DB23/TXXXX—XXXX

玉米抗絲黑穗病多標記分子輔助育種技術規程

1范圍

本文件規定了玉米抗絲黑穗病多標記分子輔助育種的術語和定義、儀器、育種材料及育種程序。

本文件適用于玉米(ZeamaysL.）抗絲黑穗病分子標記輔助育種。

2規范性引用文件

下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文

件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適

用于本文件。

NYT1248.3-2006玉米抗病蟲性鑒定技術規范第3部分：玉米抗絲黑穗病鑒定技術規范

NY-T1432-2014玉米品種鑒定技術規程SSR標記法

3術語和定義

下列術語和定義適用于本文件。

3.1

玉米絲黑穗病maizeheadsmut

由絲軸黑粉菌（Sphacelothecareiliana(Kühn)Clint.）侵染所引起的玉米真菌性病害，在7葉期之前

穿透玉米胚芽鞘、中胚軸或根部的表皮細胞完成侵染，初期顯癥不明顯，在開花期破壞雌穗和雄穗的

正常結構，形成黑粉孢子堆積造成絕產。

3.2

標記輔助選擇

利用與目標性狀緊密連鎖的分子標記對目標性狀進行選擇的育種技術。

3.3

多標記組合

利用與育種目標性狀緊密連鎖的2個及以上的分子標記組合。

3.4

前景選擇標記

用于檢測目標性狀的分子標記。

3.5

背景選擇標記

1

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用于檢測試驗材料遺傳背景的分子標記。

4儀器

4.1DNA提取儀器

研缽、核酸提取磨樣機、水浴鍋、移液器、低溫高速離心機和通風櫥等。

4.2PCR檢測儀器

PCR儀、移液器、電泳儀、電泳槽和凝膠成像系統。

5育種材料

5.1感病受體親本

選取農藝性狀優良但感或高感絲黑穗病的玉米自交系，且不具有bin2.09主效抗病位點/基因和

bin8.03次主效抗病位點的玉米自交系，作為感病受體親本（P1）。

5.2抗病供體親本

選取在田間表現為高抗絲黑穗病，且具有bin2.09主效抗病位點/基因和bin8.03次主效抗病位點的玉

米自交系，作為抗病供體親本（P2）。

6育種程序

6.1雜交

以P1為母本，以P2為父本，人工授粉雜交，獲得F1代雜交種子。

6.2回交

以F1為母本，以P1為父本，人工授粉雜交，獲得BC1F1世代雜交種子。

6.3BC1F1基因分型

6.3.1采樣

BC1F1世代雜交種子樣品可以是種子的胚乳、幼苗的葉片等可用于DNA提取的玉米植物組織。樣

品采集后立刻用于DNA提取或冷凍保存。采樣時應記錄每個體樣品名稱、樣品編號、采樣地點和時間

等。

6.3.2DNA提取與純化

將每個體樣品研磨粉末200mg~300mg轉入2mL離心管，加入0.5mL2×CTAB提取緩沖液充分

混勻，在55℃～65℃恒浴30min。加入1mL氯仿:異戊醇（24：1），充分搖動5min，8000g，室

溫下離心5min。取上清液加入2.5×體積預冷無水乙醇，﹣20℃冰箱放置2h以上，15000g離心20

min。用70%的預冷乙醇洗一次，自然干燥后，用200μL0.1×TE緩沖液溶解，置4℃保存。也可采

用其他能夠達到PCR擴增質量要求的DNA提取方法。

2

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6.3.3前景選擇

6.3.3.1標記信息

使用的分子標記為玉米抗絲黑穗病bin2.09主效和bin8.03次主效QTL所在位點的連鎖標記或抗病基

因的功能標記，詳細信息見附錄1。

6.3.3.2PCR擴增

采用20μL的反應體系中進行擴增。單標記反應體系包含每種dNTP(2.5mM/mL)2ul，10×Taq

Buffer2ul，25mMMgcl21ul，Primer-F(20u)0.5ul，Primer-R(20u)0.5ul，Taq(5U/uL)1ul，

DNA(20ng/μL~50ng/μL)2ul，ddH2O11ul。擴增反應條件為：PCR程序為95℃預變性5min，1個循

環；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸10s，共34個循環；72℃延伸10min，4℃保存。單標記PCR

產物分別進行酶切，反應體系包括10×NEBuffer1ul，限制性內切酶0.4ul，PCR產物2.5ul，ddH2O

6.1ul，37℃孵育3h左右。

6.3.3.3酶切產物檢測

對酶切產物采用瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠電泳，如個體攜帶抗病位點或基因，LSdCAP2、

LSdCAP3、LSdCAP8和DNdCAPS8.031標記酶切產物大小分別為93bp，136bp，132bp和137bp，可選取

同時攜帶4個抗病位點或基因的個體。

6.3.4背景選擇

對入選個體進行遺傳背景分析，使用的分子標記為簡單重復序列（SampleSequenceRepeat，

SSR）標記進行遺傳背景，詳細信息見NY-T1432-2014《玉米品種鑒定技術規程SSR標記法》中的附

錄C。篩選遺傳背景與P1基因型相似度最高的個體。

6.4BC1F1回交

以從6.3中獲得的BC1F1為母本，以P1為父本，人工授粉雜交，獲得BC2F1雜交種子。

6.5BC2F1基因分型

按照6.3的基因分型方法執行，篩選同時含有4個抗病位點或基因、遺傳背景與P1基因型相似度最

高的個體。

6.6BC2F1回交

以從6.5中獲得的BC2F1為母本，以P1為父本，人工授粉雜交，獲得BC3F1雜交種子。

6.7BC3F1基因分型

按照6.4的基因分型方法執行，篩選同時含有4個抗病位點或基因、遺傳背景與P1基因型相似度最

高的個體。

6.8BC3F1回交

從6.7中獲得的BC3F1自交，混收，獲得BC3F2種子。

6.9BC3F2基因分型

3

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按照6.3的基因分型方法執行，篩選同時含有4個純合抗病位點或基因、遺傳背景與P1基因型相似

度最高的個體。將BC3F2單株種植于田間，選取農藝性狀與P1接近的單株。

6.10選系

將6.9中獲得的單株進行自交至BC3F4代，從中選擇農藝性狀與P1相似的材料進行系選，絲黑穗病

抗性鑒定按照NYT1248.3-2006的規定執行，通過小區品比試驗，選出優良抗病自交系。

4

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附錄1dCAPS分子標記信息

標記信息

序QTL所在的QTL表型貢

標記名稱標記類型SNP

號染色體位置獻率（%）引物退火溫度內切酶酶切位點預期產物大小

位置突變位點

上游TACATTGATATTTGCCACACGAAT5’CTGCAG3’

1LSdCAP2連鎖標記2.093655PstI93/73,2069T/C

下游CAAATCAACGAGTGATTTACTGCA3’GACGTC5’

上游GGCTGCGCCGTGAGATACT5’ACTGGN3’

2LSdCAP3連鎖標記2.093655BsrI136/22,11420T/G

下游GCTCTCGATCTGTCCTTGTCACCA3’TGACCN5’

上游CGACAACGCCCGCCATCGCCG5’CCGC3’

3LSdCAP8功能標記2.093660AciI132/19,11322C/G

下游TTGAGGTTGCCGAGGTCAGT3’GGCG5’

上游AGCTCAACGCAATTCATTGTGC5’GWGCWC3’

4DNdCAPS8.03-1功能標記8.031065BsiHKAI137/114,2397C/T

下游CGCTCACTGCCAAGTTTTGC3’CWCGWG3’

1

ICS65.020.20

CCSB05

DB23

黑龍江省地方標準

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玉米抗絲黑穗病多標記分子輔助育種技術

規程（征求意見稿）

XXXX-XX-XX發布XXXX-XX-XX實施

黑龍江省市場監督管理局發布

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玉米抗絲黑穗病多標記分子輔助育種技術規程

1范圍

本文件規定了玉米抗絲黑穗病多標記分子輔助育種的術語和定義、儀器、育種材料及育種程序。

本文件適用于玉米(ZeamaysL.）抗絲黑穗病分子標記輔助育種。

2規范性引用文件

下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文

件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適

用于本文件。

NYT1248.3-2006玉米抗病蟲性鑒定技術規范第3部分：玉米抗絲黑穗病鑒定技術規范

NY-T1432-2014玉米品種鑒定技術規程SSR標記法

3術語和定義

下列術語和定義適用于本文件。

3.1

玉米絲黑穗病maizeheadsmut

由絲軸黑粉菌（Sphacelothecareiliana(Kühn)Clint.）侵染所引起的玉米真菌性病害，在7葉期之前

穿透玉米胚芽鞘、中胚軸或根部的表皮細胞完成侵染，初期顯癥不明顯，在開花期破壞雌穗和雄穗的

正常結構，形成黑粉孢子堆積造成絕產。

3.2

標記輔助選擇

利用與目標性狀緊密連鎖的分子標記對目標性狀進行選擇的育種技術。

3.3

多標記組合

利用與育種目標性狀緊密連鎖的2個及以上的分子標記組合。

3.4

前景選擇標記

用于檢測目標性狀的分子標記。

3.5

背景選擇標記

1

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用于檢測試