生物學基本技能基本技能

Ⅻ生物人工雜交CONTENTS目

錄01Part01實驗目的03Part03植物人工雜交技術02Part02雜交相關術語04Part04動物人工雜交技術05Part05微生物人工雜交技術06Part06實驗操作實訓1.了解各種生物人工雜交技術的基本原理和操作流程。2.掌握動物、植物和微生物的人工雜交技術。一、實驗目的雜交技術是遺傳分析和遺傳育種常用的最基本的實驗方法，通過雜交可以獲得雜種或新的種質資源，繼而選擇培育出新品種。根據雜種產生的方式，雜交技術可分為自然雜交和人工雜交。自然雜交亦稱為“天然雜交”，是遺傳基礎不同的親本在自然狀態下的交配，產生的雜種具有雙親遺傳性或超親本性狀，易于定向培育，是常規育種的重要原始材料。人工雜交是指在人工控制的條件下，按照預定的目標、計劃，遵循一定的程序，采用一定的方法，使遺傳性不同的親本進行交配或結合，產生的雜種具有雙親遺傳性或超親本性狀。一般情況下，雜交都要經過個體間的接觸即交配，這種雜交稱為有性雜交；如果沒有交配的過程，則稱為無性雜交。把體細胞相互融合的過程稱為體細胞雜交。雜交可以發生在不同的水平上，有個體水平上的雜交、細胞水平上的雜交和分子水平上的雜交。按生物的種類又可分為植物雜交、動物雜交、微生物雜交、噬菌體雜交等。二、雜交相關術語植物有性雜交是利用遺傳性狀不同的親本進行交配，以組合兩個或多個親本的優良性狀于雜種體中，并經過基因的分離和重組，產生各種性狀的變異類型，從中選出需要的基因型，進而創造出對人類有利的優良品種。（一）水稻雜交技術1）調節開花期。水稻母本和父本花期的調整，可用分期播種的方法，使二者的花期相遇。2）選株。選株主要指選擇母本植株。要選擇具有本品種典型性狀、生長健壯和沒有病蟲害的植株作母本。3）選穗。用鑷子輕輕撬開稻穗中部的小穗，若中部的小穗在當天或次日能夠開花，則雌稻穗可以作為母本。當天能夠開花的標志是花絲已經伸長，花藥即將頂到內稃上端；次日開花的標志是雄蕊的長度已達內稃長度的2/3。可以將小穗對著太陽觀看，從外表能隱約看到雄蕊在花里的位置。4）整穗。先用剪刀剪去母本稻穗上部和下部枝梗上的小穗，留下中部枝梗上的20～30個小穗，其他小穗統統剪去。三、植物人工雜交技術（一）水稻雜交技術5）去雄（1）常規去雄法：常規去雄法包括溫水殺雄、剪穎去雄、化學殺雄等，水稻育種多采用前兩種方法。溫水殺雄去雄較徹底，但操作不便、效率低，不能滿足高效育種工作的需要。剪穎去雄是水稻育種應用最多的方法，操作簡便、實用，但將一朵穎花中的花藥完全剪去的同時，很容易傷及雌蕊柱頭。一般情況下雌蕊柱頭在穎殼中低于雄蕊花藥，但很多水稻品種也存在柱頭與花藥齊平或者微低的情況，常規剪穎去雄難以保證不傷及柱頭，容易導致柱頭被傷，雜交失敗。（2）改良的剪穎去雄法：將水稻穎殼中的雄蕊花藥完全剪去改為剪去一半或更少，即要將花藥剪破，然后馬上向剪雄后的穎殼內澆水，將花藥打濕。由于雄蕊被打濕，濕度增加，花絲很快就會伸長，干癟的花藥伸出穎殼，此時用手指輕彈幾下，干癟的花藥就會被彈掉，然后套上紙袋，等待授粉。此剪穎法，傷及雌蕊柱頭的可能性大大降低，從而大大提高了雜交的成功率。為提高工作效率，可在授粉的前一天下午等花完全開過后剪穎澆水，然后第二天上午開花之前套袋。三、植物人工雜交技術（一）水稻雜交技術6）套袋掛牌。不管是采用哪一種方法去雄，去雄后都要及時在母本的稻穗上套上白色硫酸紙制作的袋子，以防發生自然雜交，并在母本稻穗下方掛上特制的小紙牌，用鉛筆在小紙牌上注明母本名稱、去雄日期、操作者姓名等內容。7）采粉和授粉。去雄的母本稻穗應在當天或次日進行人工授粉。（1）常規授粉：打開母本稻穗上的袋子，利用盛花期的父本稻穗在剪穎的母穗上抖動，使花粉掉落在母穗花的柱頭上，從而達到授粉的目的。通常情況下，此法很實用，但在大風等惡劣天氣下，此法效果并不好。因為盛花期的父本穗經大風一吹，所剩的花粉已很少，在人工取穗時碰撞又使花粉散落，花粉所剩無幾，雜交成功率大打折扣。（2）新技術授粉：在父本穗盛花期來到之前（少數穎殼開始開花），將父本穗剪下，剪去已開過花的穗子，將剩下的穗用水打濕，然后甩干放入套紙袋的母穗上，將紙袋口封住，等父本穗大量開花時，抖動父本穗，父本穗上的花粉就不會有任何損失。將父本穗事先都剪好放入母穗中，等開花時逐一授粉，大大提高了工作效率和雜交成功率。三、植物人工雜交技術（一）水稻雜交技術8）檢查。花粉被授到柱頭以后，經過2～3min就可萌發形成花粉管，30min后花粉管進入胚囊，受精過程在開花后1.5～4h內完成。授粉10天以后，摘去雜交穗上的紙袋，如果授粉小花內的子房已經膨大，表示已經受精，說明雜交成功。為了使雜交種子正常進行生長發育，可暫時不套紙袋，待籽粒長大時再套紙袋，以防鳥類啄食。9）收獲。雜交籽粒成熟后，將每個雜交稻穗單獨脫粒、保存，供來年播種觀察。三、植物人工雜交技術（二）小麥雜交技術1）確定組合、種植親本。根據育種目標，確定雜交組合。根據雙親生育期調整播期，晚熟的早播，早熟的遲播或分2～3期播種，每期相隔10～15天，以確保花期相遇。2）選穗。根據雜交組合，在母本種植區內，選擇具有該親本典型性狀且健壯無病蟲害的植株作為雜交母本株，選取抽穗但未開花、中部小穗的花藥呈黃綠色的麥穗作為雜交母穗。3）整穗。用剪刀剪去上下部發育不良或過嫩的小穗，有芒品種剪去芒，每穗留中部小穗8～10個；用鑷子夾去小穗上部的小花，每小穗只保留基部外側兩朵小花供去雄。4）去雄。從穗的一側上部小穗開始順序而下，用剪刀剪去小花上部1/3左右的穎殼，用鑷子輕輕取出每朵小花中的3枚花藥。如花藥破裂或傷及柱頭，則將該小花除去，并將鑷子浸入乙醇以殺死所沾花粉。三、植物人工雜交技術（二）小麥雜交技術5）套袋。將麥穗上全部小花去雄后，立即套上透明硫酸紙袋，并將其下端斜折，用大頭針別好。在麥穗和劍葉葉鞘間掛上小紙牌，注明母本名稱、去雄日期和操作者姓名等，并在工作簿上逐一記錄。6）授粉。在去雄后第2～3天內授粉，通常在上午開花盛期進行，陰雨天可略推遲。普通授粉法；捻穗授粉法。授粉后在小紙牌上注明父本名稱和授粉日期，并在工作簿上逐一記錄。7）收獲。待種子成熟后，及時按雜交組合將雜交穗收回，曬干脫粒，調查結實率，并按雜交組合或代號進行登記、編號，以備下季種植。三、植物人工雜交技術（三）棉花雜交技術1）母本選株和定蕾。在棉花開花的前一天16：00以后，在擬定組合的母本行中選擇具有母本典型性狀的生長健壯、無病優良的植株。第二天早晨必開的花的外觀是：花冠呈螺旋形折疊，但花瓣已經長大露出苞葉。2）去雄。授粉前一天下午，先檢查和摘除田間已自花授過粉的棉鈴，再對第二天將要開放的花朵實施剪雄去雄。用剪刀在花萼基部或花冠兩側剪開一條縫，然后把縫撥開，使雄蕊和雌蕊露出（也可剪去一部分花冠），再用剪刀或鑷子除去花藥。3）父本隔離。在母本去雄的同時，選父本植株上次日可以開花的花蕾，用線或回形針或麥管隔離，注意用線扎花冠頂端時不要太松，以免次日花冠上張開的小孔讓昆蟲進入，使父本花粉混雜；也不要過緊，以免扎破花冠和扎住柱頭。三、植物人工雜交技術（三）棉花雜交技術4）授粉。在去雄后第2～3天內授粉，棉花絕大部分花在天氣晴朗的上午8時左右開放。當露水退后，即可在父本行中采集花粉或摘花，給母本的花授粉。采集花粉，可用毛筆蘸取花粉涂抹在不育花的柱頭上。如果摘下父本的花，可直接在母本的柱頭上涂抹。5）掛牌。授粉后在塑料牌上寫明組合名稱或代號、授粉日期和操作者姓名，掛在鈴柄上。6）檢查受精情況。授粉3～4天后，若子房膨大，柱頭失去光澤說明雜交成功。7）管理收獲和保存。對雜交株要注意摘老葉、整枝、摘去亮度心和果枝上多余的花蕾，改善通風透光條件，注意防治病蟲，以提高結鈴率和雜交種子數。吐絮后及時將雜交鈴連同塑料牌一起收摘，放入種子袋中，曬干后可按組合剝出棉籽，妥善保存，以供下季種植。三、植物人工雜交技術（三）棉花雜交技術三、植物人工雜交技術（四）玉米雜交技術1）調節開花期。由于玉米是單性花，在調節開花期方面，必須使母本的雌穗和父本的雄穗的花期一致。可用分期播種的方法調節父、母本的花期。2）選株。父、母本均應選擇生長健壯、無病蟲害和具有本品種典型性狀的植株，作為雜交對象。3）套袋隔離。當母本植株的雌穗已經露出而沒有伸出柱頭以前，用牛皮紙袋套好雌穗。當母本雌穗開始抽出柱頭時，要在當天用牛皮紙袋套在父本植株的雄穗上。雌、雄穗的紙袋，要用細繩或回形針扎緊，以免脫落。4）采粉。根據玉米的開花習性，其雄穗在始花后的第2～4天內開花最多，進入盛花期；一天中開花最多的時間是上午8～10時，而此時花粉的生活力也最強。雌穗在始花后的第2～4天處于盛花期，柱頭已基本抽齊。采集花粉時，將父本雄穗稍稍下彎，輕輕抖動，用人工輔助授粉器（用光滑的厚紙制成1個圓錐形的紙筒，用厚紙作紙蓋蓋住下口。三、植物人工雜交技術（四）玉米雜交技術5）授粉。授粉時，先取下雌穗上的紙袋，立即用人工輔助授粉器的下口對準雌穗的柱頭，輕輕抖動授粉器，使花粉落在柱頭上。授粉后，仍用原來的紙袋將雌穗套好，但應在袋頂和穗頂之間留出一定距離，以防止因果穗伸長而頂破紙袋。6）掛牌。紙袋套好后，應在雌穗基部拴上紙牌（或塑料牌），寫明雜交組合、授粉日期和操作者姓名等內容。7）收獲。母本果穗成熟后，應連同紙牌（或塑料牌）一起收獲，并單獨保存，供來年播種以檢驗雜交是否成功。三、植物人工雜交技術（一）果蠅雜交技術1）果蠅培養（1）培養基制備：酵母菌是果蠅幼蟲和成蟲的主要食物，凡是能發酵的物質都可成為果蠅的培養基。早年果蠅研究者用香蕉搗成泥糊做成培養基，現在實驗室多用玉米粉瓊脂培養基培養果蠅。果蠅培養基的配制方法很多，以配制1000mL為例說明配制的過程。培養基成分如下：四、動物人工雜交技術（一）果蠅雜交技術1）果蠅培養（2）果蠅培養：溫度對果蠅的生長發育影響很大。20～25℃是果蠅的最適生長溫度；30℃以上高溫能致果蠅死亡；在20℃以下時可使果蠅的生活周期延長；低于10℃時則影響果蠅的生活力和繁殖力。可以利用這一特點來調節果蠅生長的速度，控制其群體的大小。如原種的培養旨在保種，可先將果蠅在22℃條件下培養一周，當幼蟲出來后可將溫度調至18℃左右培養；雜交實驗時需要較大的群體，可將培養溫度設為23℃左右。雜交時還可根據實驗的時間安排隨時調整果蠅的培養溫度。2）果蠅處理技術（1）雌雄鑒別：利用果蠅做雜交實驗時，必須準確地識別性別。雌雄成蠅的區別表現在多個方面，可用放大鏡、顯微鏡（低倍）、解剖鏡或直接從外形上加以辨認。四、動物人工雜交技術（一）果蠅雜交技術2）果蠅處理技術雌雄果蠅的主要區別如下：四、動物人工雜交技術（一）果蠅雜交技術2）果蠅處理技術（2）果蠅的麻醉及觀察：無論是進行果蠅性狀觀察還是進行果蠅雜交實驗分析，都必須先將果蠅麻醉使其處于靜止狀態后方可進行。首先，在一軟木塞上釘一圖釘，在圖釘上纏上脫脂棉，將此軟木塞蓋在一250mL的廣口瓶上，做成麻醉瓶。將一培養皿的底部粘一條濾紙，做成麻醉用的麻醉皿。其次，麻醉時，準備好培養瓶、麻醉瓶和乙醚。輕拍瓶壁，讓果蠅震落到培養基上。如瓶塞上附著果蠅，則稍稍晃動瓶塞，并將它們拍落到培養基上。拔去麻醉瓶塞與培養瓶塞，迅速將培養瓶口倒扣在麻醉瓶口上。輕拍培養瓶讓果蠅落入麻醉瓶中（如果培養瓶中的培養基已很稀松，則切勿倒扣，應將麻醉瓶扣在培養瓶上，果蠅具有趨光性和向上性，會主動向上向有光的方向爬）。最后，把麻醉瓶中的果蠅拍落瓶底，拔出瓶塞，在塞子上滴幾滴乙醚，重新塞上麻醉瓶。麻醉約1min后果蠅便不再活動，紛紛落入瓶底，此時果蠅的翅膀呈收緊狀態。長時間麻醉、乙醚用量過多時會使果蠅死亡。四、動物人工雜交技術（一）果蠅雜交技術3）雜交操作（1）選處女蠅：將培養瓶內的成蠅全部除去，12h內培養瓶中將重新孵化出許多果蠅。將新孵化出來的果蠅引入麻醉瓶麻醉，根據雌雄果蠅的特征將12h內重新孵化出的雌雄果蠅分開，即可得到處女蠅。（2）雜交：將選出的突變型處女蠅轉入雜交瓶中（內有新配制的培養基）。同時麻醉選取野生型雄蠅8～10只，放入同一個雜交瓶中。在雜交瓶上貼上標簽，注明雜交組合、雜交日期和操作者姓名等。在25℃條件下或室溫下進行培養。（3）培養：25℃條件下或室溫下培養7～8天后，除去親本蠅。（4）觀察F1代：11～13天后，F1代羽化為成蠅。（5）觀察F2代：從觀察統計的F1代成蠅中，各選雌雄果蠅8～10只，轉入自交瓶中，在自交瓶上貼上標簽，注明自交日期、操作者姓名等。在25℃條件下或室溫下進行培養。12天后，F2代羽化為成蠅，將其麻醉后于白瓷磚上用放大鏡觀察，或用解剖鏡、顯微鏡觀察各種表現型的果蠅。四、動物人工雜交技術（二）小鼠雜交技術1）小鼠操作方法（1）性別鑒別：成年鼠性別很容易區分，雄鼠的陰囊明顯；雌鼠可見陰道開口和五對乳頭。幼鼠或仔鼠則主要從外生殖器與肛門的距離判定，近者為雌，遠者為雄。另外，雌鼠肛門和生殖器之間有一無毛小溝，而雄鼠則在肛門和生殖器之間長毛。再者，雌鼠比雄鼠明顯多很多的乳頭。（2）小鼠固定操作技術：絕大多數品系的小鼠經過長期的馴養和人為的挑選，性格都是很溫馴的，除了受到攻擊以外都不會咬人。小鼠實驗過程中，操作要平穩快速，如果在操作中發現小鼠變得焦躁不安，應停止對小鼠的動作，等其平靜下來后再重新開始操作。

抓頸部的動作好壞是固定小鼠的關鍵，要將小鼠固定好須用手抓住小鼠頸部背后的所有疏松的皮。四、動物人工雜交技術（二）小鼠雜交技術2）雜交繁育技術不同品系、不同種群有不同的繁殖方法，適宜的繁殖方法是保證小鼠質量的前提。（1）種鼠：種鼠可由外單位引入，也可由本單位自己保種。引種的小鼠必須遺傳背景明確，來源清楚，有完整的資料，包括種群名稱、來源、遺傳基因特點及主要生物學特性等。進入生產的種鼠要經過挑選，也就是選種。選種在小鼠離乳時進行初選，種鼠應符合該品系的遺傳學特征，無變異。雙親體質健康無疾病，活力強。初選時按健康標準一般選留2～5胎的仔鼠，適當延長哺乳期到23天，然后雌雄分開，同時做好記錄。（2）雜交繁育方法：將種鼠按事先定的配種方案置于繁殖盒中，建立雜交繁育卡。雜交配種方案因小鼠的種類品系不同而不同。廣義的雜交繁育（如大群生產）有兩種方法：長期同居法、定期同居法。四、動物人工雜交技術（二）小鼠雜交技術3）不同類型鼠群的繁育（1）近交系的維持和生產：繁殖用原種小鼠必須遺傳背景明確，來源清楚，有完整的譜系資料，包括品系名稱、近交代數、遺傳基因特點及主要生物學特征等。引種小鼠應來自近交系的基礎群，以2～5對同窩個體為宜。小鼠近交系一旦育成，應按保種的有關規定，維持其特定的生物學特征的穩定，保持其基因同一性和基因純合性。近交系小鼠的維持和生產包括4個群。生產過程一般是從基礎群移出種鼠，經擴大群擴增后，建立生產群，由生產群繁殖仔鼠進入供應群。（2）封閉群小鼠的維持和生產①維持。小鼠保種時應盡可能多的保留繁殖個體。②生產。常用的方法有一雄多雌同居交配法和雌雄1：1同居交配法。四、動物人工雜交技術（一）大腸桿菌雜交技術1）培養基制備LB培養基是一種應用最廣泛和最普通的細菌基礎培養基，其成分為：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl10g/L。若制備固體培養基，只需再加入瓊脂粉15g/L，調節pH至7.4～7.6，配好后高壓滅菌即可。2）雜交操作（1）親本選擇：親本選擇供體菌、受體菌。（2）菌種活化：分別接一環供體菌和受體菌于5mLLB培養液中，37℃振蕩培養10～12h。（3）擴大培養：擴大培養需各取1mL過夜培養物，分別加入兩個盛有5mLLB培養液的250mL三角瓶內，37℃振蕩培養2～3h。五、微生物人工雜交技術（一）大腸桿菌雜交技術2）雜交操作（4）混合培養-雜交：混合培養-雜交需吸取0.5mL供體菌和4.5mL受體菌，加入一個無菌的250mL三角瓶中混合，置37℃搖床上培養100min。（5）觀察統計：將上述接合菌液用生理鹽水稀釋10、100倍。各吸取0.1mL稀釋液涂布在選擇培養基平板上，每一種稀釋液涂布兩個平板。同時將供體菌及受體菌分別吸取0.1mL涂布在選擇培養基上作為對照，每種菌各兩個平板，均于37℃條件下培養48h。最后，觀察統計菌落數目。

五、微生物人工雜交技術（二）放線菌雜交技術1）混合培養法（1）選擇性平板法：選擇性平板法所使用的兩親株必須是互補的營養缺陷型。將用來進行重組的兩親株混合，接種到豐富的完全培養基斜面上；孢子形成后制成單孢子懸浮液。然后在選擇培養基平板上進行分離，長出的菌落即為各種類型的重組體。（2）異核系分析法：將混合培養后所制得的單孢子懸浮液，分離在基本培養基平板上，其中長成的小而豐富的菌落即為異核系。然后將異核系再分離在完全培養基上，長出的菌落即為分離子。2）平板雜交法平板雜交法是先將菌落培養在非選擇培養基上，當菌落形成孢子后，用影印培養法將菌落印至已鋪有試驗菌孢子的完全培養基平板上，再培養至孢子形成。然后把上面的孢子影印到一系列選擇培養基上，以便于各種重組體子代的生長。

五、微生物人工雜交技術（二）放線菌雜交技術3）玻璃紙轉移法使用玻璃紙轉移法必須具備兩個條件：①直接親本必須帶有兩個遺傳標記，即一個直接親本帶有一種營養要求和抗藥性（如抗鏈霉素），而另一個直接親本則為對該藥物敏感（如對鏈霉素敏感）和帶有另一種營養缺陷型；②選擇培養基是帶有抗性藥物的補充培養基。玻璃紙轉移法是在選擇培養基上挑選異核系菌落，其原理是：異核體帶有鏈霉素敏感的等位基因，在含有鏈霉素的選擇培養基上不能生長。敏感性親本和抗藥性親本因為營養要求得不到滿足也不能在該選擇培養基上生長，而不帶鏈霉素敏感等位基因的兩直接親本的局部結合則能在該選擇培養基上生長、繁殖成為異核系菌叢。五、微生物人工雜交技術（三）真菌雜交技術1）選擇直接親本直接親本的遺傳標記多種多樣，如營養突變型、抗藥性突變型、形態突變型等。2）異核體的形成在基本培養基上，強迫兩株營養缺陷型互補營養，則這兩個菌株經過菌絲細胞間的吻合形成異核體。直接親本形成異核體的方法有：完全培養基液體混合培養法、完全培養基斜面混合培養法、液體有限培養基混合培養法、有限培養基平板異核叢形成法、基本培養基斜面銜接接種法、基本培養基平板穿刺法等。五、微生物人工雜交技術（三）真菌雜交技術3）雙倍體的檢出（1）用放大鏡觀察異核體菌落的表面，如果發現有野生型顏色的斑點和扇面，即可用接種針將其孢子挑出，進行分離純化，即得雜合雙倍體。（2）將異核體菌絲打碎，在基本培養基和完全培養基平板上進行分離，經培養挑出異核體菌落。個別異核體菌落上長出野生型原養性的斑點和扇面，將其挑出進行分離純化即可。（3）將大量異核體孢子分離于基本培養基平板上，從中長出野生型原養性菌落，將其挑出分離純化，即得雜合雙倍體。前兩種方法只能從每個異核體菌落上挑取一個斑點或扇面，以排除無性繁殖的干擾。五、微生物人工雜交技術（三）真菌雜交技術4）分離子的檢出（1）將雜合雙倍體單孢子分離于完全培養基平板上，培養至菌落成熟，從每個菌落挑出一個斑點或扇面的孢子于完全培養基斜面上，培養后經過純化和鑒別即得分離子。（2）用選擇培養基篩選分離子。五、微生物人工雜交技術（四）酵母菌雜交技術1）培養基制備（1）完全液體培養基：蛋白胨2g、酵母浸母汁1g、葡萄糖2g、水100mL（pH為6.0）、58.8kPa高壓蒸氣滅菌30min。（2）完全固體培養基：在完全液體培養基中加入2%瓊脂。（3）基本液體培養基：葡萄糖10g、(NH4)2SO41g、K2HPO40.125g、KH2PO40.875g、KI母液（10mgKI溶于100mL水中配成）1mL、MgSO4·7H2O0.5g、CaCl2·2H2O0.lg、NaCl0.1g、微量元素母液（H3PO41mg、ZnSO4·7H2O7mg、CuSO4·5H2O1mg、CoCl2·6H2O5mg、水100mL，配成溶液）1mL、維生素母液（煙堿酸40mg、維生素B140mg、肌醇200mg、核黃素20mg、對氨基苯甲酸20mg、吡哆醇40mg、泛酸40mg、生物素0.2mg、水100mL，配成溶液）1mL、水1000mL，pH為5.3，58.8kPa高壓蒸氣滅菌30min。五、微生物人工雜交技術（四）酵母菌雜交技術（4）基本固體培養基：在基本液體培養基中加入2%瓊脂。（5）產孢子培養基：乙酸鈉8.2g、KCl1.86g、吡哆酵母液（20mg吡哆醇、100mL水）1mL、泛酸母液（20mg泛酸、100mL水）1mL、生物素母液（2mg生物素、100mL水）1mL、瓊脂20g、蒸餾水1000mL。（6）補充培養基：①基本固體培養基100mL+組氨酸3.5mg；②基本固體培養基100mL+腺嘌呤3mg。五、微生