一、多糖提取分離的基本方法原料→前處理→提取→濃縮→沉淀→脫蛋白→脫色、脫脂→干燥→粗多糖第四講多糖的提取方法1．前處理根據原料的特點，前處量方法不同，一般包括：（1）非極性溶劑處理：脫脂、脫色對植物根、莖、葉、花、果及種子中的多糖，含脂高的應先脫脂，含色素的需進行脫色，通常采用丙酮、乙醚、乙醇進行預處理達到脫脂或脫色的目的。（也可將該操作放在后面）（2）80%乙醇水溶液處理有些原料中含有較多單糖和低聚糖，對多糖的純度造成影響。由于單糖和低聚糖可溶于熱的80%乙醇溶液中，而多糖則不能溶。故可用80%乙醇水溶液除原料中的單糖和低聚糖。2．提取（1）溶劑種類多糖是極性大分子化合物，大多采用不同溫度的水、稀堿溶液或氯化鈉水溶液作提取溶劑。（2）注意事項①盡量避免在酸性條件下提取，因為酸性條件能引起多糖中糖苷鍵的斷裂。②動物中所含多糖多是酸性多糖，常與蛋白質結合在一起，因此常用堿溶液提取法、中性鹽溶液提取法和蛋白酶水解法。③當采用堿溶液提取時，要特別注意前處理，以及溫度、pH值的控制。因為堿性溶液中比較容易發生美拉德反應，而美拉德反應一旦發生，所產生的色素極難去除，會對進一步的研究造成無法補救的影響。降低美拉德反應產生程度的方法：通過前處理去除小分子糖、避免pH值處于8-10的范圍、避免提取溫度處于60-80℃。3．濃縮濃縮操作應在盡量低的溫度下進行，并盡量防止提取物與氧氣的接觸。目的：防止多糖被氧化，保持多糖原有結構及生物活性。

(1)沉淀法

(2)吸附法將干葡聚糖凝膠G25（或吸水棒）加入抽提液中，兩者比例為1：5。由于凝膠吸水之故，抽提液的體積可縮小三倍左右，回收多糖約80%。(3)超濾法

超過濾即超濾，自20年代問世后，直至60年代以來發展迅速，很快由實驗室規模的分離手段發展成重要的工業單元操作技術。超濾現已成為一種重要的生化實驗技術，廣泛用于含有各種小分子溶質的各種生物大分子的濃縮、分離和純化。超濾是一種加壓膜分離技術，即在一定的壓力下，使小分子溶質和溶劑穿過一定孔徑的特制的薄膜，而使大分子溶質不能透過，留在膜的一邊，從而使大分子物質得到了部分的純化。

超濾根據所加的操作壓力和所用膜的平均孔徑的不同，可分為微孔過濾、超濾和反滲透三種。微孔過濾所用的操作壓通常小于4×104Pa，膜的平均孔徑為50nm-14μm，用于分離較大的微粒、細菌和污染物等。超濾所用操作壓為4×104Pa～7×105Pa，膜的平均孔徑為1-10nm，用于分離大分子溶質。反滲透所用的操作壓比超濾更大，常達到35×105Pa～140×105Pa，膜的平均孔徑最小，一般為1nm以下，用于分離小分子溶質，如海水脫鹽，制高純水等。

超濾技術的優點是操作簡便，成本低廉，不需增加任何化學試劑，尤其是超濾技術的實驗條件溫和，與蒸發、冰凍干燥相比沒有相的變化，而且不引起溫度、pH的變化，因而可以防止生物大分子的變性、失活和自溶。在生物大分子的制備技術中，超濾主要用于生物大分子的脫鹽、脫水和濃縮等。

超濾法也有一定的局限性：它不能直接得到干粉制劑。超濾技術的關鍵是膜：膜有各種不同的類型和規格，可根據工作的需要來選用。早期的膜是各向同性的均勻膜，即現在常用的微孔薄膜，其孔徑通常是0.05mm-1.0mm。近幾年來生產了一些各向異性的不對稱超濾膜。

常用的膜一般是由乙酸纖維或硝酸纖維或此二者的混合物制成。近年來為適應制藥和食品工業上滅菌的需要，發展了非纖維型的各向異性膜，例如聚砜膜、聚砜酰胺膜和聚丙烯腈膜等。這種膜在pH1～14都是穩定的，且能在90℃下正常工作。超濾膜通常是比較穩定的，若使用恰當，能連續用1～2年。暫時不用，可浸在1％甲醛溶液或0.2％疊氮化鈉NaN3中保存。

超濾膜的基本性能指標主要有：水通量（cm3/(cm2?h)）；截留率（以百分率％表示）；化學物理穩定性（包括機械強度）等。超濾裝置一般由若干超濾組件構成。通常可分為板框式、管式、螺旋卷式和中空纖維式四種主要類型。由于超濾法處理的液體多數是含有水溶性生物大分子、有機膠體、多糖及微生物等。這些物質極易粘附和沉積于膜表面上，造成嚴重的濃差極化和堵塞，這是超濾法最關鍵的問題，要克服濃差極化，通常可加大液體流量，加強湍流和加強攪拌。

國外生產超濾膜和超濾裝置最有名的廠家是美國的Milipore公司和德國的Sartorius公司。國內主要的研究機構和生產廠家是：中科院生態環境研究中心、杭州淡化和水處理開發中心、蘭州膜科學技術研究所、無錫化工研究所、上海醫藥工業研究所、天津膜分離工程研究所、北京化工廠、常熟膜分離實驗廠、無錫市超濾設備廠、無錫純水設備廠、天津超濾設備廠、湖北沙市水處理設備廠等。從膜的品種，以及從某些研究工作的深度方面看，我國與世畀先進國家的差距不很大，但在膜的質量性能及商品化方面尚有較大差距。

（4）透析法商品透析袋制成管狀，其扁平寬度為23mm-50mm不等。為防干裂，出廠時都用10％的甘油處理過，并含有極微量的硫化物、重金屬和一些具有紫外吸收的雜質，它們對生物活性物質有害，用前必須除去。可先用50％乙醇煮沸1小時，再依次用50％乙醇、0.01mol/L碳酸氫鈉和0.001mol/LEDTA溶液洗滌，最后用蒸餾水沖洗即可使用。實驗證明，50％乙醇處理對除去具有紫外吸收的雜質特別有效。使用后的透析袋洗凈后可存于4℃蒸餾水中，若長時間不用，可加少量NaN2，以防長菌。洗凈涼干的透析袋彎折時易裂口，用時必須仔細檢查，不漏時方可重復使用。

新透析袋如不作如上的特殊處理，則可用沸水煮五至十分鐘，再用蒸餾水洗凈，即可使用。透析進，通常要留三分之一至一半的空間，以防透析過程中，透析的小分子量較大時，袋外的水過量進入袋內將袋漲破。為了加快透析速度，除多次更換透析液外，還可使用磁子攪拌。透析的容器要大一些，可以使用大燒杯、大量筒和塑料桶。小量體積溶液的透析，可在袋內放一截兩頭燒園的玻璃棒或兩端封口的玻璃管，以使透析袋沉入液面以下。

檢查透析效果的方法是：用1％BaCl2檢查(NH4)2SO4，用1％AgNO3

檢查NaCl、KCl等。①把裝抽提液的透析袋埋在吸水力強的聚乙二醇（polyetheyleneglycol,分子量20000以上，簡稱PEG）或甘油中，10ml抽提液可在1小時內濃縮到幾乎無水程度。該方法的濃縮速度與透析袋的表面積以及PEG的數量有密切關系。②真空透析濃縮

（5）真空濃縮法（6）冷凍干燥法

4．沉淀常用方法：等電點法（酸性多糖、堿性多糖）、乙醇沉淀法。

5．脫蛋白（1）游離蛋白質的去除方法：

Sevag法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法、柱色譜法。前三種方法的缺點：操作用到大量有毒有機試劑，對操作者的身體健康造成危害；同時，操作往往要重復十幾次才能達到較好的效果，費時費力；最后，操作會造成多糖的大量損失。柱色譜法的優缺點：一次操作既可達到良好效果，但所選擇的色譜材料不能對多糖有影響。（2）結合蛋白質的去除結合蛋白常用蛋白酶法去除：鏈霉菌蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶及胰蛋白酶等處理多糖提取液或多糖粗品，經