發酵工程單元復習——優質醋酸菌的篩選與鑒定

酸度是評價食醋品質的關鍵指標之一。通常情況下，對于同一類型的食醋而言，等級越高，其對酸度的要求也越嚴格（等級越高，總酸含量也越高）。如何實現優質食醋的大規模生產呢？食醋食醋釀造工藝任務1：分析傳統釀醋酸度波動原因（1）傳統釀醋過程中，醋酸菌的可能來源有哪些？

主要來源于空氣中、生產工具、原料等。（2）傳統釀醋無法保證食醋的酸度，請從微生物的角度試著分析原因。

傳統釀醋利用天然醋酸菌進行發酵，不同菌株產酸能力差異較大。主糧粉碎蒸料降溫、糖化酒精發酵淋醋陳釀醋酸發酵熏醅任務2：設計優質醋酸菌的篩選方案

請結合選擇培養基與鑒定培養基的設計理念（如尿素培養基），以及醋酸菌的代謝類型（C2H5OH+O2→CH3COOH+H2O+能量），試著設計篩選醋酸菌的培養基。（尿素固體培養基：尿素、葡萄糖、NaCl、K2HPO4、酚紅、瓊脂糖）活動1：設計培養基活動要求（時間：2分鐘）：（1）以小組為單位，探討并寫出篩選醋酸菌的培養基配方；（2）分析所設計的培養基中，每個配方的作用；評價指標標準分值1、培養基滿足微生物生長所需的基本營養條件能夠滿足得1分

2、培養基含有相應物質用于鑒別是否為產酸菌能夠鑒別得1分

3、培養基可以有效篩選出醋酸菌能夠篩選得1分任務2：設計優質醋酸菌的篩選方案活動1：設計培養基

請結合評價量表，對所設計的培養基進行打分。

資料：醋酸菌的主要代謝途徑是將乙醇轉化為醋酸，這個過程需要有適當的環境條件。醋酸菌不僅需要乙醇作為底物，還需要其他碳源、氮源和其他營養物質，以確保醋酸菌能夠有效生長并表現出其代謝特性。因此，單純依靠乙醇作為唯一碳源是不夠的。結合上述資料及細菌培養基的配方，對培養基進行修改。任務2：設計優質醋酸菌的篩選方案活動1：設計培養基培養基培養基1號培養基2號配方乙醇酵母浸膏葡萄糖瓊脂碳酸鈣乙醇酵母浸膏葡萄糖瓊脂溴甲酚紫（酸堿指示劑）任務2：設計優質醋酸菌的篩選方案活動1：設計培養基酵母浸膏：酵母細胞的水溶性提取物濃縮而成的膏狀物質，主要作用是為微生物的生長補充氮源、生長因子，內含無機鹽。任務2：設計優質醋酸菌的篩選方案碳酸鈣—透明圈法溴甲酚紫—顯色圈法稱取醋醅→在液體LB培養基中進行富集培養→用無菌水將培養物進行稀釋→取1ml稀釋后的菌懸液進行涂布分離→恒溫培養箱中進行倒置培養→培養結束后，觀察透明圈大小→利用試管斜面進行菌株保存活動2：完善醋酸菌的篩選路線任務2：設計優質醋酸菌的篩選方案某研究團隊利用上述所設計的1號培養基，開始了優質醋酸菌的篩選，其流程如下：活動要求（3分鐘）：（1）以小組為單位，評判操作步驟是否正確，若正確，在表格相應位置中計1分，若錯誤，則不計分，并將總分打在“打分牌”上；（2）對操作錯誤的地方進行修改，并說明理由；操作步驟得分修改（1）稱取醋醅

（2）在液體LB培養基中進行富集培養

（3）用無菌水將培養物進行稀釋

（4）取1ml稀釋后的菌懸液進行涂布分離

（5）恒溫培養箱中進行倒置培養

（6）培養結束后，觀察透明圈大小

（7）利用試管斜面進行菌株保存活動2：完善醋酸菌的篩選路線任務2：設計優質醋酸菌的篩選方案活動2：完善醋酸菌的篩選路線任務2：設計優質醋酸菌的篩選方案稱取醋醅→在液體選擇培養基中進行富集培養→用無菌水將培養物進行稀釋→取0.1ml稀釋后的菌懸液進行涂布分離→恒溫培養箱中進行倒置培養→培養結束后，觀察透明圈與菌落直徑比值大小→利用試管斜面進行菌株保存菌株S5S10S11S12S27S30總酸度（g·L-1）46.2144.7043.1451.0849.4745.36酒精轉醋酸率（%）64.0861.9959.8270.8468.6062.90表1野生型優良菌株的生產性狀（1）上述篩選得到的菌株中，哪一株最適合應用于生產？（2）S12菌株為哪種醋酸菌？有哪些方法可以進行鑒定？任務2：設計優質醋酸菌的篩選方案任務3：設計醋酸菌的鑒定方案平板可以讓人們清楚地觀察到在培養基表面由單個細胞生長繁殖成的菌落，因此常用于微生物的分離、鑒定、活菌計數等。局限性：鑒定結果依賴于觀察者的經驗和技能；不同人可能對同一菌落的判斷不一致；鑒定方案：菌落鑒定法任務3：設計醋酸菌的鑒定方案鑒定方案：分子生物學法活動3：利用分子生物學方法進行菌株鑒定資料：16SrDNA普遍存在于原核生物中，該序列在生物進化的漫長歷程中保持不變，既含有高度保守的序列區域，又有中度保守和高度變化的序列區域。此外，16SrDNA相對分子量大小適中，約1540對核苷酸，便于序列分析。保守區域1保守區域2保守區域3保守區域416SrDNA注：藍色區域代表保守的核酸序列，其長度大小約為30bp。任務3：設計醋酸菌的鑒定方案活動要求（時間：3分鐘）：（1）上述4個保守區域，你們小組會優先選擇哪兩個區域用于引物的設計，請說明原因。（2）PCR擴增出S12菌株的16SDNA后，下一步該如何進行菌株鑒定？請對鑒定思路進行討論。活動3：利用分子生物學方法進行菌株鑒定任務3：設計醋酸菌的鑒定方案保守區域1保守區域2保守區域3保守區域416SrDNA注：藍色區域代表保守的核酸序列，其長度大小約為30bp。PCR產物可利用電泳技術來鑒定，該技術是分離、鑒定、純化核酸和蛋白質的常用方法（教材P107）。20001000750500250100MS12活動3：利用分子生物學方法進行菌株鑒定任務3：設計醋酸菌的鑒定方案電泳的方法，能否鑒定出菌株信息？為什么？大腸桿菌測序結果：AGTTTGATTCTGGCTCAGAGCGAACGCTGGCGGCATGCTTAACACATGCAAGTCGCACGAAGGTTTCGGCCTTAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTAGGTATCTATCCATGGGTGGGGGATAACACTGGGAAACTGGTGCTAATACCGCATGACACCTGAGGGTCAAAGGCGCAAGTCGCCTGTGGAGGAGCCTGCGTTTGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGATGATCAATAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTG……CCTTACCAGGGCTTGAATGTAGAGGCTGCAAGCAGAGATGTTTGTTTCCCGCAAGGGACCTCTAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATCTTTAGTTGCCATCAGGTTGGGCTGGGCACTCTAGAGAGACTGCCGGTGACAAGCCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGTCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGGTGAGAGTGGGAAGCTAGGTGGTGACACCATGGTGATCTCTAAAAGCCGTCTCAGTTCGGATTGCACTCTGCAACTCGAGTGCATGAAGGTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGTTTGACCTTAAGCCGGTGAGCGAACCGCAAGGACGCAGCGACCACGGTCGGGTCAGCGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAGGGGAACCTGCGGCTGGATCACCTCCTTT任務3：設計醋酸菌的鑒定方案任務3：設計醋酸菌的鑒定方案任務3：設計醋酸菌的鑒定方案基因數據庫任務3：設計醋酸菌的鑒定方案任務3：設計醋酸菌的鑒定方案S12菌株為巴氏醋酸菌（Acetobacterpasteurianus）菌株S5S10S11S12S27S30總酸（g/L）46.2144.7043.1451.0849.4745.36