22DetectionofClonorchissinensiseggsinhumanfeces-PCRandrealtimePCRI 5.2材料 2 2 2 3 3 3 4 4 5 6 7本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定本文件主要起草人：馬文晨、孟慶峰、趙大力、王瑋琳、劉金華、孟日增、王偉1人糞便中華支睪吸蟲蟲卵檢測PCR和實時熒光PCR法GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗4縮略語CTAB：十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrithyDNA：脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacidNTP：脫氧核苷酸三磷酸（deoxyriboEDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticaFAM：6-羧基熒光素(6-carboxyfluorescTE緩沖液：Tris-HCl、EDTA緩沖液（Tris-EMGB：小溝結合物（minorgroovebinder）5.1.1除另有規定外，試劑為分析純或生化試劑。25.1.10異丙醇。5.1.13加樣緩沖液。5.1.14GoldenView核5.1.15PremixTaq反應預混5.1.16PremixExTaq（ProbeqPCR2×)反應預混液（市售商品化熒光PCR基礎試劑）。5.1.17瓊脂糖凝膠。5.35.3.1無DNA酶污染的離心5’-TTGTCTGGGTAGGGTGGTTTG-3’5’-ACTATCCCAGTAACCCCGCC-3’5’-TATAGTTTGTCTGGGTAGGGTGGTT-3’5’-AACAGCAGTCCCCAAATCCA-3’5’-FAM-AGCTCATCATATGTTTACTG-MGB-3’36.5生物安全柜。6.7核酸蛋白分析儀或紫外分光6.9研缽或冷凍粉碎裝置。6.12高壓滅菌器。8.4加2倍體積CTAB沉淀液（0.5%），室溫靜止60m8.5加入350μLNaCl溶液將沉淀重懸浮。再加入350μL三氯甲烷，旋渦振蕩進行混勻，8.9可使用等效的商品化DNA提取試劑盒，按操作說明書進行操作。4N——核酸稀釋倍數。作陽性對照，用不含目標基因的核酸做陰性對照，用水做空用量(μL）（含PCR緩沖液、dNTP、Mg2+、Tap酶）分子量作對照，使用100bpDNA分子量標準。5V/cm恒壓電泳3卵核酸陰性，表述為“未檢出華支睪吸蟲蟲卵核酸”；如被檢樣品有條帶，大小為231bp，即判定為華支睪吸蟲蟲卵核酸陽性，表述為“檢出華支睪吸蟲蟲10.1.4.2必要時取PCR擴增產物進行序列測定，測序結果與附錄B華支睪吸蟲蟲卵的D5作陽性對照，用不含目標基因的核酸做陰性對照，用水做空用量(μL）PremixExTaq（ProbeqPCR2×)（含PCR緩沖液、dNTP、Mg2+、Ta），線，判定為華支睪吸蟲蟲卵核酸陽性，否則判定為華支睪吸蟲蟲卵6試劑配制A.6蛋白酶K溶液（20mg/mL稱量A.7NaCl溶液（1.2mol/L稱取8kPa蒸汽壓（121℃)條件下滅菌20min，室溫保存。A.11加樣緩沖液：稱取0.88gNa2EDTA?7B.1PCR擴增產物序列（231bp，GenBankNo.：OM81033TTGTCTGGGTAGGGTGGTTTGAGCTCATCATATGTTTACTGTTGGGCTGGATTTGGGGACTGCTGTTTTTTTTAGCTCGGTATGATTATAGGTGTGCCTACAGGGATCAAGGT