蛋白質含量的測定方法

蛋白質相對分子量測定

純化蛋白質的濃縮、干燥和保存

蛋白質的免疫印跡分析

(westernblotting)蛋白質組學定量研究常見方法當前1頁，共64頁，星期一。第一頁，共六十四頁。第一節蛋白質的含量測定當前2頁，共64頁，星期一。第二頁，共六十四頁。目前蛋白質的直接定量分析技術只能測定樣品的總蛋白含量；目前沒有任何方法能直接分析樣品中某一特定蛋白成分的含量；最常用的蛋白定量方法是比色法，包括Bradford（考馬斯亮藍）、BCA法、紫外分光光度法等。當前3頁，共64頁，星期一。第三頁，共六十四頁。蛋白質的比色法含量測定基于蛋白質的元素組成特點基于蛋白質的化學顯色反應基于蛋白質的光吸收特性當前4頁，共64頁，星期一。第四頁，共六十四頁。一、基于蛋白質元素組成的特點

凱氏定氮法各種蛋白質的含氮量很接近，平均為16％由于體內的含氮物質以蛋白質為主，因此只要測定生物樣品中的含氮量，就可以根據以下公式推算出蛋白質的大致含量：100克樣品中蛋白質的含量(g%)=每克樣品含氮克數×6.25×1001/16當前5頁，共64頁，星期一。第五頁，共六十四頁。凱氏定氮法1883年，丹麥化學家Kjeldahl建立，基于蛋白質的含氮量在16%左右。蛋白質+硫酸→CO2+H2O+NH3→硫酸銨+強堿→氨優點：適用樣品廣泛，結果可靠缺點：樣品中非蛋白態氨影響測定值；蛋白質氨基酸有偏差時（大量堿性氨基酸、酰胺、小分子量氨基酸）誤差較大；操作繁瑣。當前6頁，共64頁，星期一。第六頁，共六十四頁。二、基于蛋白質的光吸收特性

紫外光譜(A280)吸收法

這一方法可用來快速檢測溶液中是否含有蛋白質成分。通常用于柱層析過程中檢測蛋白質的洗脫峰。當前7頁，共64頁，星期一。第七頁，共六十四頁。原理芳香族氨基酸的紫外吸收蛋白質中的Trp、Tyr在280nm有特征性吸收；肽鍵在215nm附近有特異吸收。可通過測定該波長的光吸收度，計算蛋白質濃度。C＝A/KL，其中A為吸光度，K為摩爾消光系數，L為光程。K值可通過各種方法得到（包括軟件分析等）。當前8頁，共64頁，星期一。第八頁，共六十四頁。所需時間

幾分鐘優點

快速缺點

核酸可引起強干擾作用靈敏度0.2mg/ml～2mg/ml

對蛋白質無破壞性

不是嚴格的定量，適用于測定蛋白質粗提液當前9頁，共64頁，星期一。第九頁，共六十四頁。計算方法

標準曲線法

蛋白質濃度(mg/ml)=1.45×A280-0.74×A260注意事項

石英比色杯

調零所用溶液

配制標準蛋白所用溶液

光密度范圍當前10頁，共64頁，星期一。第十頁，共六十四頁。二、Bradford檢測法由Bradford等人于1976年建立

這是一種迅速、可靠的通過染色法測定溶液中蛋白質含量的方法目前絕大多數公司都提供基于此原理的蛋白質定量試劑盒基于蛋白質的化學顯色反應當前11頁，共64頁，星期一。第十一頁，共六十四頁。原理

該法是基于考馬斯亮藍G-250有紅、藍兩種不同顏色的形式。在一定濃度的乙醇及酸性條件下，可配成淡紅色溶液，當與蛋白質結合后，產生藍色化合物，反應迅速而穩。藍色復合物在595mn波長處具有最大光吸收值，并與溶液中蛋白質濃度成正比，因此可檢測595mn的光吸收值大小計算蛋白的含量當前12頁，共64頁，星期一。第十二頁，共六十四頁。所需時間10min優點

快速（反應時間僅需2min）

敏感，幾乎沒有蛋白質損失缺點

用這種測定方法對蛋白質引起不可逆的變性靈敏度25ug/ml～200ug/ml

對各種純化蛋白質反應不同當前13頁，共64頁，星期一。第十三頁，共六十四頁。計算方法

標準曲線法注意事項

標準曲線在2.5ug～15ugBSA濃度范圍內保持線性關系

反應10～15min后開始出現沉淀，尤其是高濃度蛋白質溶液在酸性條件下易發生沉淀

若選用目的蛋白來做標準曲線或用另一種方法來校正，所測蛋白濃度較準確當前14頁，共64頁，星期一。第十四頁，共六十四頁。三、Lowry檢測法

1951年Lowry在Folin酚試劑法和雙縮脲法的基礎上建立這一標準、快速的蛋白質定量檢測方法已得到廣泛應用，在檢測之前可通過蛋白質沉淀將干擾物質去除基于蛋白質的化學顯色反應當前15頁，共64頁，星期一。第十五頁，共六十四頁。原理

首先在堿性溶液中形成銅-蛋白復合物，然后這一復合物還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑(Folin-酚試劑)，產生鉬藍和鎢藍復合物的深藍色，這種深藍色的復合物在745～750nm處有最大的吸收峰，顏色的深淺(吸收值)與蛋白質濃度成正比，可根據750nm的光吸收值大小計算蛋白質的含量當前16頁，共64頁，星期一。第十六頁，共六十四頁。所需時間40min優點

一種可靠的蛋白質定量方法

不同蛋白質之間差別很小缺點

某些試劑不穩定靈敏度5ug/ml～100ug/ml

干擾物質多

反應速度慢

使蛋白質發生不可逆變性當前17頁，共64頁，星期一。第十七頁，共六十四頁。計算方法

標準曲線法注意事項

在加入試劑30min后呈色達到飽和，時間延長顏色信號減弱

許多干擾物質降低顏色反應

高鹽濃度可引起沉淀當前18頁，共64頁，星期一。第十八頁，共六十四頁。4：化學標記法—ICAT（2）ICAT分子量相對較大（約500Da），與蛋白質連接后可能會造成分子的空間位阻第五十一頁，共六十四頁。純化蛋白質的濃縮、干燥和保存第五十二頁，共六十四頁。根據質譜譜圖中成對峰的面積之比可判斷出同一肽段在不同樣品中的含量變化，根據二級譜圖對肽段進行序列測定從而鑒定蛋白質。3：代謝標記法—15N標記法2、蛋白質分離：蛋白質經過2D分離后染色（銀染、考染等）。當前19頁，共64頁，星期一。另一種方法來校正，所測蛋白濃度首先在堿性溶液中形成銅-蛋白復合物，然后這一復合物還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑(Folin-酚試劑)，產生鉬藍和鎢藍復合物的深藍色，這種深藍色的復合物在745～750nm處有最大的吸收峰，顏色的深淺(吸收值)與蛋白質濃度成正比，可根據750nm的光吸收值大小計算蛋白質的含量當前51頁，共64頁，星期一。當前55頁，共64頁，星期一。優點：適用樣品廣泛，結果可靠在堿性環境下蛋白質分子中的肽鍵能與Cu2＋生成絡合物，同時將Cu2＋還原成Cu＋。四、BCA(二喹啉甲酸)檢測法

這是近年來新研制的一種改進的Lowry測定法，反應簡單而且幾乎沒有干擾物質的影響，有試劑盒出售。基于蛋白質的化學顯色反應當前19頁，共64頁，星期一。第十九頁，共六十四頁。原理

在堿性環境下蛋白質分子中的肽鍵能與Cu2＋生成絡合物，同時將Cu2＋還原成Cu＋。而BCA試劑可敏感特異地與Cu＋結合，形成穩定的有顏色的復合物，在562nm處有高的光吸收值。顏色的深淺與蛋白質濃度成正比，可根據吸收值的大小來計算蛋白質的含量。當前20頁，共64頁，星期一。第二十頁，共六十四頁。優點

與Lowry法相比幾乎沒有干擾物質的影響缺點

蛋白質發生不可逆的變性靈敏度

標準檢測：10～1200ug/ml

單一試劑

終產物穩定

反應時間長

微量檢測：0.5～10ug/ml當前21頁，共64頁，星期一。第二十一頁，共六十四頁。計算方法

標準曲線法注意事項

與Lowry相比，采用BCA法時，如果樣品中含有脂類物質將明顯提高光吸收值

為促進BCA法的反應進程，可將樣品適當加熱當前22頁，共64頁，星期一。第二十二頁，共六十四頁。其它蛋白質的定性定量方法1.蛋白質的染色定量2.ELISA測定3.放射免疫測定當前23頁，共64頁，星期一。第二十三頁，共六十四頁。第二節蛋白質相對分子量測定分子量測定(molecularweight,MW)排阻層析沉降平衡超速離心動態彈性光散射孔徑梯度電泳質譜(ESI-MS)當前24頁，共64頁，星期一。第二十四頁，共六十四頁。1.SDS測定分子量基本原理：SDS可以破壞蛋白質中的疏水鍵和氫鍵，并按一定比例（1g蛋白質結合1.4gSDS）和蛋白質組成復合物，使蛋白質帶的負電荷的量遠遠超過其本身的電荷量，并與蛋白質的分子量成正比。2-巰基乙醇破壞了蛋白質二硫鍵，使蛋白質呈橢圓棒形，其軸長與分子量成正比。

＝q/f＝q/6

r

，所有蛋白質的遷移率都相同。當前25頁，共64頁，星期一。第二十五頁，共六十四頁。在SDS中遷移的蛋白質的分子量與電泳遷移率的關系符合下述公式：lgMr＝lgK－bm＝K1－bm其中Mr為蛋白質相對分子量，K、K1為常數，b為斜率，m為遷移率。注意：此公式也適用于核酸在瓊脂糖凝膠中的遷移當前26頁，共64頁，星期一。第二十六頁，共六十四頁。其中Mr為蛋白質相對分子量，K、K1為常數，b為斜率，m為遷移率。（1）它不能用于標記不含半胱氨酸或半胱氨酸含量低的蛋白質。當前19頁，共64頁，星期一。1、報告部分：有八種，因此iTRAQ可同時標記8組樣品。如果樣品中含有脂類物質將明顯第五十九頁，共六十四頁。1、樣品準備：提取對照組和不同實驗組的蛋白質,定量,cy3和cy5交叉標記，同時將所有實驗組與對照組的樣品等量混合后cy2標記，作為內標。根據質譜譜圖中成對峰的面積之比可判斷出同一肽段在不同樣品中的含量變化，根據二級譜圖對肽段進行序列測定從而鑒定蛋白質。優點：適用樣品廣泛，結果可靠對各種純化蛋白質反應不同重現性：降低由于樣品制備不同而造成的實驗內差異；SILAC即細胞培養條件下穩定同位素標記技術(Stableisotopelabelingwithaminoacidsincellculture，SILAC)，其基本原理是在細胞培養時，采用含有輕、中、重同位素型必需氨基酸的培養基進行細胞培養，用于SILAC主要的穩定同位素氨基酸是Lys和Arg,細胞在傳代培養過程中同位素氨基酸將被細胞用于合成蛋白質，細胞經傳代培養5-6代后，細胞的所有蛋白質將被同位素標記，等量混合標記的蛋白質后經過SDS分離和質譜分析，通過比較一級質譜圖中三個同位素型肽段的面積大小進行相對定量，同時二級譜圖對肽段進行序列測定從而鑒定蛋白質。質譜(ESI-MS)第四十九頁，共六十四頁。當前10頁，共64頁，星期一。當前27頁，共64頁，星期一。第二十七頁，共六十四頁。當前28頁，共64頁，星期一。第二十八頁，共六十四頁。在半對數坐標紙上做出標準曲線注意：標準曲線的斜率會根據所用凝膠濃度而發生微小的改變。當前29頁，共64頁，星期一。第二十九頁，共六十四頁。2.凝膠過濾層析法測定分子量蛋白質在凝膠過濾層析柱中的洗脫體積Ve，與其分子量的關系如下式所示：

lgMr＝K1－K2

Ve在實驗中，只要測得幾種蛋白質分子量標準物的Ve，并以它們的lgMr對Ve作圖得一直線，再測出樣品的Ve，即可從圖中得到樣品的分子量。當前30頁，共64頁，星期一。第三十頁，共六十四頁。SDS與凝膠過濾法是互補的凝膠過濾法測得的是蛋白質四級結構（如果它有的話）的分子量；SDS測得的是蛋白質亞基的分子量；在有2-巰基乙醇（或DTT）存在時，SDS可測得蛋白質每條多肽鏈的分子量。綜合應用這兩種方法，可得到待測蛋白質結構的許多信息。當前31頁，共64頁，星期一。第三十一頁，共六十四頁。例如：凝膠過濾法得到的蛋白質分子量：180kDSDS（不加還原劑）結果：45kDSDS（加還原劑）結果：兩條蛋白帶（15kD和30kD）則結論是：該蛋白質由4個相同的亞基組成，每個亞基由兩條多肽鏈經二硫鍵連接而成，兩條多肽鏈的分子量分別為15kD和30kD。當前32頁，共64頁，星期一。第三十二頁，共六十四頁。3.質譜法是最精確的分子量測定方法質譜（MassSpectrometry，MS）是帶電原子、分子或分子碎片按質荷比（m/z）的大小順序排列的圖譜。由于ESI和MALDI兩大電離技術的出現，質譜技術已廣泛應用于蛋白質研究領域，包括蛋白質分子量測定。精確度0.01～0.1％。當前33頁，共64頁，星期一。第三十三頁，共六十四頁。當前34頁，共64頁，星期一。第三十四頁，共六十四頁。第三節純化蛋白質的濃縮、干燥和保存當前35頁，共64頁，星期一。第三十五頁，共六十四頁。一、蛋白質的濃縮超濾法使用特制薄膜對溶液中的溶質分子進行選擇性過濾的技術。常用離心力使蛋白質透過濾膜，而使蛋白質截留在膜內。當前36頁，共64頁，星期一。第三十六頁，共六十四頁。冷凍干燥法在冷凍狀態下使樣品中水分升華而濃縮蛋白質的技術，保持蛋白質構象的最好方法。注意：必須保證蛋白質始終處于冷凍狀態（在－70℃冰箱預冷），為提高溶解度可加賦形劑（右旋糖酐、甘露醇等）。當前37頁，共64頁，星期一。第三十七頁，共六十四頁。吸收法采用吸水劑直接吸去蛋白質溶液中的水。PEG、蔗糖、凝膠干粉等。沉淀法硫酸銨、PEG、有機溶劑沉淀；免疫沉淀。當前38頁，共64頁，星期一。第三十八頁，共六十四頁。5.其它方法濃縮膠濃縮法離子交換法吸附法蒸發法當前39頁，共64頁，星期一。第三十九頁，共六十四頁。二、蛋白質的干燥常壓吸收干燥真空干燥冷凍干燥噴霧干燥氣流干燥當前40頁，共64頁，星期一。第四十頁，共六十四頁。三、蛋白質的保存影響蛋白質成品保存的因素：

1）空氣

2）濕度

3）水分

4）光線

5）pH值

6）時間當前41頁，共64頁，星期一。第四十一頁，共六十四頁。2.蛋白質的保存方法低溫下保存制成干粉或結晶保存在保護劑下保存

a.惰性的生化或有機物

b.中性鹽

c.巰基試劑當前42頁，共64頁，星期一。第四十二頁，共六十四頁。第四節蛋白質組學定量研究常見方法當前43頁，共64頁，星期一。第四十三頁，共六十四頁。蛋白質組學定量研究常見方法1：常規雙向電泳2：DIGE3：15N等同位素標記4：ICAT5：iTRAQ6：SILAC當前44頁，共64頁，星期一。第四十四頁，共六十四頁。1：雙向電泳

基于2D的經典定量分析方法。

1、樣品準備和定量：抽提對照組和各種不同實驗組的蛋白質。

2、蛋白質分離：蛋白質經過2D分離后染色（銀染、考染等）。

3、蛋白質的定性與定量分析：通過與對照組相ImageMaster7.0分析出實驗組中差異點，質譜鑒定差異點蛋白質,同時應用軟件分析出其表達量的變化。當前45頁，共64頁，星期一。第四十五頁，共六十四頁。2：DIGE簡介：

DIGE—

雙向熒光差異凝膠電泳，利用熒光染料（Cy2,Cy3,Cy5）能與蛋白質賴氨酸的氨基反應而使蛋白質被標記，標記后蛋白質的等電點和分子量基本不受影響，等量混合標記好的蛋白質后進行雙向電泳，蛋白質表達量的變化則通過不同熒光的強度來體現。技術優勢：

1：高效性，同一塊凝膠上可以電泳兩個樣品，減輕了工作量；

2：與常規銀染相比靈敏度更高；

3：檢測動態范圍更大；

4：定量精確,采用內標而消除了膠與膠之間的實驗誤差；

5：統計學分析，ImageMaster7.0（DIGE）軟件可以得到統計學可信的結果，降低了操作者之間的偏差。當前46頁，共64頁，星期一。第四十六頁，共六十四頁。2：DIGE

DIGE熒光定量方法流程圖.1、樣品準備：提取對照組和不同實驗組的蛋白質,定量,cy3和cy5交叉標記，同時將所有實驗組與對照組的樣品等量混合后cy2標記，作為內標。

2、蛋白質分離：等量混合三種熒光素標記后的蛋白質，2D電泳分離，熒光顯色。

3、蛋白質定量分析：ImageMaster7.0（DIGE)分析同一蛋白質不同處理后的表達量變化。當前47頁，共64頁，星期一。第四十七頁，共六十四頁。3：代謝標記法—15N標記法簡介：在培養基中添加15N，細胞經過若干代培養后，蛋白質將完全被同位素標記，等量混合標記與沒有標記同位素的樣本、液相色譜和SDS分離，質譜鑒定和定量。根據質譜譜圖中成對峰的面積之比可判斷出同一肽段在不同樣品中的含量變化，根據二級譜圖對肽段進行序列測定從而鑒定蛋白質。優點：高效性：15N標記法是體內標記技術，標記效率可高達95%；重現性：降低由于樣品制備不同而造成的實驗內差異；靈活性：在培養基中添加同位素標記15N，操作方便。缺點：

（1）只有已知蛋白質的氨基酸序列，才可以對14N/15N標記的蛋白質或肽段的相應質量位移進行預測。（2）由于使用的15N培養基純度>96%，無法完全置換14N,所以15N標記的肽段在質譜中會有額外的同位素峰。當前48頁，共64頁，星期一。第四十八頁，共六十四頁。4：化學標記法—ICATA:ICAT試劑結構，包括3個部分，SH反應集團，biotin標簽，同位素臂，試劑具有兩種形式：重型（含8個氘）和輕型（不含氘）B:ICAT標記定量技術流程，來源不同處理的蛋白質分別用重型ICAT試劑和輕型ICAT試劑標記，標記后等量混合，胰蛋白酶酶切，親和純化得到ICAT標記的多肽，質譜分析，依據MS質譜峰圖強度進行定量，MS/MS鑒定肽段。當前49頁，共64頁，星期一。第四十九頁，共六十四頁。4：化學標記法—ICATICAT法的缺點：（1）它不能用于標記不含半胱氨酸或半胱氨酸含量低的蛋白質。（2）ICAT分子量相對較大（約500Da），與蛋白質連接后可能會造成分子的空間位阻（3）ICAT分子量相對較大（約500Da），由于在MS分析中標簽仍保留在每個肽上，使得在碰撞誘導解吸（CID)條件下，很容易被片段化，那么標簽特異化的片段離子就會使串聯質譜分析標記肽段的過程復雜化，（4）ICAT分子量相對較大（約500Da），這對小肽而言是一個較大的修飾物，會增加數據庫搜索的復雜性（5）標記時通常需要延長時間來保證ICAT與蛋白質充分結合，這可能會造成賴氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸發生氨基酸局部衍化。（6）與原子結合的硫醚鍵化學穩定性較低，可能會自發發生β-消除反應使部分標簽斷裂。當前50頁，共64頁，星期一。第五十頁，共六十四頁。5:化學標記法—iTRAQ簡介：

iTRAQ試劑是可與氨基酸末端氨基及賴氨酸側鏈氨基連接的胺標記同重元素。在質譜圖中，任何一種iTRAQ試劑標記不同樣本中的同一蛋白質表現為相同的質荷比。在串聯質譜中，信號離子表現為不同質荷比(113-119，121)的峰，因此根據波峰的高度及面積，可以鑒定出蛋白質和分析出同一蛋白質不同處理的定量信息。iTRAQ結構

iTRAQ包括三部分：報告部分、肽反應部分、平衡部分。

1、報告部分：有八種，因此iTRAQ可同時標記8組樣品。

2、肽反應部分：能與肽N端及賴氨酸側鏈發生共價連接而標記上肽段，幾乎可以標記所有蛋白質。

3、平衡部分：保證iTRAQ標記的同一肽段的質荷比相同。當前51頁，共64頁，星期一。第五十一頁，共六十四頁。5:化學標記法—iTRAQ與傳統基于雙向電泳定量分析相比，iTRAQ具有以下技術優勢：1：靈敏度高，檢測限低，可檢測出低豐度蛋白；2：分離能力強,分析范圍廣,iTRAQ可以對任何類型的蛋白質進行鑒定，包括高分子量蛋白質、酸性蛋白和堿性蛋白，膜蛋白和不溶性蛋白。3:高通量：同時對8個樣本進行分析，提高了實驗通量，可同時對多個時間點或不同處理的蛋白質進行分析；4：結果可靠：定性與定量分析結果更加可靠；5：自動化程度高：液相與質譜連用，自動化操作，分析速度快，分離效果好。當前52頁，共64頁，星期一。第五十二頁，共六十四頁。5:化學標記法—iTRAQiTRAQ法。

1：樣本經過不同處理后，提取蛋白質;2：蛋白質經過還原，封閉后胰蛋白酶酶切;3：肽段混合物分別用不同的iTRAQ標記;4：等量混合各種iTRAQ試劑標記的肽段;5：MS/MS質譜檢測及分析。當前53頁，共64頁，星期一。第五十三頁，共六十四頁。6:SILACSILAC即細胞培養條件下穩定同位素標記技術(Stableisotopelabelingwithaminoacidsincellculture，SILAC)，其基本原理是在細胞培養時，采用含有輕、中、重同位素型必需氨基酸的培養基進行細胞培養，用于SILAC主要的穩定同位素氨基酸是Lys和Arg,細胞在傳代培養過程中同位素氨基酸將被細胞用于合成蛋白質，細胞經傳代培養5-6代后，細胞的所有蛋白質將被同位素標記，等量混合標記的蛋白質后經過SDS分離和質譜分析，通過比較一級質譜圖中三個同位素型肽段的面積大小進行相對定量，同時二級譜圖對肽段進行序列測定從而鑒定蛋白質。由于SILAC標記技術是體內標記技術，幾乎不影響細胞的功能，同時靈敏度高，因此其在蛋白質組學相關領域中得到了廣泛的應用，如比較蛋白質組學，蛋白質與蛋白質相互作用，蛋白質與DNA相互作用，蛋白質與RNA相互作用等領域。當前54頁，共64頁，星期一。第五十四頁，共六十四頁。6:SILAC

技術優勢——目前比較蛋白質組學最先進方法

（1）高效性：SILAC是體內標記技術，標記效率可高達100%；（2）定量精確：線性范圍廣，降低由于樣品制備不同而造成的實驗內差異；（3）高通量、靈敏度高：可同時鑒定并定量數百至數千種蛋白質，且檢可測測到納克級水平；（4）相容性：可以對多種在DMEM或RPMI1640培養基中能夠培養的細胞或細菌中表達的蛋白進行標記；（5）靈活性：在缺乏L-賴氨酸和L-精氨酸的培養基中添加同位素標記的這兩種氨基酸，操作方便。當前55頁，共64頁，星期一。第五十五頁，共六十四頁。6：SILACSILAC法。

1、標記：在缺乏Lys和Arg的培養基中添加Lys和Arg的同位素Lys(D4或13C615N4)、Arg(13C6,或13C615N4)等培養細胞，使蛋白質被標記成“中型”或“重型”；

2、細胞處理，如藥物處理；

3、細胞裂解、提取蛋白質；

4、等量混合對照與處理組蛋白質、SDS電泳、染色；

5、割取蛋白質條帶，