閆輝目錄4

三維細胞培養模型的建立4.1三維基質膠〔2〕的種類以及常用基質膠的介紹4.2三維模型的種類4.3常見三維細胞培養模型的建立方法目前已經知道的基質膠主要有海藻酸鈣凝膠、瓊脂糖凝膠，這兩種凝膠主要適用于懸浮細胞的培養，還有一種是血纖維蛋白，將動物細胞和血纖維蛋白原混合，然后參加凝血酶。凝血酶將血纖維蛋白原轉化為不溶性的血纖維蛋白，將動物細胞固定在其中。血纖維蛋白可以促進細胞貼壁，因此無論是懸浮細胞還是貼壁細胞都適合。實驗室大量使用的基質膠是Matrigel膠，是從小鼠腫瘤組織中提取的抽提物，在室溫下，Matrigel可自動聚集產生類似于哺乳動物細胞基底膜的生物活性基質材料。Matrigel基底膜基質形成的三維培養基質，可促進上皮細胞、肝細胞、Sertoli細胞、黑色素瘤細胞、血管內皮細胞、甲狀腺細胞及毛囊細胞等的貼壁與分化。同時，Matrigel還能影響乳腺上皮細胞的蛋白表達，支持外周神經的新生和牛輸卵管上皮細胞的分化。高濃度的Matrigel適用于研究體內血管生成和腫瘤細胞遷移及腫瘤模型的建立等。4.2三維細胞培養模型的種類三維立體培養的方法有多種，常用的有膠內培養模式(細胞與膠原膠混合)、膠上培養模式(細胞生長于膠原膠外表)和三明治培養模式(細胞生長于兩層膠原中間)。4.2常見三維細胞培養模型的建立方法

膠內培養模式的建立方法Matrigel母液濃度10.6mg/mL〔3〕,放置于4℃溶解(4)。消化細胞,重懸至完全培養基中計數,細胞懸液濃度為1×106/mL。使用時置于冰上,用預冷的細胞重懸液與Matrigel等體積混勻,24孔板中每孔參加100μl。37℃放置30min使其成膠,添加完全培養液。置于37℃5%CO2細胞培養箱中孵育,第二日換液,此后每隔一日換液一次[1]。膠上培養模式的建立方法在24孔培養板中每孔參加75μl冰上過夜解凍的Matrigel，置于37℃孵箱中孵育15min以上使Matrigel聚集。同時胰酶消化常規培養的正常鼻咽細胞及其高轉移潛能亞株5-8F,計數后離心收集細胞.然后把細胞懸浮于含2%Matrigel的Keratinocyte-SFM培養液中，細胞濃度為2*104/ml用加樣槍吹打成單個細胞后,每孔參加400μl細胞懸液于已經凝固的Matrigel上，置于含5%CO2的37℃孵箱中培養，每3-4天換新鮮培養液[2]。三明治培養模型的建立方法三明治模式前期工作和凝膠上模式相同,不同之處在于凝膠上的細胞經培養融合至(70、80)%左右時,吸去培養液,用無菌PBS沖洗兩次后添加第二層膠(200μl/孔),在37℃下培養30min使其凝固后,再在膠原凝固面上添加培養液[3]。三種模型的簡單解釋4.3不同模型的比較對于膠上培養模式，細胞可以黏附于細胞外基質外表并向再造基質膠中生長，但是只有貼近Matrigel膠的細胞才能得到固體細胞外基質的支撐，其他不能貼近再造基質膠的細胞仍然處于2D培養條件下，在培養過程中不能形成完全的立體克??；對于膠內培養模式，細胞直接重懸于完全融化的Matrigel膠條件下，細胞生長于完全固態的細胞外基質中，可以很好地模擬體內腫瘤細胞生長微環境，在培養過程中形成了巨大的、無極性的球狀細胞克隆。所以大多數的實驗建立三維模型采用膠內培養模式，但相對來說膠上培養模式簡單一些，對于操作的要求低一些。三種模型共同的缺點是無法對細胞直接利用顯微鏡進行連續的觀察，需要對某一特定時間的膠原塊進行固定制作電鏡標本。BCA2D細胞培養模型B細胞生長于Matrigel膠外表C細胞重懸于Matrigel膠中[4]5.1腫瘤生物學三維細胞培養已被廣泛運用到腫瘤學研究,在腫瘤的實驗性治療、腫瘤的侵襲性、轉移和中心壞死的機制、腫瘤的血管形成和營養供給、體內基因表達的模擬等方面發揮了不可替代的作用[5]。同時可以研究不同細胞間的相互作用，觀察兩種不同的細胞類型是否融合或是不相關地各自生長5.2軟骨和骨組織成熟的軟骨細胞和干細胞被廣泛用于三維細胞培養,以再生損傷的軟骨、骨、韌帶、肌腱和膝關節半月板。在培養系統中常參加一些生長因子,以刺激分化,產生組織.5.3循環系統和心臟各組織都配備有大小各異的血管。如何在成熟的組織中及時產生血管網絡是組織工程的重要課題;在治療領域,所關心的也是如何有目的地改變血管形成,利用三維培養可以清楚地觀察到細胞通過空間增殖、遷移和錨定,最終形成管狀結構。注釋〔2〕基質膠可認為是一種可溶性的基底膜基質。主要成分包括：層黏連蛋白、膠原IV等，同時含TGF-β成纖維細胞生長因子、組織纖維酶原活化因子以及其它在EHS腫瘤中自然表達的生長因子等?！?〕三維膠的最終濃度，需要根據實驗條件進一步確實定，濃度的上下不僅影響到凝膠的時間，同時影響到細胞在膠內存在的狀態。〔4〕Matrigel在22-35℃溫度環境下快速成膠，因此溶解時在4℃冰上過夜凍融〔4度時會隨著溫度的上升局部成膠〕。所有用品在使用前需置于冰浴，必須使用預冷的移液管、吸頭及小管操作Matrigel。成膠后的Matrigel可以在4℃24－48小時后重新呈液態。(5)Matrigel基底膜基質在室溫條件下，聚合形成具有生物學活性的三維基質，模擬體內細胞基底膜的結構、組成、物理特性和功能,基底膜是細胞外基質特化而形成的一種柔軟、堅韌的網膜結構。參考文獻[1]馮志華,米坤.Matrigel膠的肺腺癌細胞株A549體外三維培養的實驗研究[J].西部醫學,2021,21(9):[2]廖雯婷,汪慧民,李滿枝等.鼻咽癌變不同時期的體外三維培養模型建立的實驗研究[J].ChineseJournalofCancer,2005,24(11):1317-1321.[3]王銘潔,蔡文杰,姚泰,朱依純.血管內皮細胞和心臟組織塊