ICS65.020

B16

DB41

河南省地方標準

DB41/T987—2014

脫毒甘薯種薯（苗）病毒檢測技術規程

Technicalcriterionforvirusdetectionofvirus-freesweetpotatoseedtuberor

seedling

2014-12-30發布2015-03-01實施

河南省質量技術監督局發布

DB41/T987－2014

目次

前言................................................................................II

1范圍..............................................................................1

2術語和定義........................................................................1

2.1脫毒組培苗....................................................................1

2.2擴繁苗........................................................................1

2.3脫毒種薯（苗）................................................................1

2.4原原種........................................................................1

2.5原種..........................................................................1

2.6大田用種......................................................................1

2.7允許帶毒率....................................................................2

2.8允許病毒顯癥率................................................................2

3檢測對象..........................................................................2

4抽樣..............................................................................2

4.1組培苗抽樣....................................................................2

4.2田間抽樣......................................................................2

5檢測方法..........................................................................2

5.1硝酸纖維素膜酶聯免疫吸附測定（NCM-ELISA）檢測法...............................2

5.2指示植物檢測法................................................................3

5.3聚合酶鏈式反應（PCR）檢測法...................................................3

5.4反轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）檢測法..........................................3

6脫毒種薯（苗）的檢測程序及質量要求................................................3

6.1脫毒組培苗....................................................................3

6.2原原種........................................................................3

6.3原種..........................................................................3

6.4大田用種......................................................................3

附錄A（規范性附錄）硝酸纖維素膜酶聯免疫吸附測定（NCM-ELISA）檢測法.................4

附錄B（規范性附錄）指示植物檢測法..................................................6

附錄C（規范性附錄）聚合酶鏈式反應（PCR）檢測法.....................................7

附錄D（規范性附錄）反轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）檢測法............................9

I

DB41/T987－2014

前言

本標準按照GB/T1.1-2009給出的規則起草。

本標準由河南省農業科學院提出。

本標準起草單位：河南省農業科學院植物保護研究所。

本標準主要起草人：張振臣、喬奇、秦艷紅、張德勝、王爽、田雨婷、王永江。

II

DB41/T987－2014

脫毒甘薯種薯（苗）病毒檢測技術規程

1范圍

本標準規定了脫毒甘薯種薯（苗）病毒檢測的術語定義、檢測對象、抽樣、檢測方法和脫毒種薯（苗）

的檢測程序及質量要求。

本標準適用于脫毒甘薯種薯（苗）的病毒檢測。

2術語和定義

下列術語和定義適用于本文件。

2.1

脫毒組培苗virus-freetissuecultureseedling

利用莖尖分生組織培養技術獲得的再生組培苗，經檢測，確認不含甘薯羽狀斑駁病毒（Sweetpotato

featherymottlevirus，SPFMV）、甘薯潛隱病毒（Sweetpotatolatentvirus，SPLV）、甘薯G病毒

（SweetpotatovirusG，SPVG）、甘薯病毒2（Sweetpotatovirus2，SPV2）、甘薯褪綠斑病毒（Sweet

potatochloroticfleckvirus，SPCFV）、甘薯褪綠矮化病毒（Sweetpotatochloroticstuntvirus，

SPCSV）和甘薯卷葉病毒（Sweetpotatoleafcurlvirus，SPLCV）的種苗。

2.2

擴繁苗propagationseedling

由脫毒組培苗在無菌條件下或者防蟲溫（網）室內快繁后得到的甘薯苗。

2.3

脫毒種薯（苗）virus-freeseedtuberorseedling

由脫毒組培苗經逐代繁殖增加種薯（苗）數量的種薯（苗）生產體系生產出來的種薯（苗）。分原

原種、原種、大田用種三個級別。

2.4

原原種pre-elite

用脫毒組培苗或擴繁苗在防蟲網室內生產出的符合質量要求的種薯（苗）。

2.5

原種elite

用原原種作種薯，在隔離條件下生產出的符合質量要求的種薯（苗）。

2.6

大田用種certifiedseed

用原種作種薯，在隔離條件下生產出的符合質量要求的種薯（苗）。

2.7

允許帶毒率permissionvirus-carryingrate

各級甘薯種薯（苗）繁殖田中允許攜帶病毒植株的比率。

2.8

允許病毒顯癥率permissionvirus-symptomrate

1

DB41/T987－2014

各級甘薯種薯（苗）繁殖田中允許出現病毒病癥狀植株的比率。

3檢測對象

甘薯羽狀斑駁病毒（SPFMV）；

甘薯潛隱病毒（SPLV）；

甘薯G病毒（SPVG）；

甘薯病毒2（SPV2）；

甘薯褪綠斑病毒（SPCFV）；

甘薯褪綠矮化病毒（SPCSV）；

甘薯卷葉病毒（SPLCV）。

4抽樣

4.1組培苗抽樣

4.1.1脫毒組培苗

每株均應檢測。

4.1.2擴繁苗

隨機抽取1%～2%的擴繁苗檢測。

4.2田間抽樣

4.2.1原原種田抽樣

定植后30d、60d、收獲前2周，在目測的基礎上，采用五點取樣法。面積≤0.1hm2，抽取數量為

200株；0.1hm2＜面積≤1hm2，抽取數量為500株；每超出1hm2面積，劃出另一檢驗區，按本規程規定

的面積取樣。每株取上、中、下部葉片1g～5g，-20℃以下低溫保存。

4.2.2原種田和大田用種田抽樣

定植后30d、收獲前兩周，在目測的基礎上，采用五點取樣法。取樣方法及樣品保存同4.2.1。

5檢測方法

5.1硝酸纖維素膜酶聯免疫吸附測定（NCM-ELISA）檢測法

用于檢測SPFMV、SPLV、SPVG、SPV2、SPCFV、SPCSV和SPLCV共7種病毒，檢測法見附錄A。

5.2指示植物檢測法

用于輔助檢測SPFMV、SPLV、SPVG、SPV2、SPCFV、SPCSV和SPLCV共7種病毒，檢測法見附錄B。

5.3聚合酶鏈式反應（PCR）檢測法

用于檢測SPLCV。檢測法見附錄C。

2

DB41/T987－2014

5.4反轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）檢測法

用于檢測SPCSV。檢測法見附錄D。

6脫毒種薯（苗）的檢測程序及質量要求

6.1脫毒組培苗

樣品同時利用NCM-ELISA、PCR、RT-PCR和指示植物4種方法進行檢測，4種方法的檢測結果均應為陰

性，即允許帶毒率為0。

6.2原原種

先目測調查樣品的病毒顯癥率，然后利用NCM-ELISA或指示植物法進行檢測，至少其中10%的樣品分

別利用PCR和RT-PCR檢測。允許帶毒率為0，允許病毒顯癥率為0。

6.3原種

先目測調查樣品的病毒顯癥率，然后利用NCM-ELISA或指示植物進行檢測，至少其中5%的樣品分別

利用PCR和RT-PCR檢測。SPFMV、SPLV、SPVG、SPV2和SPCFV的允許帶毒率≤2.0%，SPCSV和SPLCV的允許

帶毒率為0。允許病毒顯癥率≤1.0%。

6.4大田用種

先目測調查樣品的病毒顯癥率，然后利用NCM-ELISA或指示植物進行檢測，至少其中1%的樣品分別

利用PCR和RT-PCR檢測。SPFMV、SPLV、SPVG、SPV2和SPCFV的允許帶毒率≤10.0%，SPCSV和SPLCV的允許

帶毒率為0，允許病毒顯癥率≤5.0%。

3

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AA

附錄A

（規范性附錄）

硝酸纖維素膜酶聯免疫吸附測定（NCM-ELISA）檢測法

A.1溶液配制

除非另有規定僅使用分析試劑。水為無菌蒸餾水。

A.1.1Tris-HCl溶液[c(Tris-HCl)=1.0mol/L]：稱取60.60g的三羥甲基氨基甲烷（Tris）溶于

300mL無菌蒸餾水中，加入32.5mL濃鹽酸（HCl），調節pH值為7.5，定容至500mL。4℃保存備用。

A.1.2氯化鈉溶液[c(NaCl)=5.0mol/L]：稱取292.20g氯化鈉，在800mL無菌蒸餾水中，溶解定容至

1L。4℃保存備用。

A.1.3三羥甲基氨基甲烷溶液（TBS）：分別取1mol/LTris-HCl（A.1.1）20mL和5mol/L氯化鈉

（A.1.2）100mL，混合后用無菌蒸餾水定容至1L。

A.1.4洗滌緩沖液（TBST）：0.5mL吐溫-20（Tween-20）溶于1LTBS（A.1.3）中。

A.1.5抽提緩沖液：稱取亞硫酸鈉（Na2SO3）0.20g溶于TBS（A.1.3）中，定容至100mL。

A.1.6封閉緩沖液：稱取脫脂奶粉0.50g，分別量取曲拉通（Triton）X-1000.5mL和TBS（A.1.3）

25mL。先將脫脂奶粉溶于少量TBS（A.1.3）中，再用TBS（A.1.3）定容至25mL，加入TritonX-100

混合均勻，現配現用。

A.1.7抗體緩沖液：稱取脫脂奶粉1.00g，量取TBS（A.1.3）50mL。先將脫脂奶粉溶解于少量TBS

（A.1.3）中，再用TBS（A.1.3）定容至50mL。

A.1.8底物緩沖液：分別稱取三羥甲基氨基甲烷6.10g、氯化鈉2.90g、氯化鎂（MgCl2?6H2O）

0.50g，溶于400mL蒸餾水中，用濃鹽酸調pH值至9.5，定容至500mL。

A.1.9氯化硝基四氮唑藍（NBT）儲備液：稱取0.04gNBT溶于1.2mL70%N，N-二甲基甲酰胺（DMF）

中，-20℃避光保存備用。

A.1.105-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽（BCIP）儲備液：稱取0.02gBCIP溶于1.2mLN，N-二甲基甲酰

胺（DMF）中，-20℃避光保存備用。

A.1.11NBT/BCIP底物溶液：先后取100μLNBT貯備液（A.1.9）和100μLBCIP貯備液（A.1.10），加

入25mL底物緩沖液中，振搖混勻,現配現用。

A.2樣品制備

將待測葉片用清水清洗干凈，從每一樣品上中下部的葉片上各取一直徑約1cm圓片。放入研缽中，

加入3mL抽提緩沖液充分研磨，6000r/min離心2min，取上清液點膜。

A.3操作步驟

A.3.1點膜

將劃好方格（1cm×1cm）的硝化纖維素膜用TBS緩沖液處理后放在潔凈的濾紙上，每個樣品各吸

取15μL上清液滴在膜上方格的正中，室溫干燥15min～30min。同時設陽性、陰性和空白對照。根據

需要設置重復。

4

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A.3.2封閉

將干燥后的膜浸入封閉緩沖液中，室溫下搖床振蕩1h，轉速為50r/min。

A.3.3與一抗反應

將膜置于用抗體緩沖液稀釋至工作濃度的病毒特異性抗體溶液中，室溫下搖床振蕩10h～12h，轉

速為50r/min。

A.3.4洗膜

用洗滌緩沖液洗膜4次，每次搖床振蕩3min，轉速為80r/min。

A.3.5與二抗反應

用濾紙將膜表面的溶液吸干，將膜放入用抗體緩沖液稀釋至工作濃度的堿性磷酸酶標記的抗體溶液

中，室溫下搖床振蕩1h，轉速為50r/min。

A.3.6洗膜

洗滌4次，方法同A.3.4。

A.3.7顯色

用濾紙將膜表面的溶液吸干，將膜置于NBT/BCIP底物溶液中，避光緩慢搖動。

A.3.8終止反應

棄去底物溶液并用蒸餾水洗膜3次，每次搖床振蕩10min，轉速為50r/min。

A.3.9結果判斷

晾干后觀察顏色反應，陽性樣品在膜上形成紫色沉淀，陰性樣品則無顏色反應。

5

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BB

附錄B

（規范性附錄）

指示植物檢測法

B.1繁育指示植物

在防蟲條件下盆栽巴西牽牛（Ipomoeasetosa），至1～2片真葉時嫁接。

B.2嫁接

以待測樣品的莖蔓為接穗，巴西牽牛為砧木，在巴西牽牛的莖部（子葉處）斜切，將待檢樣品底端

削成楔型，插入砧木的切口內，用封口膜扎緊，置25℃～30℃防蟲網室內，嫁接15d～30d后觀察記

載癥狀。每個樣品重復至少3次（3株），同時設陽性和陰性對照。

B.3結果判斷

根據巴西牽牛是否表現花葉、葉片扭曲、明脈、黃化以及植株矮化等癥狀，確定是否帶毒。所有嫁

接的巴西牽牛植株均沒有表現任何病毒病癥狀，樣品為陰性；只要有1株表現病毒病癥狀，該樣品判斷

為陽性。

6

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CC

附錄C

（規范性附錄）

聚合酶鏈式反應（PCR）檢測法

該方法用于檢測甘薯卷葉病毒（SPLCV）。

C.1試劑及緩沖液配制

先用按C.1.1～C.1.6配方配置50倍的濃貯存液，使用時再用無菌蒸餾水稀釋至工作濃度。

C.1.1TAE電泳緩沖液：稱取三羥基甲基氨基甲烷（Tris）242.0g、冰乙酸57.1mL、Na2EDTA?2H2O

37.2g，用氫氧化鈉調pH值至8.5，滅菌雙蒸水定容至1L。

C.1.2溴化乙錠（EB）溶液：稱取溴化乙錠20.00mg溶于20mL滅菌雙蒸水中。

C.1.31.0%瓊脂糖凝膠板：稱取1.00g瓊脂糖加入100mLTAE電泳緩沖液中，在微波爐中加熱至瓊脂

糖融化，溫度降至50℃～60℃時，加溴化乙錠溶液（EB）5μL，搖勻，倒入電泳槽中均勻鋪板，凝固

后取下梳子使用。

C.1.4CTAB緩沖液：稱取CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）20.00g、NaCl81.80g、EDTA5.80g和

Tris12.10g，溶于1L蒸餾水中，用HCl調pH值至8.0，高溫滅菌后加入PVP（聚乙烯吡咯烷酮K30）

10.00g。

C.1.5TE緩沖液：稱取EDTA0.30g和Tris1.20g，溶于1L蒸餾水中，用HCl調pH值至8.0，高溫滅菌。

C.1.6加樣緩沖液：稱取EDTA0.88g、溴酚藍0.05g，量取丙三醇36mL，溶于100mL蒸餾水中，

用氫氧化鈉調pH值至7.0。

C.2DNA提取-CTAB法

預熱（60℃）CTAB緩沖液(C.1.4)。取0.5g新鮮植物材料，于液氮中研磨成粉，把粉末倒入盛有

預熱的600μLCTAB緩沖液(C.1.4)的1.5ml的eppendorf管中，再加入20μL巰基乙醇，輕輕混勻；

60℃保溫1h，其間搖動幾次；加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇（25:24:1），輕輕混勻，室溫下4500r/min

離心10min；將上清液轉入另一離心管中，加入2/3體積的異丙醇，小心混勻后-20℃放置30min以上，

可見DNA絮狀沉淀；10000r/min離心10min，棄去上清液；沉淀加清洗緩沖液（70%乙醇，100mmol/L

醋酸銨）漂洗2～3次，10000r/min離心10min，沉淀風干后溶于50μLTE緩沖液(C.1.5)。開展后續

試驗或-20℃保存備用。

C.3PCR

C.3.1引物

上游引物BM-V：5ˊ-KSGGGTCGACGTCATCAATGACGTTRTAC-3ˊ，

下游引物BM-C：5ˊ-AARGAATTCATKGGGGCCCARARRGACTGGC-3ˊ。

C.3.2PCR擴增

PCR反應體系為：滅菌重蒸水36.7μL，dNTPs（2.5mmol/L）4μL，10×ExTaqBuffer(含MgCl2)

7

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5μL，上游引物BM-V（10μmol/L）和下游引物BM-C（10μmol/L）各1μL，ExTaqDNA聚合酶(5U/μL)

0.3μL，模板DNA2μL。PCR反應條件為：94℃3min，接著進行35個循環，條件為94℃1min、

55℃1min和72℃3min，最后72℃延伸10min。

C.3.3PCR產物的電泳檢測

制備1.0%瓊脂糖凝膠板（C.1.3）。在電泳槽中加入TAE電泳緩沖液(C.1.1)。每個樣品取10μLPCR

產物與加樣緩沖液混合后，加入凝膠孔進行電泳。恒壓（120V～150V）下電泳20min～30min，經EB

染色后，將凝膠放到凝膠成像系統上觀察結果。

C.3.4試驗成立的條件

PCR產物經電泳檢測，陽性對照在預期大小（2800bp）的位置出現特異性條帶，同時，陰性對照和

空白對照均沒有出現預期大小的目的條帶。

C.3.5結果判定

應用本標準的檢測方法對待檢樣品進行檢測，如果在2800bp對應位置出現特異性條帶，則判定樣

品為SPLCV病毒陽性，否則判定樣品為該病毒陰性。

8

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DD

附錄D

（規范性附錄）

反轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）檢測法

該方法用于檢測甘薯褪綠矮化病毒（SPCSV）。

D.1試劑及緩沖液配制

D.1.1DEPC水：取焦碳酸二乙酯（DEPC)50μL加至100mL滅菌蒸溜水中，室溫放置10h～12h，

121℃高溫滅菌15min，分裝到DEPC（D.1.1）處理過的離心管中。

D.1.2引物溶液：用DEPC水（D.1.1）將上、下游引物分別配制成濃度為10μmol/L的溶液。

D.1.3TAE電泳緩沖液、1.0%瓊脂糖凝膠板和溴化乙錠（EB）溶液：TAE電泳緩沖液、溴化乙錠（EB）

溶液和1.0%瓊脂糖凝膠板配制方法分別同附錄C.1.1、C.1.2和C.1.3。

D.2RNA提取-Trizol法

稱取0.1g葉片放于研缽中，加液氮充分研磨成粉，將粉末迅速轉入到無RNase的無菌1.5mL離心

管中，加入1mLTrizol迅速振蕩混勻；4℃12000r/min，離心5min；取上清液，加入200μL氯仿，

混勻，室溫放置15min；4℃，12000r/min，離心15min；吸取上層水相至新的無菌1.5mL離心管中，

加入0.5mL異丙醇，混勻，室溫放置10min；4℃，12000r/min，離心10min，棄上清液，留沉淀；

加入1mL75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀；4℃，12000r/min，離心5min，棄上清液，將離心

管倒置于滅菌濾紙上，自然干燥；加入25-200μLDEPC水（D.1.1）溶解沉淀，即得到總RNA。

D.3RT-PCR

D.3.1引物

上游引物CSV70P1：5ˊ-GACGGKGGTACKATGAARGTCC-3ˊ，

下游引物CSV70P2：5ˊ-GGCTCACAAACHGAYTTCATAAACAT-3ˊ。

D.3.2反轉錄

反轉錄反應體系為：dNTPs（10mmol/L）1μL，MgCl2（25mmol/L）1μL，5×AMV緩沖液2μL，

AMV（5U/μL）0.5μL，RNase抑制劑（40U/μL）0.25μL，模板核酸5μL，下游引物CSV70P2（10μmol/L）

0.5μL。反轉錄反應條件為：42℃50min，99℃5min。

D.3.3PCR擴增

PCR反應體系為：滅菌重蒸水33.7μL，dNTPs（2.5mmol/L）4μL，10×ExTaqBuffer(含MgCl2)

5μL，上游引物CSV70P1（10μmol/L）和下游引物CSV70P2（10μmol/L）各1μL，ExTaqDNA聚合酶

(5U/μL)0.3μL，cDNA5μL。PCR反應條件為：94℃3min，接著進行35個循環，條件為94℃30s、

55℃30s和72℃50s，最后72℃延伸10min。

D.3.4PCR產物的電泳檢測

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DB41/T987－2014

制備1.0%瓊脂糖凝膠板（C.1.2）。在電泳槽中加入1×TAE緩沖液。每個樣品取10μLPCR產物與

加樣緩沖液混合后，加入凝膠孔進行電泳。恒壓（120V～150V）下電泳20min～30min，經EB染色后，

將凝膠放到凝膠成像系統上觀察結果。

D.3.5試驗成立的條件

PCR產物經電泳檢測，陽性對照在預期大小（431bp）的位置出現特異性條帶，同時，陰性對照和

空白對照均沒有出現預期大小的目的條帶。

D.3.6結果判定

應用本標準的檢測方法對待檢樣品進行檢測，如果在431bp對應位置出現特異性條帶，則判定樣品

為SPCSV病毒陽性，否則判定樣品為該病毒陰性。

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DB41/T987－2014

目次

前言................................................................................II

1范圍..............................................................................1

2術語和定義........................................................................1

2.1脫毒組培苗....................................................................1

2.2擴繁苗........................................................................1

2.3脫毒種薯（苗）................................................................1

2.4原原種........................................................................1

2.5原種..........................................................................1

2.6大田用種......................................................................1

2.7允許帶毒率....................................................................2

2.8允許病毒顯癥率................................................................2

3檢測對象..........................................................................2

4抽樣..............................................................................2

4.1組培苗抽樣....................................................................2

4.2田間抽樣......................................................................2

5檢測方法..........................................................................2

5.1硝酸纖維素膜酶聯免疫吸附測定（NCM-ELISA）檢測法...............................2

5.2指示植物檢測法................................................................3

5.3聚合酶鏈式反應（PCR）檢測法...................................................3

5.4反轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）檢測法..........................................3

6脫毒種薯（苗）的檢測程序及質量要求................................................3

6.1脫毒組培苗....................................................................3

6.2原原種........................................................................3

6.3原種..........................................................................3

6.4大田用種......................................................................3

附錄A（規范性附錄）硝酸纖維素膜酶聯免疫吸附測定（NCM-ELISA）檢測法.................4

附錄B（規范性附錄）指示植物檢測法..................................................6

附錄C（規范性附錄）