL4+Th17IL17+γδT細胞TCRγδ+NK細胞CD3+CD49B+/NK1.1+NKT細胞B細胞CD19+/B220+漿母細胞B220+CD138+漿細胞記憶B細胞單核細胞經典Ly6C+巨噬細胞DC細胞pDCCD3-CD49B-Ly6G-CD11C+CD11B-

B220+pDCA1+cDCCD3-B220-CD49B-Ly6G-Ly6C-CD11B+CD11C+MHCII+cDC1XCR1+CD172-cDC2XCR1-CD172+CD44+CD62L+CD44+CD62L+TfhCXCR5+PD1+CD3+CD49B+/NK1.1+B220-CD138+B220+CD138-GL7-CD38+生發中心B細胞B220+GL7+FAS+非經典Ly6C-CD11B+CD115+Ly6G-CD11B+F4/80+Ly6G-M1型CD80+CD26-M2型CD80+CD26+中性粒細胞CD3-B220-Ly6G+CD11B++:positive/highexpression-:negative/lowexpressionKey白細胞髓系細胞淋巴細胞CD45+目標蛋白特異性識別種屬正確首選直標抗體可用于流式實驗抗體選擇義翹神州多靶點：1600余株FCM抗體多種屬：人、大鼠、小鼠、猴等多熒光素標記：FITC、PE、PerCP、APC配套試劑盒：AnnexinV/7-AAD凋亡檢測試劑盒人間充質干細胞檢測試劑盒Ⅰ多細胞篩選HeLaLymophcytesAnti-HumanCD147-FITC(Cat:10186-R125-F)Lymophcytes藍色直方圖：CD19抗體預先與過量的CD19重組蛋白孵育橘色直方圖：CD19抗體預先與過量的無關蛋白孵育Anti-HumanCD19(Cat:11880-MM17)Lymophcytes藍色直方圖：細胞與過量的CD21非標記抗體（貨號：10811-MM02）后，再加入CD21FITCAnti-HumanCD21-FITC(Cat:10811-MM02-F)國外品牌CD14-FITC(M5E2)monocytesmonocytesAnti-HumanCD14-FITC(Cat:10073-MM06-F)Ⅱ蛋白競爭Ⅲ非標記抗體競爭Ⅳ經典克隆對比抗體選擇義翹神州熒光亮度光譜重疊熒光素的特性熒光素搭配義翹神州熒光與儀器相匹配激光器、檢測通道數量及具體參數熒光素亮度與抗原表達相匹配了解抗原表達強弱及熒光素亮度Ⅱ多色組合考慮熒光素的光譜重疊在同一細胞上表達的抗原光譜重疊最小化采用多激光激發減少光譜重疊其他注意事項有些熒光素可被多個激光器激發串聯染料易降解……Ⅳ每個通道只能選擇一種熒光素各個通道之間的熒光素可以隨意搭配高表達的抗原可用不太亮的熒光素低表達的抗原盡量用亮的熒光素了解熒光素的激發光及發射光譜了解熒光素特性ⅠⅢ熒光素搭配義翹神州外周血骨髓組織塊培養的細胞脫落的細胞原則確保高質量的單細胞懸液盡可能減少碎片和死細胞單細胞懸液制備義翹神州排除特定亞型熒光素抗體的非特異性染色背景。指用同種細胞，染上去掉一種熒光素的其它所有熒光素。體現出各種熒光素對未標記通道的滲漏。確定染色背景及細胞的自發熒光水平。自發熒光會干擾FITC、PacificBlue等熒光素檢測，降低信號分辨能力，導致假陽性。FL-1(FITC)FL-2(-)FITC單標FL-1(-)FL-2(PE)PE單標對照設置義翹神州Ⅱ單染對照Ⅲ同型對照ⅣFMO對照Ⅰ陰性對照優化抗體使用濃度Ⅰ鼠脾細胞與不同濃度的CD27FITC(50110-R012-F)染色結果抗體滴定方法：使用實驗時要用的同種細胞，固定細胞量與反應體積，加入不同量的抗體，計算陽性峰熒光強度及信噪比（S/N）

1、滴定的濃度范圍盡量大，做5個左右梯度。

2、滴定實驗條件要和實際的實驗條件一致，如反應溫度、反應體系。3、用于滴定抗體的標本中，確保有陰性細胞。

實驗技巧義翹神州Ⅱ排除死細胞干擾死細胞的自發熒光水平很高死細胞容易攝取抗體導致非特異性結合，最終影響實驗結果死細胞還可能會釋放DNA。DNA非常粘稠，會導致細胞成團，容易堵塞管路LiveAll區分死細胞的方法死細胞特性：細胞膜滲透性增強，失去膜完整性1、DNA結合染料：PI、DAPI、7-AAD、TO-PRO-3等DNA染料只會進入細胞膜受損的細胞，結合到細胞的DNA上。2、蛋白結合染料：結合細胞表面或膜內的游離胺，活細胞弱陽，死細胞強陽，可以用在固定標本中。代表產品：live/dead可固定染料實驗技巧義翹神州Ⅲ封閉Fc受體Fc受體是指細胞表面能夠與免疫球蛋白（IgG、IgA、IgM、IgE和IgD）結合的分子，存在于NK細胞、肥大細胞、巨噬細胞、中性粒細胞的表面。FcR能夠與抗體的Fc段結合，在檢測時產生假陽性。FcR封閉前FcR封閉后Fc受體封閉試劑（1）商品化的FcBlock試劑：重組人IgG、小鼠CD16/CD32抗體（2）人血清或相應物種的血清實驗技巧義翹神州我在實驗中應該獲取多少個細胞？我的結果中有多少個細胞才有意義？上機檢測義翹神州1、目標細胞群比例高，獲取10000個細胞2、目標細胞群比例低（1%以下）：數據真實性：排除死細胞、碎片造成的非特異性信號設置完整的實驗對照多次重復實驗陽性率（P）10%5%1%0.10%0.01%細胞總數（N）500010000500005000005000000陽性細胞數（R）500500500500500方差（Variance）450475495499.5499.95標準差（SD）21.2121.7922.2522.3522.36變異系數（CV）4.71%4.59%4.49%4.47%4.47%P=R/N，Variance=N*P*(1-P)，SD=?Variance，CV=SD*100%/Variance單參數數據直方圖每一個細胞單參數的測量數據可整理成分布統計，以分布直方圖(distributionhistogram)來顯示。橫坐標表示熒光信號或散射光信號相對強度的值，縱坐標一般是相對細胞數。DNA倍體分析散點圖密度圖等高線圖CD3CD4CD8CD45CD3雙參數數據三維圖數據分析義翹神州百分比絕對計數平均熒光強度（MFI）百分比的比較方式建立在父級細胞群數量不變的基礎上1、絕對計數管：管中包含已知數量的微球2、有絕對計數功能的流式細胞儀：精確控制樣本體積量，通過采集到的細胞數目、樣本體積、總體積、絕對數目單位計算得到單位體積內特定細胞的總數1、Mean：算數平均數，用于線性正太分布2、GeometryMean：幾何平均數，用于對數正態分布3、Median：中位數，不受數據形態分布的影響4、Mode：眾數，數據最高峰所在的位置適合不分群而整體發生偏移的指標數據分析義翹神州對于異質性的樣本，進行百分比分析更有意義義翹神州關注目標細胞群的絕對數合理使用MFI進行數據分析：不適用于異質性的樣本謹慎比較不同次實驗中的MFI數據分析流式實驗常見問題匯總02義翹神州無陽性信號/信號弱確定待檢抗原在待檢細胞中的表達水平抗原與儀器是否匹配是否正確保存使用濃度是否適當間接染色是否使用了正確的二抗抗體胞內抗原檢測，破膜是否充分表面分子染色前，有無做過固定樣本制備過程抗原表達弱，建議搭配強熒光素抗體信號放大抗原更換合適的抗體熒光標記抗體一般保存方式為2-8℃，避光，避免冷凍調整抗體使用濃度抗體更換細胞破膜方式有些表面分子易受固定或酶消化影響，盡量避免表面染色前固定樣本制備過程常見問題匯總義翹神州非特異性染色細胞活率是否過低細胞是否表達FcR樣本使用濃度是否適當間接染色二抗是否與細胞交叉反應是否使用串聯染料抗體使用活性染料排除干擾使用Fc受體封閉劑樣本調整抗體使用濃度更換二抗更換熒光素抗體確保洗滌充分樣本制備過程是否充分洗滌，尤其是胞內染色樣本制備過程常見問題匯總義翹神州流式應用型抗體開發策略03義翹神州抗原設計表位差異性構象正確性抗原易獲得性1免疫方案高滴度免疫效價多表位免疫反應識別功能位點2抗體篩選多樣化篩選平臺快速精準篩選鑒別多功能抗體3表達生產減少外源污染高產能（≥mg級）高通量4質控驗證理化檢測功能驗證5抗體平臺關鍵技術環節義翹神州

抗原設計重組蛋白類免疫原多肽不同膜蛋白形式細胞其他類型免疫原核酸義翹神州雜交瘤技術噬菌體展示文庫技術單B細胞分選技術高效的抗體開發技術平臺：經典技術優化：電融合，建庫技術新技術：單個B細胞技術，更快的速度多種篩選方案組合高效的重組抗體表達高質量的候選抗體庫：數百-數千個候選抗體親和力達到nM-pM水平不同的抗原結合表位適用于不同應用場景Beacon?技術

四大單克隆抗體制備技術義翹神州根據最終需求選擇合適的免疫原、佐劑、免疫方式動物免疫效價檢測篩選方式ELISA效價檢測為主，輔助Fc檢測多樣化抗體篩選平臺，關鍵環節進行Fc功能介入篩選功能需求為導向，盡早開展應用特異性篩選流式應用抗體開發義翹神州免疫原：Daudi細胞流式檢測商品化anti-CD45RA-PE商品化anti-CD45RA-PE（CD45RA-MM27封閉）

流式抗體篩選案例1CD45RA抗原表達lymphocytesKG-1U937HL60K562JurkatMOLT-4RPMI8226RajiDaudiMG63SKO-007二抗anti-CD45RA-MM27+二抗RajiHL60Lymphocytes義翹神州種屬：小鼠篩選平臺：雜交瘤二抗對照抗體24447-M017324447-M0165

流式抗體篩選